一种Oligo-dT亲和层析填料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物化工领域中层析填料制备技术领域，具体涉及一种以Oligo-dT为配基的亲和层析填料及其制备方法。

技术背景

寡聚脱氧胸苷酸(Oligo-dT)为配基的亲和层析填料，广泛应用于mRNA纯化生产过程，信使RNA(mRNA)广泛应用于cDNA文库构建、基因治疗、传染病以及疫苗治疗。在mRNA生产时需要使用色谱纯化方法去除体外转录(IVT)过程产生的杂质。mRNA及其构建的药物通常包含3′-聚腺苷尾部(polyA)，这种结构能与固体载体上的的寡聚脱氧胸苷探针特异性结合从而达到亲和纯化的效果。

目前生产亲和层析填料的方式一般是需要将Oligo-dT的5’端进行功能化修饰后，才能通过linker偶联到固体载体上。这种对寡核苷酸功能化修饰的方法步骤繁琐，价格昂贵，从而增加Oligo-dT亲和层析填料的生产成本。除此之外，市场上鲜有满足大规模生产需要的Oligo-dT亲和层析填料，所以如何获取大量mRNA仍然是一个挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种以Oligo-dT为配基的亲和层析填料及其制备方法，不仅具有很高的目标物载量，并且成本低廉、操作方便。

本发明的Oligo-dT亲和层析填料是由乙烯基砜化的微球和Oligo-dT制备而成，其中Oligo-dT的5’端和3’端不需要预修饰。所述的制备方法包括如下步骤：

1)在pH为5-10的含盐的偶联缓冲液中，将5’端和3’端未进行预修饰的Oligo-dT与乙烯基砜功能化的微球在15-40℃下震荡反应3-24h，得到Oligo-dT功能化的微球；

2)在封闭缓冲溶液中，用封闭试剂对步骤1)得到的Oligo-dT功能化的微球在15-40℃处理6-24h，将多余的乙烯基砜用封闭试剂封闭，得到Oligo-dT亲和层析填料。

基于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤1)所述的乙烯基砜化微球的制备方法为：以有机碱为催化剂，将双(乙烯基磺酰)甲烷、有机碱、彻底除水后的微球置入有机溶剂中，在10-60℃下震荡反应3-24h所得。

基于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的微球为表面含有多羟基或多氨基结构的亲水性微球。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的亲水性微球为琼脂糖微球，或表面修饰有羟基或氨基的聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯-二乙烯基苯微球、硅球或磁性微球(例如铁磁性微球)。

基于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述微球的直径为1-100um。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的有机碱选自：三苯基膦、三环己基膦、三异丙基膦、三甲苯基膦、三对甲苯基膦、甲基咪唑。

对于上文所述的技术方案中，所述的有机溶剂为非质子溶剂，优选为二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺或乙腈。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的双(乙烯基磺酰)甲烷与有机碱的摩尔比为10-1000∶1，优选为10-200∶1，更优选为10-80∶1；所述的双(乙烯基磺酰)甲烷与除水后的微球的质量比为1∶1-1000，优选为1-100∶1，更优选为1-50∶1。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的双(乙烯基磺酰)甲烷在有机溶剂中的浓度为50-100mM。

对于上文所述的技术方案中，所述的5’端和3’端未进行预修饰的Oligo-dT结构如下：

5’-R-Oligo-dT-3’，

其中R为间隔臂，Oligo-dT为亲和配基；

所述的间隔臂为5-20个脱氧核糖核苷酸，且5’端不需要修饰；所述的Oligo-dT为具有10-40个碱基的多聚脱氧胸腺嘧啶，优选15-30个碱基。例如Oligo-dT为5’-G

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤1)所述的5’端和3’端未进行预修饰的Oligo-dT与乙烯基砜功能化的微球中乙烯基砜的摩尔比为1∶100-100000，优选为1∶1000-100000，更优选为1∶5000-50000。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤1)所述的5’端和3’端未进行预修饰的Oligo-dT在含盐缓冲盐溶液中的浓度为0.1-100uM，优选为1-50uM。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤1)所述的含盐的偶联缓冲液中的盐为硫酸钠、氯化钠、草酸钠、醋酸钠、硫酸铵、柠檬酸钠中的一种或多种，含盐的偶联缓冲液中盐的浓度为0.0i-2.5M，优选0.0i-1.5M。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤1)所述的pH为6-9。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤1)所述的含盐的偶联缓冲液中的偶联缓冲液为磷酸盐缓冲液。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的封闭试剂为还原型谷胱甘肽、天然氨基酸、2-巯基乙醇、乙醇胺、牛血清蛋白、酪蛋白中的一种或多种，所述的天然氨基酸为L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸中的一种或几种。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的封闭缓冲液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的封闭缓冲液的pH值为5-10。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的封闭试剂与Oligo-dT功能化的微球中乙烯基砜的摩尔比为1-10∶1。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的封闭试剂在封闭缓冲液中的浓度为10-1000mM，优选为10-200mM。

基于上文所述的技术方案中，优选的情况下，还包括：3)在含盐的杂交缓冲液中，将步骤2)得到的Oligo-dT的亲和层析填料与poly A于15-40℃杂交0.5-30min。

基于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤3)所述的含盐的杂交缓冲液中盐的浓度为0.1-1M，优选0.25-1M。

基于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤3)所述的含盐的杂交缓冲液中的杂交缓冲液为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液的pH值为7-7.4。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤3)所述的Oligo-dT的亲和层析填料与poly A的摩尔比为1-20∶1，优选为1-10∶1，更优选为1-5∶1。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，步骤3)所述的poly A在含盐的杂交缓冲液中的浓度为0.1-100uM，优选为1-50uM。

本发明还涉及保护上述方法制备的Oligo-dT亲和层析填料。

有益效果：

本发明所述的Oligo-dT亲和层析填料的制备方法，相对于其它方法有以下优势：

(1)目标物载量高，亲水性微球与双(乙烯基磺酰)甲烷的反应能提供大量的乙烯基砜活性位点用于Oligo-dT的偶联，提高了微球表面Oligo-dT的密度；

反应步骤更简单、反应收率高、合成成本更低，乙烯基砜功能化的微球可以直接(2)与5’端和3’端未修饰的Oligo-dT反应，免去了Oligo-dT功能化修饰步骤，从而降低了Oligo-dT亲和层析填料的生产成本。

综上，所制备的Oligo-dT亲和层析填料具有很高的Oligo-dT密度，制备方法简单，偶联效率高，并且不需要对Oligo-dT的5’端和3’端进行预修饰，从而降低了生产成本。

附图说明

图1：琼脂糖6FF与BVS的反应式；

图2：6FF-BVS与封闭试剂的反应式；

图3：6FF-BVS与Oligo-dT的反应式；

图4：SiO

图5：琼脂糖6FF与BVS反应不同时间的红外光谱图；

图6：琼脂糖6FF与BVS反应不同时间后的乙烯基砜密度；

图7：氨基硅球与BVS反应后的红外光谱图；

图8：不同封闭试剂修饰亲和层析填料与polyA杂交；

图9：不同pH条件下修饰的亲和层析填料与poly A杂交；

图10：不同结构的Oligo-dT亲和层析填料；

图11：不同密度6FF-BVS制备的Oligo-dT亲和层析填料poly A杂交；

图12：不同长度T的Oligo-dT亲和层析填料poly A杂交；

图13：不同盐浓度杂交缓冲液对Oligo-dT亲和层析填料载量的影响。

具体实施方式

本发明的Oligo-dT亲和层析填料是由乙烯基砜化的微球和Oligo-dT制备而成，其中Oligo-dT的5’端和3’端不需要进行预修饰。所述的制备方法包括如下步骤：

1)在pH为5-10的含盐的偶联缓冲液中，将5’端和3’端未进行预修饰的Oligo-dT与乙烯基砜功能化的微球在15-40℃下震荡反应3-24h，得到Oligo-dT功能化的微球；其中，所述的乙烯基砜化微球的制备方法为：以有机碱为催化剂，将双(乙烯基磺酰)甲烷、有机碱、彻底除水后的直径为微球置入有机溶剂中，在10-60℃下震荡反应3-24h所得；

2)在封闭缓冲溶液中，用封闭试剂对步骤1)得到的Oligo-dT功能化的微球在15-40℃处理6-24h，将多余的乙烯基砜用封闭试剂封闭，得到Oligo-dT亲和层析填料；所述的封闭试剂为还原型谷胱甘肽、天然氨基酸、2-巯基乙醇、乙醇胺、牛血清蛋白、酪蛋白中的一种或多种，所述的天然氨基酸为L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸中的一种或几种。

以下具体实施例的是对本发明的内容作进一步说明，不应理解为对本发明任何形式的限定。

实施例1

取0.3g琼脂糖微球(Bastarose 6FF：博格隆生物科技有限公司的高度交联的6％琼脂糖，平均粒径为90um)，抽滤并用乙腈洗涤去除水分，加入2ml双(乙烯基磺酰)甲烷(BVS)浓度为50mM的乙腈溶液，随后加入2ml甲基咪唑浓度为2mM的乙腈溶液，于25℃下分别振荡反应1、3、8、24h，反应结束后用乙腈清洗，得到乙烯基功能化琼脂糖微球6FF-BVS(修饰时间分别为1、3、8、24h，见图1)。最后通过红外光谱仪进行表征(见图5)，与BVS反应3-24h后得到的琼脂糖微球6FF-BVS红外谱图中～1130cm

称取0.1g乙烯基砜功能化的琼脂糖微球，加入30ml半胱氨酸浓度为100mM的磷酸缓冲液(100mM，pH＝7.4)，25℃条件下反应12h，使半胱氨酸与表面的乙烯基砜基团充分反应，采用ellman’s法测定反应前后溶液中半胱氨酸变化值从而得到琼脂糖微球表面乙烯基砜密度(见图2)，表面VS密度最高可达到100mmol/g(见图6)，证明这种修饰方法可以提高大量的乙烯基砜活性位点供后续偶联Oligo-dT。

实施例2

氨基硅球的制备方法为：将5mL二氧化硅微球(10um，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)超声分散于100mL乙醇(95％)，滴加1M硝酸至pH＝4.0，40℃反应30min后降至室温，加入1mL APTES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)，室温反应24h(见图4)。所得的APTES修饰的二氧化硅微球(SiO

取0.1g上述制备的APTES修饰的二氧化硅微球(SiO

实施例3

取20mg实施例1制备的修饰时间为24h的乙烯基功能化琼脂糖微球6FF-BVS在氯化钠浓度为0.15M的偶联缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝6)中平衡15min，抽干后在6FF-BVS中加入1ml Oligo-dT(5’-G

分别将还原型谷胱甘肽(GSH，百灵威)、L-半胱氨酸(Cys，百灵威)、2-巯基乙醇(BME，百灵威)、L-甘氨酸(Gly，百灵威)、L-精氨酸(Arg，百灵威)、L-赖氨酸(Lys，百灵威)加入到缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝7)中，分别配置为浓度为80mM的封闭试剂溶液，取50ml封闭试剂溶液加至6FF-BVS-OdT中，在25℃下反应8h，使封闭试剂与表面剩余的乙烯基砜基团充分反应，依次分别得到封闭好的Oligo-dT亲和层析填料，分别记作6FF-BVS-OdI-GSH、6FF-BVS-OdI-Cys、6FF-BVS-OdI-BME、6FF-BVS-OdI-Gly、6FF-BVS-OdT-Arg、6FF-BVS-OdT-Lys。

将上述封闭好的Oligo-dT亲和层析填料6FF-BVS-OdT-GSH、6FF-BVS-OdT-Cys、6FF-BVS-OdT-BME、6FF-BVS-OdT-Gly、6FF-BVS-OdT-Arg、6FF-BVS-OdT-Lys分别在杂交缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝7，0.25M NaCl)中平衡15min，离心，然后在25℃下加入含有7nmol poly A(5’-A

对比例1

取6FF、6FF-BVS、6FF-BVS-GSH、6FF-OdT-Cys、6FF-BVS-BME、6FF-BVS-Gly、6FF-BVS-OdT-Arg、6FF-BVS-OdT-Lys分别在杂交缓冲液(0.25MNaCl)中平衡15min，离心，然后在25℃下加入含有7nmolpolyA(5’-A

实施例4

取20mg实施例1制备的修饰时间为24h的乙烯基功能化琼脂糖微球6FF-BVS分别在pH＝6、7、7.4、8的醋酸钠浓度为0.15M的偶联缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM)中平衡15min，抽干后在6FF-BVS中分别加入1mlOligo-dT(5’-G

将还原型谷胱甘肽(GSH)加入到HEPES缓冲液(100mM，pH＝7)中，配置为浓度为80mM封闭试剂溶液，取50ml封闭试剂溶液加至6FF-BVS-OdT中，在25℃下反应8h，使还原型谷胱甘肽与表面剩余的乙烯基砜基团充分反应，得到封闭好的Oligo-dT亲和层析填料6FF-BVS-OdT-GSH。

将上述封闭好的Oligo-dT亲和层析填料6FF-BVS-OdT-GSH在杂交缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝7，0.25M NaCl)中平衡15min，离心，然后在25℃下加入含有7nmolpolyA(5’-A

实施例5

取20mg实施例1制备的修饰时间为24h的乙烯基功能化琼脂糖微球6FF-BVS在草酸钠浓度为0.15M的偶联缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝6)中平衡15min，抽干后在6FF-BVS中分别加入1ml含有不同结构的Oligo-dT(分别为5’-G

实施例6

分别将20mg实施例1制备的修饰时间不同的乙烯基功能化琼脂糖微球6FF-BVS(修饰时间分别3h、8h、24h)在柠檬酸钠浓度为0.15M的偶联缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝6)中平衡15min，抽干后在6FF-BVS中加入1ml Oligo-dT(5’-G

将牛血清蛋白(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)加入到缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝7)中，配置为浓度为80mM的封闭试剂溶液，取50ml封闭试剂溶液加至6FF-BVS-OdT中，在25℃下反应8h，使牛血清蛋白与表面剩余的乙烯基砜基团充分反应，反应结束后用水清洗三遍得到封闭好的Oligo-dT亲和层析填料。

将上述封闭好的Oligo-dT亲和层析填料在杂交缓冲液(柠檬酸盐缓冲液，100mM，pH＝7，0.25M NaCl)中平衡15min，离心，然后在25℃下加入含有7nmol polyA(5’-A

实施例7

取20mg实施例1制备的修饰时间为24h的乙烯基功能化琼脂糖微球6FF-BVS在硫酸铵浓度为0.15M的偶联缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝6)中平衡15min，抽干后在6FF-BVS中分别加入1ml含有不同T长度的Oligo-dT(分别为5’-G

将L-半胱氨酸加入到缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝7)中，配置为浓度为80mM的封闭试剂溶液，取50ml封闭试剂溶液加至6FF-BVS-OdT中，在25℃下反应8h，与表面剩余的乙烯基砜基团充分反应，反应结束后用水清洗三遍得到封闭好的Oligo-dT亲和层析填料。

将上述封闭好的Oligo-dT亲和层析填料在杂交缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝7，0.25M NaCl)中平衡15min，离心，然后在25℃下加入含有7nmolpoly A(5’-A

实施例8

取20mg实施例1制备的修饰时间为24h的乙烯基功能化琼脂糖微球6FF-BVS在氯化钠浓度为0.15M的偶联缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝6)中平衡15min，抽干后在6FF-BVS中加入1ml Oligo-dT(5’-G

将乙醇胺加入到缓冲液(磷酸盐缓冲液，100mM，pH＝7)中，配置为浓度为80mM的封闭试剂溶液，取50ml封闭试剂溶液加至6FF-BVS-OdT中，在25℃下反应8h，使乙醇胺与表面剩余的乙烯基砜基团充分反应，反应结束后用水清洗三遍得到封闭好的Oligo-dT亲和层析填料。

将上述封闭好的Oligo-dT亲和层析填料在NaCl浓度分别为0M、0.25M、0.5M、0.75M、1M的杂交缓冲液(碳酸盐缓冲液，100mM，pH＝7)中平衡15min，离心，然后在25℃下加入含有7nmolpolyA(5’-A