矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物在制备治疗/预防雄激素性脱发的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药领域，尤其涉及矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物在制备治疗/预防雄激素性脱发的产品中的应用。

背景技术

雄激素性脱发(AGA)是最常见的脱发原因之一。根据美国国立卫生研究院2018年的一项研究数据，美国约有5000万男性和3000万女性患有AGA。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside，C3G)作为广泛分布于植物水果中的水溶性花色苷，具有很强的抗氧化活性。羧基吡喃矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(VitisinA)是酵母代谢过程中产生的C3G和丙酮酸反应衍生出的最典型的吡喃花色苷，具有更强的结构稳定性和生物活性。且花色苷对于雄激素受体表达具有抑制作用。目前研究中没有报道关于C3G及VitisinA对二氢睾酮诱导雄激素性脱发的改善作用，对于其保护机理也尚不清楚。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物在制备治疗/预防雄激素性脱发的产品中的应用。本发明发现，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside，C3G)或羧基吡喃矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(VitisinA)可缓解二氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)暴露引起的雄激素性脱发。C3G或VitisinA干预可通过抑制人真皮毛囊乳头细胞的凋亡，调控人真皮毛囊乳头细胞转录生长因子β1和成纤维细胞生长因子7的分泌，以及调控Wnt/β-catenin通路改善雄激素性脱发。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物在制备治疗和/或预防雄激素性脱发的产品中的应用。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述雄激素性脱发由二氢睾酮引起的。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述衍生物包括：羧基吡喃矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷由植物皮中提取获得；所述植物包括：黑豆、黑枸杞和/或葡萄中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述羧基吡喃矢车菊素-3-O-葡萄糖苷由所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷与丙酮酸反应、纯化获得。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物抑制人真皮毛囊乳头细胞的凋亡。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物促进成纤维细胞生长因子7的分泌。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物抑制转录生长因子β1的分泌。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物激活Wnt/β-catenin通路。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物缓解真皮毛囊乳头细胞的凋亡和/或毛囊总数的减少。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物缓解毛囊微小化加重。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述毛囊微小化加重包括：终毛毛囊减少和/或毳毛毛囊增加。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物降低血清DHT和/或血清睾酮的水平。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物的使用剂量为0.15mg/kg.bw～10mg/kg.bw。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物的人体使用剂量为8.1mg/kg.bw(小鼠剂量为100mg/kg.bw)。

本发明提供了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物在制备治疗和/或预防雄激素性脱发的产品中的应用。

本发明选择天然产物来源的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside，C3G)以及其衍生物羧基吡喃矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(VitisinA)作为雄激素性脱发的干预物，其相较于市场上现存的阳性药物米诺地尔和非那雄安具有来源广泛，绿色安全且作用条件温和的特点，大大降低了雄激素性脱发治疗药物的副作用。细胞模型显示C3G和VitisinA均可显著降低人真皮毛囊乳头细胞凋亡率，并减少转录生长因子β1的分泌和增加成纤维细胞生长因子7的分泌，动物模型显示，涂抹含有C3G或者VitisinA乳霜的小鼠较涂抹普通乳霜去干预雄激素性脱发的小鼠毛发生长更快，毛囊微小化得到改善，毛囊增殖率更高，毛囊凋亡比例更低。且细胞动物的Western blot结果均显示C3G和Vitisin A改善雄激素性脱发通过调控Wnt/β-catenin通路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示C3G及Vitisin A对DHT处理的HDPCs的细胞活力的影响；

图2示C3G及VitisinA对DHT处理的HDPCs的细胞凋亡的影响；其中：上图为流式凋亡结果；下图为对应统计结果；

图3示C3G及Vitisin A对DHT处理的HDPCs分泌的生长因子的影响；其中：左示FGF7，右示TGFβ1；

图4示C3G及VitisinA对DHT处理的HDPCs Wnt/β-catenin通路的影响；其中：上示对应Westernblot条带灰度统计结果；下示Westernblot条带图片；

图5示C3G及Vitisin A对DHT处理的小鼠毛发生长情况的影响；其中：上示小鼠背部毛发大体照片；下示小鼠背部毛发重量；

图6示C3G及Vitisin A对DHT处理的小鼠血清雄激素的影响；其中：左示小鼠血清DHT水平；右示小鼠血清睾酮水平；

图7示C3G及Vitisin A对DHT处理的小鼠毛囊组织学的影响；其中：a示小鼠皮肤纵切横切HE染色结果；b示横切HE染色结果下毛囊总数统计结果；c示终毛毛囊及毳毛毛囊数目结果；

图8示C3G及Vitisin A对DHT处理的小鼠皮肤Wnt/β-catenin通路的影响；其中：a示Wnt10b Westernblot条带灰度统计结果；b示Wnt10b Westernblot条带图；c示β-cateninWesternblot条带灰度统计结果；d示β-catenin Westernblot条带图；

图9示C3G及Vitisin A对DHT处理的小鼠毛囊增殖情况的影响；其中：a示小鼠皮肤纵切片Ki67染色结果；b示对应Ki67染色区域占比；

图10示C3G及Vitisin A对DHT处理的小鼠毛囊凋亡情况的影响；其中：a示小鼠皮肤纵切片TUNEL染色；b示对应TUNEL染色阳性细胞统计结果；

图11示VitisinA液相图谱；其中：A示280nm；B示520nm；

图12示C3G液相图谱；其中：A示280nm；B示520nm。

具体实施方式

本发明公开了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物在制备治疗/预防雄激素性脱发的产品中的应用。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。

本发明的第一个目的是提供矢车菊素-3-O-葡萄糖及羧基吡喃矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备治疗/或预防二氢睾酮引发的雄激素性脱发的药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供矢车菊素-3-O-葡萄糖及羧基吡喃矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备治疗/或预防二氢睾酮引发毛囊数目减少，毛囊微小化加重，毛囊休止期延长，毛囊凋亡加剧，毛囊增殖受到抑制的药物中的应用。

本发明采用细胞+动物实验，采用一定剂量的矢车菊素-3-O-葡萄糖及羧基吡喃矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对二氢睾酮暴露引起的雄激素性脱发的调控作用进行了研究，本发明发现，与二氢睾酮造模组相比，采用C3G或者VitisinA干预的人真皮毛囊乳头细胞凋亡率均显著降低，其转录生长因子β1分泌减少和成纤维细胞生长因子7分泌增加。涂抹含有C3G或者VitisinA乳霜的小鼠较涂抹普通乳霜的小鼠毛发生长更快，毛囊微小化得到改善，毛囊增殖率更高，毛囊凋亡比例更低。

因此本发明要求保护以下内容：

矢车菊素-3-O-葡萄糖及羧基吡喃矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备治疗/或预防二氢睾酮引发的雄激素性脱发的药物中的应用。

优选地，所述雄激素性脱发表现为真皮毛囊乳头细胞凋亡增加，真皮毛囊乳头细胞生长因子分泌改变，毛囊数目减少，毛囊微小化加重，毛囊休止期延长，毛囊凋亡加剧，毛囊增殖率下降。

优选地，人体使用剂量0.15mg/kg.bw～10mg/kg.bw。

本发明实施例1和实施例2中，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)来自黑豆皮及桑葚资源等提取纯化而来，具体方法参考文献黑豆皮花色苷的中压液相色谱制备及结构鉴定，液相色谱图如图11所示，280nm下纯度为94.8％，而羧基吡喃矢车菊素-3-O-葡萄糖苷则是通过C3G与丙酮酸反应并纯化得到，具体方法参考文献Cholesterol-Lowering Activity ofVitisin A Is Mediated by Inhibiting Cholesterol Biosynthesis and EnhancingLDL Uptake in HepG2 Cells，液相色谱图如图12所示，280nm下纯度为98％。

所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1C3G及Vitisin A对DHT引起的人真皮毛囊乳头细胞凋亡的抑制作用

永生化人毛囊乳头细胞(HDPCs)，购于浙江美森细胞科技有限公司。在含10％胎牛血清(V/V)和1％青霉素-链霉素(V/V)的DMEM高糖培养基中培养。细胞在37℃、5％CO

将DHT溶解于DMSO配置成100mM的母液，用培养基稀释1000倍得到100μM DHT，用于培养HDPCs作为造模组。干预组在加入100μM DHT的同时加入100μM的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside，C3G)或者100μM的羧基吡喃矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(VitisinA)。对照组用未加药的普通培养基处理。培养24h后CCK-8法测定细胞活力。

按照上述分组处理，培养24h后取上清测定转录生长因子β1(TGFβ1)和成纤维细胞生长因子7(FGF7)。

按照上述分组处理，培养24h后分别提取各组细胞的蛋白，用Western Blot法进行蛋白定量以测定Wnt10b(Abmart)以及β-Catenin(ABclonal)的蛋白表达情况。

按照上述分组处理，再增加一组在加入100μM DHT的同时加入100μM的米诺地尔作为阳性对照组。培养24h后AnnexinV-FITC法测定细胞凋亡。

数据为平均值±SEM。*表示与对照组相比，差异有统计学意义(p<0.05)。#表示与DHT模型组比较差异有统计学意义(p<0.05)。

实验结果如图1～图4和表1～表6所示。

表1

表1对应图1的数据；

表2

表2对应图2柱状图的数据；

表3

表3对应图3中FGF7的数据；

表4

表4对应图3中TGFβ1的数据；

表5

表5对应图4中Wnt10b的数据；

表6

表6对应图4中β-catenin的数据；

实验结果显示C3G与Vitisin A均逆转了由DHT引起的HDPCs的细胞活力下降，抑制了DHT对HDPCs凋亡的诱导效应,并增加了促进毛发生长的有益因子FGF7的分泌且降低了不利于毛发生长的因子TGFβ1的分泌。而且激活了Wnt/β-catenin通路。因此，在细胞水平上，C3G与Vitisin A均有利于缓解DHT引起的雄激素脱发。

实施例2 C3G及Vitisin A对DHT引起的雄激素脱发小鼠模型的缓解效果

1、实验动物

C57BL/6J雄性小鼠，6周龄80只，购于浙江维通利华实验动物科技有限公司。实验动物在暨南大学动物房饲养，光照昼夜12小时交替。温度保持在22-26℃，相对湿度为60％-80％，自由摄食。

2、乳霜配方

3.动物分组处理

对照组(CON)腹腔注射等量玉米油(2％DMSO)，其余各组腹腔注射含40mg/kg·bw二氢睾酮(DHT)的玉米油(DHT溶于2％DMSO中，每周4次)。两模型组分别灌胃生理盐水0.2mL(NS IG)或乳膏2mL涂抹(CrAP)。涂抹干预组给予含1.25mg/mL C3G(C3G AP)或VitisinA(VAAP)的乳膏2mL覆盖小鼠背部皮肤，灌胃干预组给予100mg/kg·bw溶解于生理盐水的C3G(C3G IG)或Vitisin A(VA IG)。阳性对照组每日涂抹5％米诺地尔酊剂0.5mL。

第0天，对小鼠背部2cm×3cm区域进行剃除和脱毛处理。40mg/kg·bw戊巴比妥钠麻醉小鼠后，分别于第0、6、14、21天拍摄小鼠背部毛发。最后，在禁食12h后第21天处死小鼠，收集小鼠血浆、皮肤和新生毛发用于后续分析。血浆分离得到血清后用于分析其中的睾酮和DHT水平。皮肤一部分冻存于-80℃用于提取蛋白质，一部分用4％多聚甲醛固定进行组织切片，做HE染色用于统计毛囊总数以及判断终毛毳毛数量以及毛囊状态，做Ki67免疫组化染色以及TUNEL染色分别用于判断毛囊增殖和凋亡状况。新生毛发则用于称重以评估毛发生长情况。

数据为平均值±SEM。不同字母之间具有统计学差异(p<0.05)。

实验结果如图5～图10和表7～表15所示。

表7

表7对应图5的数据；

表8

表8对应图6中DHT的数据；

表9

表9对应图6中Testosterone的数据；

表10

表10对应图7b的数据；

表11

表11对应图7c的数据；

表12

表12对应图8a的数据；

表13

表13对应图8c的数据；

表14

表14对应图9b的数据；

表15

表15对应图10b的数据；

实验结果显示：与模型组相比，灌胃C3G或Vitisin A对雄激素脱发的改善效果不明显，而涂抹等剂量的C3G或VitisinA乳霜有效的缓解了由注射DHT引起的毛发生长的抑制，毛囊总数减少，毛囊由终毛向毳毛的转化、毛囊增殖的抑制以及毛囊凋亡的增加等现象。而且蛋白定量结果也表明涂抹C3G或Vitisin A乳霜均能有效逆转DHT对Wnt/β-Catenin通路的抑制作用。并且C3G还能有效调控由DHT注射引起的雄激素紊乱，表现在灌胃C3G或者涂抹C3G均有效降低了由注射DHT引起的血清DHT和血清睾酮的升高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。