一种LncRNA抑制剂在制备减肥药物中的应用
文献发布时间:2023-06-19 09:47:53
(一)技术领域
本发明涉及一种LncRNA抑制剂在制备减肥药物中的应用。
(二)背景技术
随着社会经济的快速发展,我国乳腺癌的发病率逐年增加且呈现出年轻化趋势。与其他国家相同,乳腺癌位居我多女性恶性肿瘤发病率首位。在全球乳腺癌新诊断病例中,我国占12.2%。调查显示,我国2015年乳腺癌新诊断病例27.24万人,占全部恶性肿瘤的15%,死亡人数2.07万人,严重威胁着女性的身体健康和生活质量。因此,乳腺癌的有效治疗具有重要的社会意义。
肥胖是体内脂肪堆积过多或分布异常所引起的慢性代谢性疾病,根据《中国成人超重和肥胖预防控制指南》,中国成人体重指数(BMI)正常范围为18.5kg/m
肥胖能够破坏人体内环境稳态,脂肪因子在体内不断地攻击人体的免疫和内分泌系统,长期必然使机体代谢受到影响。一般的,肥胖人群的胰岛细胞功能受损,不能及时有效地调节血糖,随之而来的就是高血糖、高血脂和高血压的发生。
LncRNA是一类长度大于200个核苷酸没有编码蛋白质能力的RNA,缺乏可识别的开放阅读框架。尽管在起初认为lncRNA是基因组转录的“噪音”,不具有生物学功能,但是,近年来许多研究表明,lncRNA通过调节蛋白质、DNA、RNA的表达来调控细胞的细胞周期、分化和表观遗传等许多生命活动。因此,lncRNA的异常表达会引发癌症,lncRNA可能是肿瘤细胞中的潜在的生物标志物。越来越多的研究表明,lncRNA在癌症的发生、发展过程中起了重要作用。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种LncRNA抑制剂在制备减肥药物中的应用,本发明所述的LncRNA抑制剂可以显著降低体重的增加,对于肥胖引起的乳腺癌的治疗具有一定的辅助作用。
本发明采用的技术方案是:
本发明提供一种LncRNA抑制剂在制备减肥药物中的应用,所述LncRNA抑制剂核苷酸序列为:5'-GACCAGTGTTAACTGCTTCCTGATGACAG-3'(SEQ ID NO.1)。
进一步,所述药物为抑制LncRNALOC339535表达的药物,所述 LncRNALOC339535核苷酸序列为(SEQ ID NO.2):
TGGAATTCAAGCTGTGGGTGAGAAGCTCTCTAGCAGGGACTCTGACCTTAT GGAGGATCGCTGTTTCCCCCATTTTTCCTTTTCACCCAAAAAAGTCCTGCTTCTC TCACCCTTCAAACAGCCTGTGAGCCTAAATTTTTGTGGCCATGGGACAGACAAG GACCCCGTCTTCAGCTGAACTAAGGAAAAGTCCTGCGACATCTTTGGTACGCAC TGTGGAGGCTCTACAAACAGCCATCAAACTCCAACCAGTCACCCAACCAGAGC CTCTGAGGATGGCCCCTTCTGCGGGGAACCCTTACATGGGCCTCTGACTGATGC TTCCCCAAAACAGTGCCCCCTGTCATCAGGAAGCAGTTAACACTGGTCTTCATT CTTACGCTTATCCTTATTCTAACAGCAGTTATATGTACTTCTTTAGACGGGGGAAT AAGACAGCCAGGTGGGAGGGGGTCTCTGGAAAACTCCATCTGGCCTGTGCACT AGGGTGGAACCTCAGGAAGTTGATGACATTTGTAGCTGGGAGCAGCCTGGCCC CTCCTCTTCCTGTGTGGAACCTGAAATTCCACCGGCTTGGCAGGAAGCGCTCTAGCAGGGACTCCGGCTTTGCAGAGCATCCCTGTTTCCCCGTTTTTCCCTTTTCACC CAATAAAACCCTGCTTCACTCACCCTTCAAACCATCTGCAAGCCTAAATTTTTGT GGCTGTGGGACGGACAAAGATGCCTTTAGCTGACTGAGGAAAAGTCCTGCAAC ACAGGTATCACTGCACATTTATAATATTGTTTCTCTGTTTTAAACCTTGTATAAATA GGAAAATATTGTATATAATCTCAAGCAGATTGTTTTCTTTTGAAAAGTATTCATATA TGTTAAAGATGTAGTTCTAGTTCATTCATTTTCTCTGTTTTGACTCTTTTATACATA TACTACAGCTCATTTATCCATTTTCCTACTGTTGCAACATAGATTGCTTATAATTCT TCTAATTACTAACAATGCTGGTATGAAATTGTTGTGTATATCTCTGGTAGATATGTGTTATTTCTTTTTTGCAATGCTAGATTATAATTATTTGTCTAAGGTGGAGATTACCAG GGTAGACTCGCTCTGGCCGTATGTAATGATGTCTGTGGCTACATAACCTGCCAAC ACTTAGTCTTATCACACATTTTATTTTAAAATCAATATGTAAAAAATACTAATTTAC TTGGTAGTAATTTAAATTTTTCTGATTATTACTGAGGTTGAATATGTTTTCATATGTTTACTGAATATTCCTGTTAATTTTCTCATGAATTTCAGTTAATGTTTCTGTTGATTT TATTAATTTGTAGTGGTTTTGAAACATATTCTAGAAACCAATATTTTGTCTGTTGTA TGTGTTACAAATATATTTATTTTGTATAGCTTCTTCATATTTAGTACTTTTACAATTT TAACAGTAAAATTAGTTTCATGTTTTATAGCTATAATTATTATAACTTTTAAATAAAT ATTTCCTCAATTAAAATAAAAATGCATTATCCTTAAAAAAAAAAA。
进一步,所述药物为辅助治疗肥胖引起的乳腺癌的药物。
进一步,所述药物还包括药学上可用的载体,所述载体为胆固醇、脂质体、纳米颗粒中的一种或多种。
本发明所述药物以注射的方式给药,注射给药方式包括肌肉注射、静脉注射和皮下注射,所述药物中LncRNA抑制剂的含量为1mg/mL。
肥胖的乳腺癌患者预后更差,生存率更低,LncRNALOC339535在三阴乳腺癌中特异性表达,本发明通过实验发现LncRNALOC339535能诱导小鼠肥胖,通过注射 LncRNA抑制剂能显著抑制小鼠体重增加。本发明提供的LncRNA抑制剂能够抑制 LncRNALOC339535表达,进而用于辅助治疗肥胖引起的乳腺癌。
与现有技术相比,本发明有益效果主要体现在:本发明所述的LncRNA抑制剂可以显著降低体重的增加,辅助治疗肥胖引起的乳腺癌。本发明所用原料科学合理,制备工艺简单,成本较低,辅助治疗效果较好。
(四)附图说明
图1为LncRNALOC339535的过表达促进了肥胖。
图2为LncRNALOC339535在肥胖的乳腺癌患者中高表达。
图3为LncRNALOC339535抑制剂对小鼠体重增长的抑制作用。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
以下实例中所用实验动物中野生型小鼠品种为FVB;转基因小鼠是由赛业生物科技公司将LncRNALOC339535基因(SEQ ID NO.2)敲入野生型小鼠FVB构建的转基因小鼠。所用的扩增酶和逆转录酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。所用试剂均为分析纯级试剂。所述高脂饲料中脂肪含量为60%,购自上海帆泊生物技术有限公司。
实施例1、小鼠肥胖模型构建
LncRNALOC339535基因敲入的转基因小鼠分为两组,每组7只,即普通饲料喂养组(ND-KI)和高脂饲料喂养组(HFD-KI)。野生型小鼠也分为两组,每组7只,即普通饲料喂养组(ND-WT)和高脂饲料喂养组(HFD-WT)。10周后,称量体重可以观察到高脂喂养的LncRNALOC339535敲入的转基因小鼠最为肥胖(图1中A和B)。
实施例2、葡萄糖耐受实验
1、小鼠准备:实施例1培养10周后的每组实验小鼠选6只,于实验前一天下午 5点将小鼠换入干净的笼子禁食,禁食16小时至次日9点,禁食期间,小鼠保持正常饮水。
2、次日上午9点,开始葡萄糖耐受实验,称取每只小鼠的体重,并用记号笔在小鼠的尾巴根部标记序号,以便在实验过程中能快速的辨认所测小鼠。
3、空腹基础血糖的测定:将小鼠从笼子中取出,轻放于铁网之上,用剪刀剪去小鼠尾巴末端1-2mm,轻轻挤压小鼠尾巴,让血液富集成一滴,用血糖仪测定空腹血糖,测定值认定为0min的血糖值,操作尽量轻柔,使小鼠不至于过度惊吓。
4、让小鼠适应30mim之后,开始准备腹腔注射葡萄糖。
5、腹腔注射葡萄糖:将小鼠轻轻抓起,按照标准的腹腔注射操作1mL注射器给小鼠注射质量浓度20%葡萄糖溶液(生理盐水配制)。注射的体积根据小鼠的体重决定0.01mL/g,从注射完毕时起开始计时;一般情况下,每只小鼠的操作间隔在1min,这样可以准确地按照所规定时间完成对每只小鼠的血糖测定。
6、在15min,30min,60min,90min,120min按照步骤3的操作测定每只小鼠各个时间点的血糖值。
7、实验完毕后,将每笼小鼠补充上饲料。
葡萄糖耐受实验证实小鼠肥胖模型构建成功,表明LncRNALOC339535敲入的小鼠对葡萄糖的耐受降低(图1中C)。
实施例3:LncRNALOC339535在肥胖的乳腺癌患者中高表达
本实施例选取乳腺癌患者肿瘤样本,收集中山大学肿瘤防治中心的临床样本46例,其中10例为癌旁组织,36例为乳腺癌组织,样本收集均征得患者的知情同意。 Trizol试剂提取总RNA,制备cDNA,实时荧光定量PCR检测LncRNA的表达量。
1、总RNA的提取
选取适量乳腺癌患者的组织加入1ml的Trizol,组织研磨器进行研磨。4℃、12000rpm离心10min,取上清。每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿,剧烈震荡15s后,室温静置3min。4℃、12000rpm离心10min,样品分为三层,取上层无色水相至新的1.5ml EP管。
在新管中加入与无色水相等体积的异丙醇,上下颠倒混匀,室温静置10min。4℃、12000rpm离心10min,去上清。加入1ml RNase-free水配置的75%乙醇洗涤沉淀。4℃、8000rpm离心5min,弃上清。室温晾干20min,根据RNA沉淀量,加入适量RNase-free 水,溶解RNA。
2、使用诺唯赞公司反转录试剂盒,将RNA逆转录为cDNA。以此cDNA为模板,采用实时荧光定量PCR试剂盒检测LncRNALOC339535的表达量。
根据NCBI BLAST设计LncRNALOC339535检测引物(LOC339535 F、 LOC339535 R)及内参引物(18S F、18S R):
LOC339535 F:5'-AAAACAGTGCCCCCTGTCA-3',
LOC339535 R:5'-GTTCCACCCTAGTGCACAGG-3'。
18S F:5’-GGACACGGACAGGATTGACA-3’,
18S R:5’-GACATCTAAGGGCATCACAG-3’。
表1、反应体系
荧光定量PCR的条件为:95℃预变性30s,95℃变性15s,60℃退火30s,72℃延伸20s,共40个循环,然后计算分析熔解曲线及循环数Cq值。按照内参18s的Cq 值对各组进行平衡,计算2
实施例4:LncRNA抑制剂抑制体重增长实验
本实施例以实施例1高脂饲料喂养10周的LncRNALOC339535基因敲入小鼠为实验对象,分为2组,每组6只。一组为对照组,不给药:另一组为实验组,给药。
1、小鼠准备:每组实验小鼠数量为6只,先将每只小鼠称重。
2、注射给药:将小鼠轻轻抓起,操作1mL注射器在脂肪垫部位注射LncRNA抑制剂(SEQ ID NO.1,以纳米颗粒为载体,溶剂为水)。按照0.2mg/kg的剂量给药。
3、将小鼠轻轻放回鼠笼,给每笼小鼠补充鼠粮(高脂)和水。
4、隔一天后再次给药,重复步骤1、2、3。共持续14天,给药7次。
图3为注射LncRNA抑制剂后小鼠体重变化,结果显示通过注射LncRNA抑制剂能显著抑制小鼠体重增加。
本发明所述的LncRNA抑制剂可以显著降低体重的增加,适用于肥胖引起的乳腺癌辅助治疗。本发明所用原料科学合理,制备工艺简单,成本较低,辅助治疗效果较好。
上述实施例的说明用于理解本发明的方法及主要思想。应当说明,对于本领域的技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行一些改进,这些改进也在本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种LncRNA抑制剂在制备减肥药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gaccagtgtt aactgcttcc tgatgacag 29
<210> 2
<211> 1540
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
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ctcaattaaa ataaaaatgc attatcctta aaaaaaaaaa 1540
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