明胶促进辣根过氧化物酶去除废水中苯酚的方法

技术领域

本发明涉及废水处理技术领域，尤其涉及一种明胶促进辣根过氧化物酶去除废水中苯酚的方法。

背景技术

苯酚作为重要的有机化工原料具有广泛的用途，例如可制取酚醛树脂、己内酰胺、双酚A、水杨酸、苦味酸、五氯酚、2,4-D、己二酸、酚酞n-乙酰乙氧基苯胺等化工产品及中间体等。然而在生产上述化工产品过程中会排放出含各种挥发和不挥发性酚为主的废水。此外，酚类物质广泛来源于煤化工、石油化工、印染等工业废水，已经成为水环境中最普遍的有机污染物之一。

苯酚作为一种原型质毒物，毒性较高，其在体内的毒性作用是与细胞原浆中蛋白质产生化学反应从而形成不溶性蛋白质，使细胞失去活力。而且酚还可进一步引起深部组织坏死、损伤，直至出现全身中毒现象。当水环境中的苯酚浓度超出一定范围时，还能使水体中的细菌分解者大量死亡，于是有机污染物无法处理，堆积造成生态污染。

去除苯酚污染的方法通常包括物理法、化学法和生物法。然而，物理法仅仅是污染物质的转移，并没有从根本上去除污染；化学法一般需要外加净化源，用量难以掌握且可能产生毒性更强的次级污染物；微生物法处理用时长，且培育菌种操作复杂。相比之下，酶法由于其绿色、高效、无毒副产物的特点走入大众的视野。

辣根过氧化物酶(HRP)是一种生物酶催化剂，其活性中心铁(III)卟啉结构可以在双氧水的存在下氧化降解酚类、双酚类、苯胺类、联苯胺类等相关杂芳香污染物。对比于其他功能相似的酶，HRP更稳定，催化活性更高，并且可以承受高盐度和高污染物浓度水体，因此特别适合净化工业废水。然而，游离酶易受到恶劣环境的影响，导致其使用效率下降或者失活，HRP处理能力降低。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种明胶促进辣根过氧化物酶去除废水中苯酚的方法，以辣根过氧化物酶(HRP)为催化剂，明胶作为添加剂，H

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种明胶促进辣根过氧化物酶去除废水中苯酚的方法，包括如下步骤：

取待处理的苯酚废水，加入明胶，搅拌均匀，用pH调节剂调整pH至5-6，再加入辣根过氧化物酶和5％双氧水溶液，搅拌反应0.5-2h。

进一步地，所述苯酚废水中苯酚的浓度是0.094-0.471mg/mL。

进一步地，所述苯酚废水中苯酚与明胶的质量比是(0.94-4.71)：(1-4)。

进一步地，所述苯酚废水中苯酚与明胶的质量比是(0.94-4.71)：2。

进一步地，所述苯酚废水中苯酚与辣根过氧化物酶的质量比是(0.94-4.71)：(0.005-0.025)。

进一步地，所述苯酚废水中苯酚与辣根过氧化物酶的质量比是(0.94-4.71)：0.01。

进一步地，所述苯酚废水中苯酚与5％双氧水溶液的质量比是(0.94-4.71)：(10-80)。

进一步地，所述苯酚废水中苯酚与5％双氧水溶液的质量比是(0.94-4.71)：20。

进一步地，所述pH调节剂由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠按照质量比2:1进行混合制成。

本发明的有益效果是：

1、本发明中HRP与明胶具有协同作用，明胶显著促进HRP的苯酚处理能力；

2、本发明在pH＝6，m(苯酚)：m(明胶)：m(HRP)：m(H

3、本发明是均相体系，1单位的HRP可以处理400单位以上苯酚；

4、本发明将苯酚聚合物大分子，可以过滤回收，达到变废为宝；

5、本技术方案原料价廉、易得，操作简单，效果显著，易于推广，实用性强。

附图说明

图1不同pH条件下的降解效果图片(pH＝4-8，反应后静置1天)；

图2不同物质在溶液中的粒径分布；

图3明胶和沉淀物的傅里叶红外图谱。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

0.5mg/mL辣根过氧化物酶(HRP)储备液配制：准确量取5mg辣根过氧化物酶(RZ：>2.0，冻干粉，活性：≥150units/mg)于20mL瓶中，加入10mL去离子水，超声5分钟，将制备好的0.5mg/mL的酶储备液放于冰箱4℃保存。后续提及的辣根过氧化物酶(HRP)储备液没有特别标注的都是从0.5mg/mL辣根过氧化物酶(HRP)储备液中量取。

5％双氧水溶液配制：准确量取10mL的30％双氧水溶液，加入56mL水在100mL塑料瓶中稀释成5％双氧水溶液(1.0g/mL)，将制备的5％双氧水溶液放于阴凉通风处备用。

5mg/mL明胶储备液配制：准确量取100mg食用明胶(市售100g，250冻力)于50mL离心管中，加入20mL自来水溶解明胶，40℃加热10分钟，超声10分钟，即可制备5mg/mL的明胶储备液。后续提及的明胶储备液没有特别标注的都是从5mg/mL明胶储备液中量取。

30mmol/L(2.82mg/mL)苯酚储备液配制：准确量取141mg的苯酚(Phenol,AR)，用自来水定容至50mL容量瓶，即得到30mmol/L(2.82mg/mL)的苯酚储备液。后续提及的苯酚储备液没有特别标注的都是从30mmol/L苯酚储备液中量取。

pH调节剂：磷酸氢二钠和磷酸二氢钠按照质量比2:1进行混合，制成pH调节剂。

本发明采用液相色谱法来测定苯酚的浓度。在反应过程中，苯酚会因为辣根过氧化物酶的催化作用发生聚合反应，生成难溶于水的聚酚，使用液相色谱检测过滤之后的反应液残留苯酚浓度。液相色谱条件：紫外检测器波长设置为280nm，流速设置为1mL/min，流动相比例为水：乙腈＝4：6。标准曲线绘制具体操作如下：将制备的30mmol/L的苯酚储备液经过逐级梯度稀释之后，可得到绘制标准曲线所需的苯酚标准溶液。本次实验苯酚标准曲线的浓度为1.0，2.0，3.0，4.0和5.0mmol/L，使用液相色谱在280nm处测定苯酚标准溶液的峰面积并绘制标准曲线，由拟合结果得出苯酚标准曲线的决定系数R2＝0.9965，后续实验将依据标准曲线计算苯酚的去除率。

具体操作如下：液相色谱条件：液相色谱紫外检测器波长设置为280nm，流速设置为1mL/min，流动相比例为水：乙腈＝4：6。反应前检测酚类物质初始浓度，反应后上清液过滤留样检测，由下式计算酚类物质去除率：

η＝(1-C/C

式中：η—酚类物质去除率(％)

C

C—酚类物质反应后液相色谱峰面积。

实施例1：反应时间对苯酚降解的影响

在50mL离心管中加入1.0mL的苯酚储备液，然后加入0.4mL明胶储备液，加入自来水至10mL，形成3mmol/L的苯酚溶液，用pH调节剂将苯酚溶液的pH值调节到6，加入20μL HRP储备液和20μL 5％双氧水溶液进行反应，测试不同反应时间的苯酚除去率。表1给出HRP/明胶和HRP体系下，不同反应时间其苯酚的去除率。

表1

从表1中可以看出，无论明胶存在与否，反应在30分钟内达到反应的峰值附近，根据HRP催化苯酚的反应机理，自由基反应迅速且剧烈，苯酚在HRP的催化下，在反应过程中发生的是无规自由基共聚，在短时间内即可生成黑色的聚酚。另外，表1中显示没有明胶存在时，苯酚的去除率为17％，而明胶存在时，HRP可以在30分钟内去除94％的苯酚，说明明胶的存在显著促进HRP对苯酚的催化反应。在30分钟之后，HRP/明胶体系的去除效率没有显著的变化，说明此时的底物残留浓度较低，反应已经处于平衡状态，故本发明中的反应时间为0.5-2小时；HRP体系的去除率保持稳定，并没有因为时间的增加去除率上升，而此时底物的残留浓度高，说明此条件下，单独的HRP仅能处理18％的苯酚。

实施例2：5％双氧水加入量对苯酚降解的影响

在50mL离心管中加入1.0mL的苯酚储备液，然后加入0.4mL明胶储备液，加入自来水至10mL，形成3mmol/L的苯酚溶液，用pH调节剂将苯酚溶液的pH值调节到6，加入20μL HRP储备液和加入不同体积的5％双氧水溶液搅拌反应2小时。表2给出HRP/明胶和HRP体系下，5％双氧水溶液用量分别是0μL、10μL、20μL、40μL、80μL、100μL和180μL其苯酚的去除率。

表2

从机理中可以了解到，双氧水会和HRP的催化中心铁卟啉中的铁形成复合物，复合物有连续催化苯酚的能力。从表2中可以看出，5％双氧水溶液用量在10-20μL的变化中可以看出，游离HRP和HRP/明胶体系的苯酚去除率随着双氧水的加入都在上升，说明此时双氧水的加入会促进苯酚的去除，另外，双氧水是氧化剂，属于消耗品，说明20μL的5％双氧水溶液用量能达到体系催化苯酚的峰值附近。在分别添加20-180μL的5％双氧水溶液，苯酚去除率开始逐渐下降，这可能是过量的双氧水引起的HRP失活。

对比表2中两个体系去除苯酚的变化，双氧水过量加入对HRP/明胶体系去除苯酚的影响较小，实验中20μL和180μL的5％双氧水溶液用量的去除率差值为8％，而HRP体系同样条件下去除率下降差值为13％。另外，相对于HRP体系对苯酚较低的去除效率，说明HRP/明胶体系比单独HRP体系对双氧水的稳定性更好。考虑到节约原料，本发明5％双氧水溶液用量的适用量为10-80μL，5％双氧水溶液用量的优选用量为20μL。

实施例3：明胶加入量对苯酚降解的影响

在50mL离心管中加入1.0mL的苯酚储备液，然后加入不同体积的明胶储备液，加入自来水至10mL，形成3mmol/L的苯酚溶液，用pH调节剂将苯酚溶液的pH值调节到6，加入20μLHRP储备液和20μL 5％双氧水溶液搅拌反应2小时。表3给出HRP/明胶体系下，明胶储备液用量分别是0μL、50μL、100μL、200μL、400μL、600μL、800μL，其苯酚的去除率。

表3

从表3中看出，不加明胶时苯酚的去除率只有18％，这时是单独HRP体系，在明胶储备液加入量从50-400μL变化时，苯酚去除率逐渐上升，从18％上升至98％，说明此时浓度的苯酚废水，使用400μL(2mg)明胶即可让HRP催化绝大部分的苯酚发生聚合。明胶储备液的加入量继续增加，在600μL和800μL的加入量，HRP去除苯酚率并未出现较大变化。说明稍过量的明胶不会严重影响HRP去除苯酚的效率。综合考虑经济效益和原料节约等因素，本发明中明胶的适用量为200-800μL，明胶的优选用量为400μL。

实施例4：pH对苯酚降解的影响

在50mL离心管中加入1.0mL的苯酚储备液，加入400μL的明胶储备液，加入自来水至10mL，形成3mmol/L的苯酚溶液，用pH调节剂将苯酚溶液的pH值，加入20μL HRP储备液和20μL 5％双氧水溶液搅拌反应2小时。表4给出HRP/明胶和HRP体系下，pH值分别是4、5、6、7、8，其苯酚的去除率。

表4

表4给出了pH＝4-8范围内单独HRP体系和HRP/明胶体系分别对苯酚降解的影响，这也是处理含酚废水通常采用的pH范围。HRP是由氨基酸组成的生物大分子，属于蛋白质，因此对环境中pH的变化会表现出差异。

从表4中可以看出，随着pH从4上升到8，单独HRP体系和HRP/明胶体系去除苯酚的效率并未表现出因为pH变化而产生明显的差异。说明HRP本身能较好适应pH的小范围变化。

反应后静置一天如图1所示，可以看出pH＝4，5和6的沉淀效果较好，并且上清液较清澈，从溶解的情况来看，由于pH的增加导致的苯酚和聚酚溶解性增加，因为共聚的产物由无规共聚的形式合成，有些聚酚产物可能保留着较多的酸性羟基，碱性环境有助于形成酚盐，增加了其在水中的溶解性。所以后续降解实验选择pH＝6的溶液环境。

实施例5：HRP加入量对苯酚降解的影响

在50mL离心管中加入1.0mL的苯酚储备液，加入400μL的明胶储备液，加入自来水至10mL，形成3mmol/L的苯酚溶液，用pH调节剂将苯酚溶液的pH值调节到6，加入不同体积的HRP储备液和20μL 5％双氧水溶液搅拌反应2小时。表5给出HRP/明胶和HRP体系下，HRP储备液分别是0μL、10μL、20μL、40μL、50μL、80μL和100μL时，其苯酚的去除率。

表5

从表5中可以看出，HRP/明胶体系因为对苯酚的较高去除率较高，在HRP加入量为20μL时已能处理当前浓度的绝大部分苯酚，剩余底物浓度较低，所以后续实验过量HRP的加入并未引起去除率较大变动。而HRP体系随着HRP加入量增加苯酚去除率虽然呈上升趋势，但去除率仍然较低，20μL的催化剂加入量，HRP体系仅有18％的去除率，远远低于HRP/明胶体系的去除效率，而100μL的催化剂加入量仍旧不能明显提高单独HRP去除苯酚的效率，这可能是因为HRP作为生物催化剂，在催化苯酚聚合反应过程中容易失活。

实施例6：HRP/明胶体系降解的苯酚浓度范围

在50mL离心管中加入不同体积的苯酚储备液，加入400μL的明胶储备液，加入自来水至10mL，分别形成1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L的苯酚溶液，用pH调节剂将苯酚溶液的pH值调节到6，加入20μL的HRP储备液和20μL 5％双氧水溶液搅拌反应2小时。表6给出HRP/明胶和HRP体系下，对于不同苯酚浓度其苯酚的去除率。

表6

表6给出了HRP和HRP/明胶体系分别对不同浓度的苯酚降解情况。酚类废水在实际生活中的低浓度和高浓度的处理方式不同，一般较低浓度时选用的是直接处理，而高浓度酚类废水可以选择浓缩之后对酚类进行回收利用，剩余低浓度的苯酚再进行处理，此次实验选取的苯酚浓度范围为低浓度酚类的大部分区域。经过前期实验的研究，确定了降解苯酚的最优反应条件，以此为基础分别研究HRP和HRP/明胶体系对不同浓度苯酚的去除效率。

从表6中可以看出，在苯酚浓度为1-mmol/L的浓度范围内，HRP/明胶体系对苯酚的去除率差异不大，去除率在95％左右浮动；当苯酚浓度升高至4mmol/L时，其去除率开始缓慢下降，当继续升高至10mmol/L时，苯酚去除率降至77％。而在不添加明胶的情况下，单独HRP体系随着苯酚浓度的增加苯酚去除率也呈逐渐下降趋势，但对于5mmol/L的苯酚浓度，其去除率仅有10％。对比看出，明胶的加入对苯酚去除率的提升较为明显，HRP/明胶体系优势突出。

图2给出了不同物质在溶液中的粒径分布。从图2中可以看出，苯酚和明胶在水溶液中都有两个强度-粒径峰型，表明两者的水溶液中都存在相应的聚集体。在苯酚溶液加入明胶之后，溶液中粒径偏小的强度-粒径峰型变化不大，但溶液中粒径偏大的强度-粒径峰型的粒径分布向大粒径方向发生偏移，粒径大小和强度增加。与紫外可见吸收光谱检测推测的结论一致，即明胶的加入会使得溶液中的苯酚富集在明胶周围。这种富集作用体现在紫外可见吸收光谱中，是苯酚浓度的升高；体现在粒径分布方面是造成溶液中物质团聚的粒径增加。

图3给出了明胶和沉淀物质的傅里叶红外图谱。在去除苯酚的过程中，辣根过氧化物酶使苯酚发生聚合反应生成不溶于水的聚酚，从而达到去除苯酚的目的。从图3中可以看出，明胶在酰胺带的特征伸缩振动1634cm

以上可以看出，在pH＝6，m(苯酚)：m(明胶)：m(HRP)：m(H

根据上述说明书的揭示，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。