一种LncRNA抑制剂在制备减肥药物中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种LncRNA抑制剂在制备减肥药物中的应用。

(二)背景技术

随着社会经济的快速发展，我国乳腺癌的发病率逐年增加且呈现出年轻化趋势。与其他国家相同，乳腺癌位居我多女性恶性肿瘤发病率首位。在全球乳腺癌新诊断病例中，我国占12.2％。调查显示，我国2015年乳腺癌新诊断病例27.24万人，占全部恶性肿瘤的15％，死亡人数2.07万人，严重威胁着女性的身体健康和生活质量。因此，乳腺癌的有效治疗具有重要的社会意义。

肥胖是体内脂肪堆积过多或分布异常所引起的慢性代谢性疾病，根据《中国成人超重和肥胖预防控制指南》，中国成人体重指数(BMI)正常范围为18.5kg/m

肥胖能够破坏人体内环境稳态，脂肪因子在体内不断地攻击人体的免疫和内分泌系统，长期必然使机体代谢受到影响。一般的，肥胖人群的胰岛细胞功能受损，不能及时有效地调节血糖，随之而来的就是高血糖、高血脂和高血压的发生。

LncRNA是一类长度大于200个核苷酸没有编码蛋白质能力的RNA，缺乏可识别的开放阅读框架。尽管在起初认为lncRNA是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能，但是，近年来许多研究表明，lncRNA通过调节蛋白质、DNA、RNA的表达来调控细胞的细胞周期、分化和表观遗传等许多生命活动。因此，lncRNA的异常表达会引发癌症，lncRNA可能是肿瘤细胞中的潜在的生物标志物。越来越多的研究表明，lncRNA在癌症的发生、发展过程中起了重要作用。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种LncRNA抑制剂在制备减肥药物中的应用，本发明所述的LncRNA抑制剂可以显著降低体重的增加，对于肥胖引起的乳腺癌的治疗具有一定的辅助作用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种LncRNA抑制剂在制备减肥药物中的应用，所述LncRNA抑制剂核苷酸序列为：5'-GACCAGTGTTAACTGCTTCCTGATGACAG-3'(SEQ ID NO.1)。

进一步，所述药物为抑制LncRNALOC339535表达的药物，所述 LncRNALOC339535核苷酸序列为(SEQ ID NO.2)：

TGGAATTCAAGCTGTGGGTGAGAAGCTCTCTAGCAGGGACTCTGACCTTAT GGAGGATCGCTGTTTCCCCCATTTTTCCTTTTCACCCAAAAAAGTCCTGCTTCTC TCACCCTTCAAACAGCCTGTGAGCCTAAATTTTTGTGGCCATGGGACAGACAAG GACCCCGTCTTCAGCTGAACTAAGGAAAAGTCCTGCGACATCTTTGGTACGCAC TGTGGAGGCTCTACAAACAGCCATCAAACTCCAACCAGTCACCCAACCAGAGC CTCTGAGGATGGCCCCTTCTGCGGGGAACCCTTACATGGGCCTCTGACTGATGC TTCCCCAAAACAGTGCCCCCTGTCATCAGGAAGCAGTTAACACTGGTCTTCATT CTTACGCTTATCCTTATTCTAACAGCAGTTATATGTACTTCTTTAGACGGGGGAAT AAGACAGCCAGGTGGGAGGGGGTCTCTGGAAAACTCCATCTGGCCTGTGCACT AGGGTGGAACCTCAGGAAGTTGATGACATTTGTAGCTGGGAGCAGCCTGGCCC CTCCTCTTCCTGTGTGGAACCTGAAATTCCACCGGCTTGGCAGGAAGCGCTCTAGCAGGGACTCCGGCTTTGCAGAGCATCCCTGTTTCCCCGTTTTTCCCTTTTCACC CAATAAAACCCTGCTTCACTCACCCTTCAAACCATCTGCAAGCCTAAATTTTTGT GGCTGTGGGACGGACAAAGATGCCTTTAGCTGACTGAGGAAAAGTCCTGCAAC ACAGGTATCACTGCACATTTATAATATTGTTTCTCTGTTTTAAACCTTGTATAAATA GGAAAATATTGTATATAATCTCAAGCAGATTGTTTTCTTTTGAAAAGTATTCATATA TGTTAAAGATGTAGTTCTAGTTCATTCATTTTCTCTGTTTTGACTCTTTTATACATA TACTACAGCTCATTTATCCATTTTCCTACTGTTGCAACATAGATTGCTTATAATTCT TCTAATTACTAACAATGCTGGTATGAAATTGTTGTGTATATCTCTGGTAGATATGTGTTATTTCTTTTTTGCAATGCTAGATTATAATTATTTGTCTAAGGTGGAGATTACCAG GGTAGACTCGCTCTGGCCGTATGTAATGATGTCTGTGGCTACATAACCTGCCAAC ACTTAGTCTTATCACACATTTTATTTTAAAATCAATATGTAAAAAATACTAATTTAC TTGGTAGTAATTTAAATTTTTCTGATTATTACTGAGGTTGAATATGTTTTCATATGTTTACTGAATATTCCTGTTAATTTTCTCATGAATTTCAGTTAATGTTTCTGTTGATTT TATTAATTTGTAGTGGTTTTGAAACATATTCTAGAAACCAATATTTTGTCTGTTGTA TGTGTTACAAATATATTTATTTTGTATAGCTTCTTCATATTTAGTACTTTTACAATTT TAACAGTAAAATTAGTTTCATGTTTTATAGCTATAATTATTATAACTTTTAAATAAAT ATTTCCTCAATTAAAATAAAAATGCATTATCCTTAAAAAAAAAAA。

进一步，所述药物为辅助治疗肥胖引起的乳腺癌的药物。

进一步，所述药物还包括药学上可用的载体，所述载体为胆固醇、脂质体、纳米颗粒中的一种或多种。

本发明所述药物以注射的方式给药，注射给药方式包括肌肉注射、静脉注射和皮下注射，所述药物中LncRNA抑制剂的含量为1mg/mL。

肥胖的乳腺癌患者预后更差，生存率更低，LncRNALOC339535在三阴乳腺癌中特异性表达，本发明通过实验发现LncRNALOC339535能诱导小鼠肥胖，通过注射 LncRNA抑制剂能显著抑制小鼠体重增加。本发明提供的LncRNA抑制剂能够抑制 LncRNALOC339535表达，进而用于辅助治疗肥胖引起的乳腺癌。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明所述的LncRNA抑制剂可以显著降低体重的增加，辅助治疗肥胖引起的乳腺癌。本发明所用原料科学合理，制备工艺简单，成本较低，辅助治疗效果较好。

(四)附图说明

图1为LncRNALOC339535的过表达促进了肥胖。

图2为LncRNALOC339535在肥胖的乳腺癌患者中高表达。

图3为LncRNALOC339535抑制剂对小鼠体重增长的抑制作用。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下实例中所用实验动物中野生型小鼠品种为FVB；转基因小鼠是由赛业生物科技公司将LncRNALOC339535基因(SEQ ID NO.2)敲入野生型小鼠FVB构建的转基因小鼠。所用的扩增酶和逆转录酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。所用试剂均为分析纯级试剂。所述高脂饲料中脂肪含量为60％，购自上海帆泊生物技术有限公司。

实施例1、小鼠肥胖模型构建

LncRNALOC339535基因敲入的转基因小鼠分为两组，每组7只，即普通饲料喂养组(ND-KI)和高脂饲料喂养组(HFD-KI)。野生型小鼠也分为两组，每组7只，即普通饲料喂养组(ND-WT)和高脂饲料喂养组(HFD-WT)。10周后，称量体重可以观察到高脂喂养的LncRNALOC339535敲入的转基因小鼠最为肥胖(图1中A和B)。

实施例2、葡萄糖耐受实验

1、小鼠准备：实施例1培养10周后的每组实验小鼠选6只，于实验前一天下午 5点将小鼠换入干净的笼子禁食，禁食16小时至次日9点，禁食期间，小鼠保持正常饮水。

2、次日上午9点，开始葡萄糖耐受实验，称取每只小鼠的体重，并用记号笔在小鼠的尾巴根部标记序号，以便在实验过程中能快速的辨认所测小鼠。

3、空腹基础血糖的测定：将小鼠从笼子中取出，轻放于铁网之上，用剪刀剪去小鼠尾巴末端1-2mm，轻轻挤压小鼠尾巴，让血液富集成一滴，用血糖仪测定空腹血糖，测定值认定为0min的血糖值，操作尽量轻柔，使小鼠不至于过度惊吓。

4、让小鼠适应30mim之后，开始准备腹腔注射葡萄糖。

5、腹腔注射葡萄糖：将小鼠轻轻抓起，按照标准的腹腔注射操作1mL注射器给小鼠注射质量浓度20％葡萄糖溶液(生理盐水配制)。注射的体积根据小鼠的体重决定0.01mL/g，从注射完毕时起开始计时；一般情况下，每只小鼠的操作间隔在1min，这样可以准确地按照所规定时间完成对每只小鼠的血糖测定。

6、在15min,30min,60min,90min,120min按照步骤3的操作测定每只小鼠各个时间点的血糖值。

7、实验完毕后，将每笼小鼠补充上饲料。

葡萄糖耐受实验证实小鼠肥胖模型构建成功，表明LncRNALOC339535敲入的小鼠对葡萄糖的耐受降低(图1中C)。

实施例3：LncRNALOC339535在肥胖的乳腺癌患者中高表达

本实施例选取乳腺癌患者肿瘤样本，收集中山大学肿瘤防治中心的临床样本46例，其中10例为癌旁组织，36例为乳腺癌组织，样本收集均征得患者的知情同意。 Trizol试剂提取总RNA，制备cDNA，实时荧光定量PCR检测LncRNA的表达量。

1、总RNA的提取

选取适量乳腺癌患者的组织加入1ml的Trizol，组织研磨器进行研磨。4℃、12000rpm离心10min，取上清。每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置3min。4℃、12000rpm离心10min，样品分为三层，取上层无色水相至新的1.5ml EP管。

在新管中加入与无色水相等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。4℃、12000rpm离心10min，去上清。加入1ml RNase-free水配置的75％乙醇洗涤沉淀。4℃、8000rpm离心5min，弃上清。室温晾干20min，根据RNA沉淀量，加入适量RNase-free 水，溶解RNA。

2、使用诺唯赞公司反转录试剂盒，将RNA逆转录为cDNA。以此cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR试剂盒检测LncRNALOC339535的表达量。

根据NCBI BLAST设计LncRNALOC339535检测引物(LOC339535 F、 LOC339535 R)及内参引物(18S F、18S R)：

LOC339535 F：5'-AAAACAGTGCCCCCTGTCA-3'，

LOC339535 R：5'-GTTCCACCCTAGTGCACAGG-3'。

18S F：5’-GGACACGGACAGGATTGACA-3’，

18S R：5’-GACATCTAAGGGCATCACAG-3’。

表1、反应体系

荧光定量PCR的条件为：95℃预变性30s，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共40个循环，然后计算分析熔解曲线及循环数Cq值。按照内参18s的Cq 值对各组进行平衡，计算2

实施例4：LncRNA抑制剂抑制体重增长实验

本实施例以实施例1高脂饲料喂养10周的LncRNALOC339535基因敲入小鼠为实验对象，分为2组，每组6只。一组为对照组，不给药：另一组为实验组，给药。

1、小鼠准备：每组实验小鼠数量为6只，先将每只小鼠称重。

2、注射给药：将小鼠轻轻抓起，操作1mL注射器在脂肪垫部位注射LncRNA抑制剂(SEQ ID NO.1，以纳米颗粒为载体，溶剂为水)。按照0.2mg/kg的剂量给药。

3、将小鼠轻轻放回鼠笼，给每笼小鼠补充鼠粮(高脂)和水。

4、隔一天后再次给药，重复步骤1、2、3。共持续14天，给药7次。

图3为注射LncRNA抑制剂后小鼠体重变化，结果显示通过注射LncRNA抑制剂能显著抑制小鼠体重增加。

本发明所述的LncRNA抑制剂可以显著降低体重的增加，适用于肥胖引起的乳腺癌辅助治疗。本发明所用原料科学合理，制备工艺简单，成本较低，辅助治疗效果较好。

上述实施例的说明用于理解本发明的方法及主要思想。应当说明，对于本领域的技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行一些改进，这些改进也在本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种LncRNA抑制剂在制备减肥药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gaccagtgtt aactgcttcc tgatgacag 29

<210> 2

<211> 1540

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

tggaattcaa gctgtgggtg agaagctctc tagcagggac tctgacctta tggaggatcg 60

ctgtttcccc catttttcct tttcacccaa aaaagtcctg cttctctcac ccttcaaaca 120

gcctgtgagc ctaaattttt gtggccatgg gacagacaag gaccccgtct tcagctgaac 180

taaggaaaag tcctgcgaca tctttggtac gcactgtgga ggctctacaa acagccatca 240

aactccaacc agtcacccaa ccagagcctc tgaggatggc cccttctgcg gggaaccctt 300

acatgggcct ctgactgatg cttccccaaa acagtgcccc ctgtcatcag gaagcagtta 360

acactggtct tcattcttac gcttatcctt attctaacag cagttatatg tacttcttta 420

gacgggggaa taagacagcc aggtgggagg gggtctctgg aaaactccat ctggcctgtg 480

cactagggtg gaacctcagg aagttgatga catttgtagc tgggagcagc ctggcccctc 540

ctcttcctgt gtggaacctg aaattccacc ggcttggcag gaagcgctct agcagggact 600

ccggctttgc agagcatccc tgtttccccg tttttccctt ttcacccaat aaaaccctgc 660

ttcactcacc cttcaaacca tctgcaagcc taaatttttg tggctgtggg acggacaaag 720

atgcctttag ctgactgagg aaaagtcctg caacacaggt atcactgcac atttataata 780

ttgtttctct gttttaaacc ttgtataaat aggaaaatat tgtatataat ctcaagcaga 840

ttgttttctt ttgaaaagta ttcatatatg ttaaagatgt agttctagtt cattcatttt 900

ctctgttttg actcttttat acatatacta cagctcattt atccattttc ctactgttgc 960

aacatagatt gcttataatt cttctaatta ctaacaatgc tggtatgaaa ttgttgtgta 1020

tatctctggt agatatgtgt tatttctttt ttgcaatgct agattataat tatttgtcta 1080

aggtggagat taccagggta gactcgctct ggccgtatgt aatgatgtct gtggctacat 1140

aacctgccaa cacttagtct tatcacacat tttattttaa aatcaatatg taaaaaatac 1200

taatttactt ggtagtaatt taaatttttc tgattattac tgaggttgaa tatgttttca 1260

tatgtttact gaatattcct gttaattttc tcatgaattt cagttaatgt ttctgttgat 1320

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gtgttacaaa tatatttatt ttgtatagct tcttcatatt tagtactttt acaattttaa 1440

cagtaaaatt agtttcatgt tttatagcta taattattat aacttttaaa taaatatttc 1500

ctcaattaaa ataaaaatgc attatcctta aaaaaaaaaa 1540