一种基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS平台快速鉴定“丹参-山楂”药对中化学成分的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体属于一种基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS平台快速鉴定“丹参-山楂”药对中化学成分的方法。

背景技术

丹参-山楂药对源于《施今墨对药》，由丹参、山楂二味中药配伍而成，是祖国传统医学活血化瘀理论治疗冠心病的临床经典验方。方中丹参味苦微寒，能通行血中之滞，祛瘀而生新；山楂酸甘微温，功善破气散瘀，化浊降脂；二药相须配伍，行气活血、祛瘀止痛之力益彰，为治疗胸痹心痛之心血瘀阻证的经典组合。然而，丹参-山楂药对发挥药效作用物质基础尚不明确，限制了其相关制剂在临床的科学应用、市场占有率以及在国际上的推广。

超高效液相色谱(UHPLC)与Orbitrap超高分辨率质谱联用具有高效、准确、灵敏的优点，本发明采用超高效液相Q-Exactive Orbitrap超高分辨率质谱联用技术，对丹参-山楂药对的化学物质进行系统性快速分析研究，可为该药对及相关制剂的药效物质基础、质量控制、基准物质研究等提供参考数据，也为中药药对化合物的快速鉴定提供方法参考。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS平台快速鉴定“丹参-山楂”药对中化学成分的方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS平台快速鉴定“丹参-山楂”药对中化学成分的方法，包括以下步骤：

S1.制备丹参-山楂药对样品

取丹参和山楂药材置烘箱中烘干；等量称取干燥的丹参和山楂药材，粉碎，过40目筛；等量称取丹参和山楂药粉，加入8倍量质量分数70％的乙醇，回流提取2次，每次60min，合并两次滤液，回收乙醇，浓缩至稠膏，置于冷冻干燥机中干燥，收集干粉；

称取干粉，加入提取液，涡旋、匀浆，冰水浴超声后静置，然后离心，取上清液经微孔滤膜过滤，-80℃储存；

S2.质谱鉴定；

S3.质谱分析

谱数据通过软件处理分析，对于有对照品的化合物，与对照品图谱中各已知成分的相对保留时间、准分子离子等比对，再依据各对照品二级碎片离子信息进一步确认；对于无对照品的化合物，初步进行推测，再结合文献报道、数据库中相同或类似成分的MS2碎片离子进行对比分析，保证对无对照品成分的准确鉴定。

更为具体的，S1中提取液由甲醇和水按4：1的质量比组成，提取液的内标浓度为10μg/mL。

更为具体的，离心条件为：12000rpm，离心力：13800×g，半径8.6cm；微孔过滤膜的孔径为0.22μm。

更为具体的，S2中，色谱柱：Waters的UPLC BEH C18色谱柱；流动相：0.1％甲酸水溶液A，乙腈溶液B，梯度洗脱条件：0-3.5min，95-85％A；3.5-6min，85-70％A；6-6.5min，70-70％A；6.5-12min，70-30％A；12-12.5min，30-30％A；12.5-18min，30-0％A；18-25min，0-0％A；25-26min，0-95％A；26-30min，95-95％A；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：35℃。

更为具体的，S2中，正离子模式：HESI-Ⅱ离子源，离子源温度400℃，喷雾电压4.0kV，S-Lens RF电压60V，毛细管温度400℃，鞘气和辅助气均为高纯氮气，鞘气流速45arb，辅助气流速流速15arb；

负离子检出模式：HESI-Ⅱ离子源，离子源温度400℃，电离源电压-3.6kV，S-LensRF电压60V，鞘气和辅助气均为高纯氮气，鞘气流速45arb，辅助气流速15arb；扫描模式：一级全扫描与数据依赖性二级质谱扫描ddMS2；分辨率为70000Full Scan，17500MS/MS；碰撞模式：高能量碰撞解离，碰撞能量：NCE30，Stepped NCE50％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次利用UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS对丹参-山楂药对中的化学成分进行快速定性鉴别，共鉴定化合物81种，为该药对及相关制剂的药效物质基础、质量控制、基准物质研究等提供参考数据，也为中药药对化合物的快速鉴定提供方法参考。

附图说明

图1为丹参-山楂提取物在正离子A和负离子B模式下的基峰图；

图2为丹参酮ⅡA正离子模式下的裂解途径；

图3为丹参素负离子模式下的裂解途径；

图4为丹酚酸B负离子模式下的裂解途径；

图5为金丝桃苷负离子模式下的裂解途径；

图6为隐绿原酸负离子模式下的裂解途径。

具体实施方式

下面对本发明专利的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域所属的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1.材料

1.1实验试剂

见表1。

表1实验试剂

1.2实验仪器

见表2。

表2实验仪器

2.实验方法

2.1丹参-山楂药对样品制备

取丹参和山楂药材置烘箱中50℃烘干。

称量干燥的丹参和山楂药材各1000g，粉碎，40目过筛，所得粉末于干燥器中保存，备用。

称量丹参和山楂药粉各500g，加入8倍量70％的乙醇，回流提取2次，每次60min。合并两次滤液，回收乙醇，浓缩至稠膏，置于冷冻干燥机中干燥30h，收集干粉，密封保存于干燥器中，备用。

称取100mg的干粉，加入500μL提取液(甲醇：水＝4：1，内标浓度：10μg/mL)，涡旋30s，45Hz匀浆4min，冰水浴超声1h。

-40℃静置1h后将样本4℃，12000rpm，离心力13800(×g)，半径8.6cm，离心15min，取上清经0.22μm微孔滤膜过滤，-80℃储存直到上机检测。

2.2色谱条件

色谱柱：Waters的UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm*2.1*100mm)；

流动相：0.1％甲酸水溶液(A)，乙腈溶液(B)；

梯度洗脱条件：0-3.5min，95-85％A；3.5-6min，85-70％A；6-6.5min，70-70％A；6.5-12min，70-30％A；12-12.5min，30-30％A；12.5-18min，30-0％A；18-25min，0-0％A；25-26min，0-95％A；26-30min，95-95％A；

流速：0.4mL/min；

进样量：5μL；

柱温：35℃。

2.3质谱条件

正离子模式：HESI-Ⅱ离子源，离子源温度为400℃，喷雾电压为4.0kV，S-Lens RF电压60V，毛细管温度400℃，鞘气和辅助气均为高纯氮气(纯度＞99.99％)，鞘气流速45arb，辅助气流速流速15arb；

负离子检出模式：HESI-Ⅱ离子源，离子源温度为400℃，电离源电压为-3.6kV，S-Lens RF电压60V，鞘气和辅助气均为高纯氮气(纯度＞99.99％)，鞘气流速45arb，辅助气流速15arb。

扫描模式：一级全扫描(m/z 100-1500)与数据依赖性二级质谱扫描ddMS2；分辨率：70000(Full Scan)，17500(MS/MS)；

碰撞模式：高能量碰撞解离(HCD)，碰撞能量：NCE30，Stepped NCE50％。

2.4质谱分析

质谱数据通过Thermo Xcalibur 4.1软件处理分析，对于有对照品的化合物，与对照品图谱中各已知成分的相对保留时间、准分子离子等比对，再依据各对照品二级碎片离子信息进一步确认。对于无对照品的化合物，初步进行推测，再结合文献报道、数据库中相同或类似成分的MS2碎片离子进行对比分析，保证对无对照品成分的准确鉴定。

3.结果

3.1丹参-山楂药对中主要化学成分筛选分析

在2.2项分析条件进样，获得正、负离子模式下丹参-山楂药对物质基准总离子流图，结果见图1。

在2.3项质谱数据分析方法进行定性分析，对开丹参-山楂药对基准主要成分进行快速鉴定表征，结果见表3。

表3 UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS鉴别丹参-山楂提取物中化学成分

从图1和表3可知，共鉴定了81个化合物，其中35个来自丹参，主要为脂溶性的萜类成分和水溶性的酚酸成分；55个来自山楂，主要为有机酸和黄酮类化合物；其中咖啡酸、异阿魏酸、原儿茶酸、原儿茶醛和熊果酸等9个化合物属于二者共有成分。

3.2丹参-山楂药对主要成分的裂解规律与结构解析

3.2.1萜类化合物

结合参考文献进行比对，丹参中的萜类化合物在质谱中存在一定的裂解规律。因其结构中主要含有羟基、羰基等取代基，所以主要丢失18[H

如表3所示，化合物75，保留时间为13.40min，分子式为C

3.2.2酚酸类化合物

丹参中的酚酸类化合物容易带上负信号，主要在负离子模式下进行酚酸类化合物的成分分析。根据其结构的不同，可以将其分为单体的丹参素和咖啡酸，缩酚酸类的丹酚酸A、B、C、D、E以及迷迭香酸等。其中单体又可根据取代基的不同分为含有羧基和含有醛基两类，含有羧基的单体化合物在负离子模式下会产生135[C

缩酚酸类又可根据缩合的分子量不同分为二聚体和多聚体两类，多聚体在负离子模式下会产生519[C

化合物48，保留时间为6.49min，分子式为C

化合物49，保留时间为6.49min，分子式为C

3.2.3黄酮类化合物

黄酮类化合物是山楂中的主要化学成分，在治疗心血管疾病中起到重要作用。如化合物24准分子离子峰为m/z 291.087[M+H]+，推断最可能的分子式为C

3.2.4有机酸类化合物

有机酸类化合物是山楂的另一大类化学成分，在负离子模式下，如化合物13的准分子离子峰为[M-H]-m/z 353.088，推断最可能的分子式为C

综上所述，本发明首次利用UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS对丹参-山楂药对中的化学成分进行快速定性鉴别，共鉴定化合物81种，为该药对及相关制剂的药效物质基础、质量控制、基准物质研究等提供参考数据，也为中药药对化合物的快速鉴定提供方法参考。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。