一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

背景技术

灰霉病是由灰葡萄孢引起的一种世界性病害，主要为害叶片和果实，造成发病部位腐烂。灰葡萄孢是一种坏死性真菌病原体，会感染500多种植物，会对全球作物造成严重的生产损失。目前，通常采用化学防治灰霉病，常用化学杀菌剂包括苯并咪唑类以及苯胺基嘧啶类等，单一的化学杀菌剂处理，易使植株产生抗药性，长此以往削弱了防治效果，且化学防治手段不利于环境保护，残留药物会危害人畜健康。因此急需生物防治手段来解决灰霉病害的问题。

芽孢杆菌是目前应用最广泛的生防细菌之一，可以对各种植物病害进行有效的防治。Borriss等(2011)采用16SrDNA、gyrA以及cheA基因序列系统发育分析，结合DNA-DNA杂交技术及比较基因组分析，提出了解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种和解淀粉芽孢杆菌植物亚种2个新分类单元。直到2016年，Dunlap等采用比较基因组分析认为解淀粉芽孢杆菌植物亚种属于贝莱斯芽孢杆菌的同物异名。

贝莱斯芽孢杆菌能够产生多种具有抑菌活性的次级代谢产物，如脂肽类抗生素、聚酮类抗生素、细菌素类物质以及抑菌蛋白等。贝莱斯芽孢杆菌抗菌肽类物质的合成通常由多基因控制，这些基因通常会成簇的形式在基因组上。贝莱斯芽孢杆菌FZB42产生的杆菌霉素(Bacillomycin D)可以改变细胞质膜、菌丝体以及分生孢子细胞壁的形态，从而对真菌产生明显的抑制效果。贝莱斯芽孢杆菌V4菌株能够产生伊枯草菌素、Macrolactin(大环内酯)和Difficidin(达菲菌素)等抗菌物质，该菌分泌的抑菌物质与杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的细胞质膜相互作用，使其细胞质膜穿孔，最终造成细胞内容物流失，进而细胞死亡。贝莱斯芽孢杆菌Y6在生长过程中，会产生脂肽类伊枯草菌素，该物质对真菌孢子萌发表现出较强的抑制作用。贝莱斯芽孢杆菌SQR9产生的一种脂肽化合物杆菌霉素D(bacillomycin D)不仅在对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的拮抗活性中起着至关重要的作用，而且还影响参与生物膜形成的基因的表达。

本研究旨在利用第三代测序技术对贝莱斯芽孢杆菌XDY66的全基因组序列进行测定，对其在真菌病害的生物防治、作用机制及应用潜力进行研究，为相关作物真菌病害的生物防治提供新的微生物资源以及防治思路。

发明内容

本发明的目的之一在于提供具有防治作物病原真菌及细菌病害的生防潜力的一株贝莱斯芽孢杆菌，目的之二在于提供一株贝莱斯芽孢杆菌在作物病害防治方面的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY66，已于2023年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20232019。

该菌株通过16S rDNA基因进行分析，经鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)，并将其命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY66

该贝莱斯芽孢杆菌XDY66的菌体形态为杆状，产芽孢，为革兰氏阳性细菌。

该贝莱斯芽孢杆菌的16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，贝莱斯芽孢杆菌XDY66染色体大小为3.956418Mb(NCBI登录号CP130608)，GC含量在46.53％；另外包括一个质粒大小为8134bp(NCBI登录号CP130609)，GC含量为40.31％；CDS(Protein-codingsequences)数量为3798个。

本发明还提供一株贝莱斯芽孢杆菌在作物病害防治方面的应用，引起作物病害的微生物包括但不限于灰葡萄孢、辣椒疫霉和番茄枯萎病菌。

具体的应用方法为：将贝莱斯芽孢杆菌XDY66制成发酵液，每毫升(1mL)发酵液中含有贝莱斯芽孢杆菌XDY6650-100亿个菌体，用发酵液对番茄、辣椒等作物进行根部滴灌或叶面喷施。

本发明的有益效果：

本发明从番茄根际土壤中筛选、分离出一株贝莱斯芽孢杆菌XDY66，能够较强拮抗灰葡萄孢、辣椒疫霉和番茄枯萎病菌，为相关作物真菌病害的生物防治提供了新的微生物资源以及防治思路。

本发明贝莱斯芽孢杆菌XDY66中COG3208基因编码与表面活性素合成过程相关的表面活性素硫酯酶亚基，说明贝莱斯芽孢杆菌XDY66有合成新的表面活性素的能力；AntiSMASH分析显示贝莱斯芽孢杆菌XDY66基因组含有13个次级代谢基因簇，具有合成多种拮抗化合物的能力；另外，贝莱斯芽孢杆菌XDY66具有编码kijanimicin(基雅尼霉素)类似化合物的次生代谢产物基因簇，该化合物是放线菌产生的一种螺酮类抗生素，说明贝莱斯芽孢杆菌XDY66具有产生与B.velezensis FZB42、B.velezensis SQR9不同次生代谢产物的能力。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是本发明实施例1中贝莱斯芽孢杆菌XDY66对灰葡萄孢、辣椒疫霉、番茄枯萎病菌的拮抗作用图；

图2是本发明实施例2中贝莱斯芽孢杆菌XDY66对灰霉病菌的拮抗试验结果图；

图3是本发明实施例3中贝莱斯芽孢杆菌XDY66的革兰氏染色和芽孢染色图；

图4是本发明实施例4中贝莱斯芽孢杆菌XDY66基于16S rDNA的系统发育树图；

图5是本发明实施例5中贝莱斯芽孢杆菌XDY66的基因组圈图及同源聚类基因簇分析图；

图6是本发明实施例6中贝莱斯芽孢杆菌XDY66与B.velezensis FZB42、B.velezensis SQR9的比较基因组分析图；

图7是本发明实施例6中贝莱斯芽孢杆菌XDY66与B.velezensis FZB42、B.velezensis SQR9的次生代谢产物基因簇共线性分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：芽孢杆菌XDY66的筛选、分离

番茄根际土壤：采集于安徽省淮北市杜集区高岳街道现代农业示范园。

将3株植物病原真菌灰葡萄孢、辣椒疫霉和番茄枯萎病菌分别置于PDA固体培养基上活化培养，直至菌丝长满培养基备用。取结果期番茄根际土壤10g，溶解于90mL无菌生理盐水(0.85％w/v)中，剧烈震荡10min。

将番茄根际土壤混悬液在80℃孵育30min，然后静置5min，将番茄根际土壤悬浮液用无菌生理盐水梯度稀释至10

图1结果表明，芽孢杆菌XDY66对灰葡萄孢(B.cinerea)、辣椒疫霉(P.capsici)、番茄枯萎病菌[F.oxysporumf.sp.radicis lycopersic(Forl)]均具有较强的拮抗作用。

实施例2：芽孢杆菌XDY66对灰霉病菌的拮抗试验

1、准备材料：

灰葡萄孢孢子液的制备：将灰葡萄孢接种在PDA培养基上，23℃培养5d，待其长满孢子后，加无菌水用涂布棒刮取制得灰葡萄孢孢子液，用无菌水将孢子调至1x10

XDY66发酵液的制备：将活化的芽孢杆菌XDY66接种到YPD液体培养基中，培养48h，然后用无菌水将XDY66发酵液细胞数量调至1x10

①灰葡萄孢孢子液；②XDY66发酵液；③XDY66发酵液+灰葡萄孢孢子液；④XDY66发酵上清液；⑤XDY66发酵上清液+灰葡萄孢孢子液。其中③和⑤均是先蘸取XDY66发酵液或发酵上清液，之后再蘸取灰葡萄孢孢子液。

2、芽孢杆菌XDY66对灰霉病菌的活体拮抗试验：将清洗干净的“京丹1号”圣女果用质量分数为75％酒精擦拭后放到无菌操作台上晾干酒精，用无菌针头在圣女果表面各打1个孔，将有孔洞的地方蘸取上述处理液，停留15s，每组处理做8个平行；23℃下培养14d，并在10d、12d以及14d拍照记录数据。

3、芽孢杆菌XDY66对灰霉病菌的离体拮抗试验：接种5μL灰葡萄孢孢子(1x10

结果请参阅图2。与对照(图2A)相比，添加菌株XDY66处理的灰葡萄孢菌丝出现畸形，且菌丝顶部出现了肿大(图2B中箭头所示)，部分菌丝出现溶解现象(图2B)。

由图2C可知，单独接种灰葡萄孢的圣女果发病率达到87.5％，单独接种XDY66发酵液、XDY66发酵上清液对圣女果无不良影响。接种XDY66发酵液+灰葡萄孢处理、发酵上清液+灰葡萄孢处理圣女果均未发病。

实施例3：芽孢杆菌XDY66形态及生理生化特征的鉴定

1、对芽孢杆菌XDY66进行革兰氏染色(请参阅图3A)和芽孢染色(请参阅图3B)，观察芽孢杆菌XDY66菌体形态为杆状，产芽孢，革兰氏阳性细菌。

2、根据《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)以及API-50CHB试剂条对芽孢杆菌XDY66的生理生化特性进行分析，结果如表1所示(“+”表示反应为阳性，“–”表示反应为阴性)。

表1

从表1中可知，菌株XDY66可以利用淀粉、丙三醇、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、肌醇、D-甘露醇、山梨醇、D-麦芽糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-棉子糖、D-乳糖以及产铁载体等。

实施例4：芽孢杆菌XDY66分类地位的鉴定

芽孢杆菌XDY66的分子鉴定采用16S rDNA基因进行分析。采用细菌基因组试剂盒(天根生化科技有限公司)提取芽孢杆菌XDY66的基因组DNA，以细菌16S rDNA基因的特异性引物27F和特异性引物1492R进行PCR扩增。

特异性引物27F的序列为：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

特异性引物1492R的序列为：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′

芽孢杆菌XDY66的16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA

利用NCB I网站的BLAST功能对所测的16S rDNA序列进行同源性分析，确定亲缘关系，使用MEGA 7.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。结果请参阅图4。

由图4可以看出，菌株XDY66与B.velezensis CR-502(AY603658)相似性最高，处于同一个分支。结合菌体形态特征、生理生化特性以及16S rDNA序列比较分析，将菌株XDY66鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)，并将其命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)XDY66，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20232019。

实施例5：对实施例4中贝莱斯芽孢杆菌XDY66的全基因组测序

将贝莱斯芽孢杆菌XDY66单菌落接种到YPD液体培养基中，30℃、180rpm培养至对数期，6000r/min离心10min收集菌体。采用DNA提取试剂盒提取贝莱斯芽孢杆菌XDY66菌株基因组DNA。将合格的基因组DNA样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因组测序，结果请参阅图5。

图5中A部分为贝莱斯芽孢杆菌XDY66基因组圈图。圈图从外到内第一圈和第四圈为正链、负链上的CDS，不同的颜色表示不同的COG功能分类；第二圈和第三圈分别为正链、负链上的CDS、tRNA、rRNA；第五圈为GC含量，向外的部分表示该区域GC含量高于全基因组平均GC含量，峰值越高表示与平均GC含量差值越大，向内的部分表示该区域GC含量低于全基因组平均GC含量，峰值越高表示与平均GC含量差值越大；第六圈为GC-Skew值，具体算法为G-C/G+C，可以辅助判断前导链和后滞链；最内一圈为基因组大小标识。

B部分为贝莱斯芽孢杆菌XDY66所含质粒基因组圈图。

C部分为贝莱斯芽孢杆菌XDY66的同源聚类基因簇(COG)分析。其中A：RNA加工和修饰；B：染色质结构和动力学；C：能量的产生和转换；D：细胞周期控制、细胞分裂、染色体分割；E：氨基酸转运和代谢；F：核苷酸转运和代谢；G：碳水化合物运输和代谢；H：辅酶转运和代谢；I：脂质运输和代谢；J：翻译，核糖体结构和生物发生；K：转录；L：复制、重组和修复；M：细胞壁/膜/包膜生物发生；N：细胞运动；O：翻译后修饰，蛋白质周转，分子伴侣；P：无机离子转运和代谢；Q：次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢；R：仅通用功能预测；S：功能未知；T：信号转导机制；U：细胞内运输、分泌和囊泡运输；V：防御机制；W：细胞外结构；X：移动组：噬菌体、转座子；Y：核结构；Z：细胞骨架。

图5测序结果表明，贝莱斯芽孢杆菌XDY66染色体大小为3.956418Mb(NCBI登录号CP130608)，GC含量在46.53％；另外包括一个质粒大小为8134bp(NCBI登录号CP130609)，GC含量为40.31％；CDS(Protein-coding sequences)数量为3798个。

COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)分析显示，丰度最大的是参与氨基酸转运和代谢的基因，有305个；其次是参与转录的基因有297个；碳水化合物转运和代谢与翻译、核糖体和生物发生以及细胞壁/膜/包膜生物发生的基因数量分别为270、231和210。次生代谢物的生物合成、转运和分解代谢的基因有79个(图5C)。

GO(Gene Onotology)分析结果显示，贝莱斯芽孢杆菌XDY66含有对环境中紫外反应的相关基因(GO：0009411)和对环境冷热反应的相关基因(GO：0009409)，表明贝莱斯芽孢杆菌XDY66具有抗逆特性。此外，贝莱斯芽孢杆菌XDY66还包含有铁硫簇组件(GO：0016226)、细胞溶解(GO：0019835)相关基因，则表面贝莱斯芽孢杆菌XDY66具有抗菌特性。

实施例6：贝莱斯芽孢杆菌XDY66与其他贝莱斯芽孢杆菌比较基因组的分析

1、在NCBI网站上下载B.velezensis FZB42、B.velezensis SQR9的基因组序列信息，与贝莱斯芽孢杆菌XDY66进行比较基因组分析(请参阅图6A)，A部分颜色相同的方框表示合成区域。水平线下方的方框表示倒置区域。重排用彩色线表示。对3株菌的CDS区进行同源性分析(请参阅图6B)，并对3株菌的功能基因进行了KEGG(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes)注释(请参阅图6C)。

根据图6可知，贝莱斯芽孢杆菌XDY66、B.velezensis FZB42、B.velezensis SQR9三株菌共有的核心基因数为3261个，这些大多数是参与基础生命活动的基因，占基因组总核心基因数的89％以上，其中有176个基因为贝莱斯芽孢杆菌XDY66所特有(图6A)。

此外，贝莱斯芽孢杆菌XDY66有93个核心基因与B.velezensisFZB42重合，有126个核心基因与B.velezensis SQR9重合，这表明贝莱斯芽孢杆菌XDY66在某些核心基因的功能方面与B.velezensis FZB42及B.velezensis SQR9类似(图6B)。

KEGG注释表明，部分基因功能预测与信号分子相互作用、膜运输、脂类转运代谢、DNA修饰、次生代谢产物、膜蛋白等相关。其中，涉及氨基酸代谢、碳水化合物代谢、聚糖合成和代谢、细胞生长与死亡的基因三者基本上是一致的(图6C)。

2、为了明确贝莱斯芽孢杆菌XDY66和另外2株模式菌株B.velezensis FZB42、B.velezensis SQR9是否存在差异性，我们对三者进行了比较基因组分析，结果请参阅表2。

表2

从表2可知，贝莱斯芽孢杆菌XDY66的基因组比二者都小，且贝莱斯芽孢杆菌XDY66包含1个质粒，B.velezensis FZB42和B.velezensis SQR9不含有质粒贝莱斯芽孢杆菌XDY66基因组的CDS序列数量小于B.velezensis FZB42和B.velezensis SQR9菌株。

3、将这三株菌的基因组序列分别上传antiSMASH6.0进行次生代谢产物合成基因簇分析，结果请参阅表3。

表3

如表3所示，贝莱斯芽孢杆菌XDY66含有13个次生代谢产物合成基因簇，这些次生代谢产物包括脂肽类化合物surfactin、fengycin和铁载体类化合物bacillibactin，3种聚酮类化合物macrolactin、bacillaene和difficidin以及1种二肽化合物bacilysin。

antiSMASH分析结果表明，贝莱斯芽孢杆菌XDY66基因组含有多种次生代谢产物合成基因簇，具有防治作物真菌及细菌病害的生防潜力。

4、再使用Mauve软件对贝莱斯芽孢杆菌XDY66与B.velezensis FZB42、B.velezensis SQR9基因组做共线性分析(请参阅图7)，结果表明贝莱斯芽孢杆菌XDY66、B.velezensis FZB42和B.velezensis SQR9含有10个相同的次生代谢产物基因簇，这些基因簇保守性较高，彼此间存在共线性关系。

综上所述，贝莱斯芽孢杆菌XDY66菌株含有质粒，而B.velezensis SQR9及B.velezensis FZB42均不含质粒，表明贝莱斯芽孢杆菌XDY66与B.velezensis SQR9、B.velezensis FZB42基因组特性有差异。进一步分析显示贝莱斯芽孢杆菌XDY66与B.velezensis SQR9菌株的亲缘关系较近，说明贝莱斯芽孢杆菌XDY66具有和B.velezensisSQR9相似的功能；但176个基因为贝莱斯芽孢杆菌XDY66所特有，其中COG3208基因编码与表面活性素合成过程相关的表面活性素硫酯酶亚基，说明贝莱斯芽孢杆菌XDY66有合成新的表面活性素的能力。

贝莱斯芽孢杆菌XDY66与B.velezensis FZB42、B.velezensis SQR9基因组相比，贝莱斯芽孢杆菌XDY66基因组较小，仅有3.96Mb，表明该菌基因组较为紧凑。AntiSMASH分析显示贝莱斯芽孢杆菌XDY66基因组含有13个次级代谢基因簇，其中有7个次级代谢基因簇与已有研究有较高的相似性(Chen et al.,2007)，说明贝莱斯芽孢杆菌XDY66具有合成surfactin、fengycin、bacillibactin、bacillaene、macrolactin、difficidin、bacilysin等多种拮抗化合物的能力。

另外，贝莱斯芽孢杆菌XDY66具有编码kijanimicin类似化合物的次生代谢产物基因簇，该化合物是放线菌产生的一种螺酮类抗生素，说明贝莱斯芽孢杆菌XDY66具有产生与B.velezensis FZB42、B.velezensis SQR9不同次生代谢产物的能力。

这些结果表明，贝莱斯芽孢杆菌XDY66具有防治作物病原真菌及细菌病害的生防潜力，为作物病害防治提供新的贝莱斯芽孢杆菌菌株资源。

上述实施例中灰葡萄孢(B.cinerea)：淮北师范大学生命科学学院实验室分离保藏。辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、番茄枯萎病菌[F.oxysporumf.sp.radicislycopersic(Forl)]：由辽宁省农业科学院植物保护研究所臧超群博士提供。

PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉20g/L，pH7.0。

YPD固体培养基：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉20g/L。

YPD液体培养基：YPD固体培养基成分不添加琼脂粉。

实施例7：发酵液的制备

将保存的莱斯芽孢杆菌XDY66划线接种于YPD固体培养基上，在30℃的恒温箱中培养24h，然后挑取单菌落接种于100mL的YPD液体培养基中，在30℃、180r/min的条件下振荡培养24h，作为莱斯芽孢杆菌XDY66的10L发酵罐种子液。

发酵培养基：牛肉浸膏3g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖20g/L、pH值为7。

将上述发酵培养基高温高压灭菌后，接种种子液，在30℃、300r/min、0.05MPa气压和0.4(V/V·min)通气量的条件下培养72h，得到贝莱斯芽孢杆菌XDY66制成发酵液，每1mL发酵液中含有贝莱斯芽孢杆菌XDY6650-100亿个。

用发酵液对番茄、辣椒等作物进行根部滴灌或叶面喷施，

将位于安徽省淮北市濉溪县的多发灰霉病的番茄试验田(八月底定值)随机划分为9个区块进行试验，以叶面喷施发酵液作为试验组，叶面喷施多菌灵(国光，稀释800倍)作为对照组，叶面喷施清水作为空白组，每组包括3个试验区块(区块1，2，3)，两次喷施时间分别为2023年9月3日和2023年9月30日，每次喷施量均为30L/亩。

于2023年10月17日统计番茄患灰霉病的发病率，发病率(％)＝患病植株数/植株总数×100％(保留1位小数)。结果如表4所示。

表4

由表4可以看出，实施例7中发酵液对番茄灰霉病有良好的防治作用，应用简单，具有实际应用价值。

需要说明的是，在本文中，诸如术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。