克隆性增加的骨髓浸润淋巴细胞及其用途

领域

本公开通常涉及对于治疗癌症具有特异性的骨髓浸润淋巴细胞(MIL)及其使用方法。

背景

癌症为死亡的主要原因，并且新疗法仍然是临床的重点。骨髓浸润淋巴细胞(MIL)为激活和扩增骨髓T细胞的产物。骨髓为免疫系统中的一个特化小生境，其富含抗原经历的中央记忆型T细胞。已经显示MIL可赋予癌症患者免疫学上可测量的临床益处。还显示骨髓微环境在患有实体瘤比如乳腺癌、液体瘤、胰腺癌和卵巢癌等以及血液学癌症比如多发性骨髓瘤的患者中具有肿瘤抗原特异性T细胞。

发明概述

本发明的一个方面提供一种组合物，其包含含有多种对异质性抗原群体具有亲和力的TCRβ的骨髓浸润淋巴细胞群体。

本发明的另一方面提供一种用于以骨髓浸润淋巴细胞治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 在低氧环境中使得自患有癌症的受试者的骨髓样品与抗CD3抗体和抗CD28抗体一起培养以产生低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞；(b) 在常氧环境中培养低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞以产生治疗性的激活的骨髓浸润淋巴细胞，该骨髓浸润淋巴细胞包含多种对异质性抗原群体具有亲和力的TCRβ；和(c) 将治疗性的激活的骨髓浸润淋巴细胞施用于患有癌症的受试者。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中低氧环境的含氧量为约1%-约3%的氧。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中在IL-2的存在下培养淋巴细胞。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中在存在IL-2的情况下进行在常氧环境中培养低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述骨髓样品在低氧环境中培养约24小时。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述骨髓样品在低氧环境中培养约2天。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述骨髓样品在低氧环境中培养约3天。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述骨髓样品在低氧环境中培养约2至约5天。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述低氧环境为约1%至约2%的氧。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞在常氧环境中培养约2至约12天。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞在常氧环境中培养约6天。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞在常氧环境中培养约9天。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其进一步包括在步骤(a)之前，从患有癌症的受试者中取出骨髓样品的步骤。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述抗CD3抗体和所述抗CD28抗体在珠上结合。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中癌症为一种或多种本文所述的癌症。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中癌症选自骨髓瘤；肺癌；前列腺癌；乳腺癌；结肠癌；皮肤癌；肉瘤和癌，其选自纤维肉瘤(fibrosarcoma)、粘液肉瘤(myxosarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)和骨肉瘤(osteosarcoma)；滑膜瘤(synovioma)；间皮瘤(mesothelioma)；尤因瘤(Ewing's tumor)；平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)；横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)；淋巴恶性肿瘤(lymphoidmalignancy)；胰腺癌；卵巢癌；肝细胞癌；鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)；基底细胞癌(basal cell carcinoma)；腺癌(adenocarcinoma)；汗腺癌(sweat glandcarcinoma)；甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma)；甲状腺乳头状癌(papillarythyroid carcinoma)；嗜铬细胞瘤(pheochromocytomas)；皮脂腺癌(sebaceous glandcarcinoma)；乳头状癌(papillary carcinoma)；乳头状腺癌(papillaryadenocarcinomas)；髓样癌(medullary carcinoma)；支气管癌(bronchogeniccarcinoma)；肾细胞癌(renal cell carcinoma)；肝癌(hepatoma)；胆管癌(bile ductcarcinoma)；绒毛膜癌(choriocarcinoma)；威尔姆斯瘤(Wilms' tumor)；宫颈癌(cervicalcancer)；睾丸肿瘤(testicular tumor)；精原细胞瘤(seminoma)；膀胱癌(bladdercarcinoma)；黑色素瘤(melanoma)；CNS肿瘤，其选自神经胶质瘤(glioma)、脑干神经胶质瘤(brainstem glioma)、混合性神经胶质瘤(mixed gliomas)、胶质母细胞瘤(glioblastoma)、星形细胞瘤(astrocytoma)、CNS淋巴瘤(CNS lymphoma)、生殖细胞瘤(germinoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、神经鞘瘤(Schwannoma)、颅咽管瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤(ependymoma)、松果体瘤(pinealoma)、血管母细胞瘤(hemangioblastoma)、听神经瘤(acoustic neuroma)、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、脑膜瘤(menangioma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)和脑转移瘤(brain metastases)，及其组合。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中癌症为选自以下的血液学或血源性癌症：白血病(leukemia)、急性白血病(acute leukemias)、急性淋巴细胞性白血病(acutelymphocytic leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia)、急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia)、成髓细胞性(myeloblastic)、早幼粒细胞性(promyelocytic)、髓单核细胞性(myelomonocytic)、单核细胞性红白血病(monocyticerythroleukemia)、慢性白血病(chronic leukemias)、慢性髓细胞性(chronicmyelocytic) (粒细胞性(granulocytic))白血病、慢性髓性白血病(chronic myelogenousleukemia)和慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)、真性红细胞增多症(polycythemia vera)、淋巴瘤(lymphoma)、霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链病(heavy chain disease)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia)、脊髓发育不良(myelodysplasia)及其组合。

本发明的另一方面提供一种用于以治疗性的激活的骨髓浸润淋巴细胞治疗患有癌症的受试者的方法，该骨髓浸润淋巴细胞包含含有对异质性抗原群体具有亲和力的多种TCRβ的骨髓浸润淋巴细胞群体，所述方法包括以下步骤：(a) 在约1%-约2%氧的低氧环境中，使得自患有癌症的受试者的骨髓样品与抗CD3/抗CD28珠一起培养约2-约5天以产生低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞，该骨髓浸润淋巴细胞包含含有多种对异质性抗原群体具有亲和力的TCRβ的骨髓浸润淋巴细胞群体；(b) 在存在IL-2的情况下，在约21%氧的常氧环境中培养低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞约2-约12天，以产生治疗性的激活的骨髓浸润淋巴细胞；和(c) 将治疗性的激活的骨髓浸润淋巴细胞施用于患有癌症的受试者。

本发明的另一方面提供一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括将包含如上所述的组合物的药物组合物施用于受试者。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中骨髓浸润淋巴细胞群体得自患有癌症的受试者。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中癌症特异性骨髓浸润淋巴细胞对于待治疗的受试者是自体的。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述癌症特异性骨髓浸润淋巴细胞对于待治疗的受试者是同种异体的。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述骨髓浸润淋巴细胞是低氧激活的。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述骨髓浸润淋巴细胞是低氧激活的和常氧激活的。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中所述药物组合物通过胃肠外施用、腹膜内或肌内施用来施用。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中施用于受试者的约75%至约100%的骨髓浸润淋巴细胞表达CD3。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中施用于受试者的约80%至约100%的骨髓浸润淋巴细胞表达CD3。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中施用于受试者的约85%至约100%的骨髓浸润淋巴细胞表达CD3。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中施用于受试者的约90%至约100%的骨髓浸润淋巴细胞表达CD3。

本发明的另一方面提供如上所述的方法，其中施用于受试者的组合物或MIL中存在的CD4

本发明的另一方面提供一种组合物，其包含从患有癌症的患者中分离的低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞群体，所述群体包含含有多种对异质性抗原群体具有亲和力的TCRβ的骨髓浸润淋巴细胞群体，其中约75%至约100%的低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞群体表达CD3。

本发明的另一方面提供如上所述的组合物，其中约80%至约100%的低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞群体表达CD3。

本发明的另一方面提供如上所述的组合物，其中约85%至约100%的低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞群体表达CD3。

本发明的另一方面提供如上所述的组合物，其中约90%至约100%的低氧激活的骨髓浸润淋巴细胞群体表达CD3。

本发明的另一方面提供如上所述的组合物，其中组合物中存在的CD4

本发明的另一方面提供如上所述的组合物，其中所述细胞群体可通过以下步骤从骨髓样品获得，所述骨髓样品得自患有癌症的受试者：(a)在约1%至约3%氧的低氧环境中，使所述骨髓样品与抗CD3抗体和抗CD28抗体一起培养，以产生激活的骨髓浸润淋巴细胞；和(b)在常氧环境中，在IL-2的存在下，培养激活的骨髓浸润淋巴细胞，以产生所述组合物。

本发明的另一方面提供如上所述的组合物，其中MIL为癌症特异性的。

本发明的另一方面提供一种预测哪些患者对MIL输注有反应的方法，其包括：A)输注后从患者中分离MIL；B) 确定输注后分离的MIL的克隆性；C) 如果与来自同一患者的治疗前骨髓的克隆性相比较克隆性增加，则继续使用MIL进行的成功治疗。

本发明的另一方面提供一种预测哪些患者对MIL输注有反应的方法，其包括：A)测量基线输注前骨髓的克隆性；B) 测量输注后骨髓的克隆性；C) 如果与输注前骨髓相比较克隆性在输注后增加，则继续使用MIL进行的成功治疗。

本发明的另一方面提供一种预测哪些患者对MIL输注有反应的方法，其包括：A)测量基线输注前血液的克隆性；B) 测量输注后血液的克隆性；C) 如果与输注前血液相比较克隆性在输注后增加，则继续使用MIL进行的成功治疗。

通过结合附图阅读以下根据本发明构造的实施方案的详述，本发明的仍然其他目的、特征和伴随优势对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图简述

图1：图1显示I期临床试验设计和样品收集时间表。带圆圈的星号代表对收集的骨髓和血液样品进行ImmunoSEQ程序的时间点。

图2：图2显示肿瘤抗原特异性MIL的IFNγ捕获分离。

图3：图3显示克隆频率分布。计算方法在实施例3中进行描述。

图4：图4显示immunoSEQ数据的汇总。测序成功，并且所有样品均通过了质量控制。抗原特异性分选的T细胞样品具有多于100个T细胞，和平均多于1000个T细胞。生产性模板等于样本中T细胞的总数。生产性重排等于样本中独特CDR3序列的总数。

图5A和5B：图5A和5B显示对MIL中抗原特异性TCRβ CDR3和T细胞的追踪。报告每个患者的MIL产物中确定为肿瘤抗原特异性的独特TCRβ CDR3 (图5A)和T细胞(图5B)百分比。据估计MIL中约0.3-1.4%的独特TCRβ CDR3序列和2-15%的T细胞为肿瘤抗原特异性的。

图6：图6显示MIL产物中肿瘤抗原特异性T细胞的频率与临床抗肿瘤反应不相关。使用Wilcoxon秩和检验，在临床反应者“CR”和进展性疾病“PD”之间比较每个患者的MIL产物中确定为肿瘤抗原特异性的独特TCRβ CDR3 (左)和T细胞(右)的百分比。P值> 0.05。

图7：图7显示骨髓和血液中MIL频率的追踪。显示在输注前和后BM和PBMC中追踪的MIL的累积频率。CR用实线表示和PD用虚线表示。在BM和PBMC中观察到相似的频率和动力学。CR以MIL和CD8-Ag-spec-MIL的最低治疗前频率开始。与PD相比较，CR中观察到MIL频率的增加更大。

图8：图8显示MIL频率的持续增加与临床抗肿瘤反应相关。显示每个患者在BM和PBMC中MIL频率的治疗后倍数变化。CR用实线表示和PD用虚线表示。CR的MIL频率更持续地增加。在第360天，MIL频率的变化完美地将CR和PD分开(红色框)。

图9和10：图9和10显示MIL中的肿瘤抗原特异性T细胞库为高度多克隆的。使用t检验在CR和PD之间比较治疗前BM (“pre-BM”)、MIL、CD4+和CD8+肿瘤抗原特异性MIL的克隆性(*p<0.05) (参见图9)。对于所有6个患者，MIL均比pre-BM更加多克隆。与PD相比较，pre-BM在CR中更加多克隆。与所有其他MIL相比较，显示CD4+和CD8+肿瘤抗原特异性MIL的TCRβ V基因家族基因使用(参见图10)。在抗原特异性MIL和其他MIL之间在基因使用方面没有明显差异。

图11：图11显示对骨髓和血液中克隆性的追踪。在治疗前和后BM (左)和PBMC(右)中追踪克隆性。CR用实线表示和PD用虚线表示。BM和PBMC的趋势一致。在所有3个CR和仅1/3 PD中克隆性增加。CR受试者的治疗前克隆性较低(红色框)。

图12：图12显示克隆性的持续增加与临床抗肿瘤反应相关。显示每个患者在BM(左)和PBMC (右)中克隆性的治疗后倍数变化。CR用实线表示和PD用虚线表示。直至第360天所有3个CR均保持克隆性增加(红色框)，而PD则返回到基线或降低到低于基线。

图13：图13显示在骨髓和血液中扩增中的T细胞克隆型的追踪。在上图中，显示大多数扩增中的克隆为CD8-Ag-spec-MIL。在底部图中，显示极少数扩增中的克隆为CD8-Ag-spec-MIL。对于两个患者(一个CR和一个PD)，治疗前BM的克隆型频率(两图的X轴)对比治疗后60天的BM的克隆型频率(两图的Y轴)。显著扩增的克隆型(DeWitt等人 J. Virol. 2015;89(8):4517-26)以黄色阴影显示。概述了CD8+肿瘤抗原特异性克隆型。

图14：图14显示在治疗前的骨髓和血液中无法检测到的扩增中的肿瘤抗原特异性T细胞克隆型的追踪。显示每个患者在每个治疗后的时间点，治疗前无法检测到的扩增的肿瘤抗原特异性克隆型的数量。CR用绿线表示和PD用黑线表示。这些可能是在治疗后扩增的罕见的肿瘤抗原特异性克隆型。在2/3 CR中见到更多数量的这些克隆型。

详述

MIL为从骨髓(BM)中扩增的自体T细胞产物，被开发为用于血液学和实体恶性肿瘤两者的新型细胞疗法。在一项评估晚期多发性骨髓瘤患者的MIL的I期试验中，22个患者中有6个(27.3%)达到了完全缓解(CR)。免疫分析表明，在BM中建立持续性肿瘤抗原特异性T细胞与改善临床反应相关(Noonan K.A., Huff C.A., Davis J., Lemas M.V., FiorinoS., BitzanJ., Ferguson A., Emerling A., Borrello I. Adoptive transfer ofactivated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumorimmunity in the bone marrow in multiple myeloma. Sci. Transl. Med. 2015; 7:288ra78, 其通过参考结合)。

在MIL内鉴定出T细胞克隆型，包括特异性识别肿瘤抗原的子集；追踪和比较输注之前和之后其在血液和BM中的频率；和在临床反应者和非反应者之间比较T细胞库特征，比如克隆性。

TCRβ CDR3使用Adaptive Biotechnologies的immunoSEQ测定进行测序，并用于鉴定和追踪MIL T细胞克隆型。将immunoSEQ测定用于来自I期研究的6个患者(3个获得CR的临床反应者和3个疾病进展的非反应者)的11份样本(在治疗前和输注后60、180和360天收集的未分选的MIL、IFNγ捕获-分选的肿瘤抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞以及血液和BM)。

当在BM和血液中追踪MIL T细胞克隆型的累积频率时，在反应者和非反应者之间存在显著差异。反应者在基线处具有较低的克隆型频率，但在BM和血液两者中在克隆型频率上均显示出更大且更持续的增加。在第360天，两个区室中MIL的频率自基线的倍数变化将反应者与非反应者分开。

通常，MIL中的T细胞库为高度多克隆的，并且在肿瘤抗原特异性T细胞中没有富集特异性TCRβ可变基因，表明靶向多种抗原。在所有6个患者中，MIL比扩增前的BM更加多克隆。然而，反应者的起始库更加多克隆，并且反应者的克隆性的输注后增加更大且更持续。在第360天，所有3个反应者的克隆性均保持增加，而所有3个非反应者的克隆性均返回到基线或者更低。

这些数据提供对MIL中T细胞克隆型库以及在克隆水平上治疗之后库如何演变的第一观察。数据还表明MIL内肿瘤抗原特异性T细胞具有高度多克隆性，这可提供针对异质性肿瘤的优势。

如本文使用的，且除非另有说明，否则术语“约”预期意指它修饰的值的± 5%。因此，约100意指95至105。另外，术语“约”修饰一系列术语中的术语，例如“约1、2、3、4或5”，应理解术语“约”修饰列表的每个成员，使得“约1、2、3、4或5”可以理解为意指“约1、约2、约3、约4或约5”。对于由术语“至少”或其它量化修饰语(例如但不限于“小于”、“大于”等等)修饰的列表也是如此。

如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(a)”、“一钟(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。

如本文使用的，术语“包含(comprising)”(以及任何形式的包含，例如“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有，例如，“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)、或“含有(containing)”(以及任何形式的含有，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放性的，并且不排除另外的未叙述的要素或方法步骤。叙述术语“包含”的任何组合物或方法也应理解为还将此类组合物描述为包括所叙述的组分或要素、由其组成或基本上由其组成。

如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”或“治疗(treating)”意指两种治疗性处理，其中目的是减慢(减轻)不需要的生理状况、病症或疾病，或者获得有益或所需的临床结果。为了本文描述的实施方案的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于症状的减轻；状况、病症或疾病程度的缩小；状况、病症或疾病的稳定(即，不恶化)状态；状况、病症或疾病进展的发作延迟或减慢；可检测或不可检测的状况、病症或疾病状态的改善，或缓解(部分或全部)；患者不一定能分辨的至少一个可测量的身体参数的改善；或者状况、病症或疾病的增强或改善。因此，“癌症的治疗”或“治疗癌症”意指减轻或改善与癌症或本文所述的任何其它状况有关的任何主要现象或继发症状的活动。在一些实施方案中，待治疗的癌症是本文所述的癌症之一。

如本文使用的，术语“受试者”可以与术语“患者”互换使用。受试者可以是哺乳动物，例如犬、猫、猴、马、牛等等。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者已被诊断有癌症。在一些实施方案中，受试者被认为患有癌症。在一些实施方案中，该受试者被怀疑患有癌症。

如本文使用的，当术语“表达”涉及细胞表面受体，例如但不限于CD3、CD4和CD8时，它也可以被称为细胞对于该标记物是阳性的。例如，表达CD3的细胞也可以被称为CD3阳性的(CD3

如本文使用的，术语“癌症”定义为特征在于异常细胞的快速且不受控制的生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，或者通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部分。可用本文提供的MIL治疗的癌症的实例包括(但不限于)骨髓瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、皮肤癌、肉瘤和癌(包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤及其他肉瘤)、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS肿瘤(比如神经胶质瘤(比如脑干神经胶质瘤和混合性神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)等。

本文提供的组合物和方法也可用于血液学癌症。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(比如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓性白血病和成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(比如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。

“有效量”或“治疗有效量”在本文可互换使用，并且指有效达到特定生物学结果的如本文所述的化合物、制剂、材料或组合物的量。此类结果可以包括但不限于如通过本领域合适的任何手段确定的病毒感染的抑制。

如本文使用的，“骨髓浸润淋巴细胞”或“MIL”是免疫细胞的亚群，并且例如在美国专利号9,687,510中描述，所述美国专利特此通过参考以其全部结合。MIL与外周淋巴细胞(PBL)明显不同。例如，MIL比PBL更容易扩增，上调激活标记物至更大的程度，维持更多的偏向Vβ库，运输至骨髓，且最重要的是，具有明显更大的肿瘤特异性。MIL抗骨髓瘤免疫力与临床反应直接相关；然而，输注后先前没有观察到体内T细胞扩增或持续的临床反应。在一些实施方案中，MIL可以例如通过使其与抗CD3/抗CD-28珠一起在低氧条件下温育而激活，如本文所述。在一些实施方案中，在低氧条件下生长MIL也在美国专利号9,687,510和国际申请号WO2016/037054中描述，这二者均通过参考以其全部结合至本文中。

在一些实施方案中，制备MIL的方法可以包括从来自受试者的骨髓、淋巴细胞和/或骨髓浸润淋巴细胞中取出细胞；在低氧环境中温育细胞，从而产生激活的MIL。在一些实施方案中，受试者患有癌症。如本文所述，细胞也可以在抗CD3/抗CD28抗体和细胞因子的存在下被激活。

低氧环境可包含少于约21%的氧，比如少于约20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%或少于约3%的氧。例如，低氧环境可包含约0%的氧-约20%的氧，比如约0%的氧-约19%的氧、约0%的氧-约18%的氧、约0%的氧-约17%的氧、约0%的氧-约16%的氧、约0%的氧-约15%的氧、约0%的氧-约14%的氧、约0%的氧-约13%的氧、约0%的氧-约12%的氧、约0%的氧-约11%的氧、约0%的氧-约10%的氧、约0%的氧-约9%的氧、约0%的氧-约8%的氧、约0%的氧-约7%的氧、约0%的氧-约6%的氧、约0%的氧-约5%的氧、约0%的氧-约4%的氧或约0%的氧-约3%的氧。在一些实施方案中，低氧环境包含约1% -约7%的氧。在一些实施方案中，低氧环境为约1% -约2%的氧。在一些实施方案中，低氧环境为约0.5% -约1.5%的氧。在一些实施方案中，低氧环境为约0.5% -约2%的氧。低氧环境可包含约20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或约0%的氧。在一些实施方案中，低氧环境包含约7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的氧。

在低氧环境中温育MIL可以包括例如在组织培养基中温育MIL至少约1小时，例如至少约12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、60小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或甚至至少约14天。温育可以包括使MIL温育约1小时至约30天，例如约1天至约20天、约1天至约14天、或约1天至约12天。在一些实施方案中，在低氧环境中温育MIL包括在低氧环境中温育MIL约2天至约5天。该方法可以包括在低氧环境中温育MIL约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，该方法包括在低氧环境中温育MIL约3天。在一些实施方案中，该方法包括在低氧环境中温育MIL约2天至约4天。在一些实施方案中，该方法包括在低氧环境中温育MIL约3天至约4天。

在一些实施方案中，低氧激活的MIL然后在常氧环境中培养，以产生治疗性的激活骨髓浸润淋巴细胞。在一些实施方案中，常氧环境可以包括至少约21%的氧。在一些实施方案中，常氧环境可以包括约，例如10%的氧至约30%的氧、约15%的氧至约25%的氧、约18%的氧至约24%的氧、约19%的氧至约23%的氧、或约20%的氧至约22%的氧。在一些实施方案中，常氧环境包括约21%的氧。

在一些实施方案中，在IL-2或其它细胞因子的存在下培养MIL。在一些实施方案中，在IL-2的存在下，在常氧条件下培养MIL。在一些实施方案中，其它细胞因子可以是IL-7、IL-15、IL-9、IL-21或其任何组合。在一些实施方案中，可以在包含一种或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7和/或IL-15或其任何合适组合的细胞培养基中培养MIL。每种细胞因子的合适浓度或细胞因子总浓度的说明性实例包括但不限于约25 IU/mL、约50 IU/mL、约75 IU/mL、约100 IU/mL、约125 IU/mL、约150 IU/mL、约175 IU/mL、约200 IU/mL、约250 IU/mL、约300 IU/mL、约350 IU/mL、约400 IU/mL、约450 IU/mL、或约500 IU/mL或其任何中间量的细胞因子。在一些实施方案中，IL-2、IL-1和/或IL-15或其任何组合各自或总共以约100 IU/mL培养细胞。在一些实施方案中，细胞培养基包含各自或总共约250 IU/mL的IL-2、IL-1和/或IL-15或其任何组合。

在常氧环境中温育MIL可以包括使MIL温育至少约1小时，例如至少约12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、60小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或甚至至少约14天。温育可以包括使MIL温育约1小时至约30天，例如约1天至约20天、约1天至约14天、约1天至约12天、或约2天至约12天。

在一些实施方案中，通过从受试者中提取骨髓样品，并且如本文所述培养/温育细胞，而获得MIL。在一些实施方案中，将骨髓样品离心以去除红细胞。在一些实施方案中，骨髓样品不经受血浆分离置换法。在一些实施方案中，骨髓样品不包含外周血淋巴细胞(“PBL”)，或骨髓样品基本上不含PBL。这些方法选择与已被称为TIL的细胞不同的细胞。因此，MIL不是TIL。TIL可以通过本领域技术人员已知的方法进行选择，并且可以用本文所述的核酸分子转染或感染，使得TIL可以表达本文所述的嵌合跨膜蛋白。在一些实施方案中，与MIL的总数相比，骨髓样品包含小于10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的PBL。在一些实施方案中，样品不含PBL。

在一些实施方案中，还通过与针对CD3和CD28的抗体一起培养来激活细胞。这可以例如通过使细胞与商购可得或可以由本领域技术人员制备的抗CD3/抗CD28珠一起温育来执行。然后可以将细胞在板、瓶或袋中铺板。低氧条件可以通过用95%氮和5% CO2气体混合物冲洗低氧室或细胞培养袋3分钟来实现。这可以导致容器中例如1-2%或更少的O

在一些实施方案中，将激活的MIL和/或治疗性的激活的MIL施用于患有或怀疑患有癌症的受试者。在一些实施方案中，低氧激活的MIL和/或治疗性的激活的MIL由来自患有或怀疑患有癌症的受试者的骨髓样品产生，然后施用于同一受试者以治疗癌症。在一些实施方案中，MIL对于受试者是同种异体的。

在一些实施方案中，提供用于诱导在治疗之前频率非常低并且通过immunoSEQ无法检测到的肿瘤抗原特异性T细胞的扩增的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将具有高度克隆性的MIL施用于受试者，从而增加在治疗之前频率非常低并且通过immunoSEQ无法检测到的抗原特异性T细胞。

在一些实施方案中，MIL可以在药物制剂或药物组合物中施用。包含癌症特异性MIL的药物组合物可以进一步包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。组合物可以配制用于胃肠外施用，例如，血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌内施用。在一些实施方案中，MIL和/或组合物通过胃肠外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌内施用来施用。组合物也可以直接施用到肿瘤内。在一些实施方案中，组合物经静脉内施用。

在一些实施方案中，无论组合物是溶液、悬浮液还是其它类似形式，它们都可以包括下述中的一种或多种：DMSO，无菌稀释剂例如注射用水，盐水溶液，优选生理盐水，林格氏溶液，等渗氯化钠，不挥发性油，例如可以充当溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯，聚乙二醇，丙三醇，丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调整张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。

在一些实施方案中，受试者可以用连同或不连同氟达拉滨的环磷酰胺预条件化。在US 9,855,298中提供了一个此类实例，所述专利特此通过参考结合。另一个非限制性实例是施用氟达拉滨(每天静脉内30 mg/m2，共4天)和环磷酰胺(从氟达拉滨的第一个剂量开始，每天静脉内500 mg/m2，共2天)。在施用后，MIL可以在氟达拉滨完成后2至14天施用。在一些实施方案中，环磷酰胺以约500至约600 mg/m2的剂量施用2-3天。

在一些实施方案中，施用的药物组合物包含如本文提供的癌症特异性MIL。本文还提供了此类MIL的组合物。在一些实施方案中，癌症特异性MIL是低氧激活的。在一些实施方案中，癌症特异性MIL是低氧激活/常氧激活的MIL。癌症特异性MIL是可以特异性靶向受试者中的癌症的MIL。

在一些实施方案中，组合物包含CD3阳性的癌症特异性MIL群体。在一些实施方案中，至少约或至少40%的MIL是CD3阳性的。在一些实施方案中，约或至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%或89% MIL是CD3阳性的。在一些实施方案中，至少或约80%的MIL是CD3阳性的。在一些实施方案中，约40%至约100%的MIL是CD3阳性的。在一些实施方案中，约45%至约100%、约50%至约100%、约55%至约100%、约60%至约100%、约65%至约100%、约70%至约100%、约75%至约100%、约80%至约100%、约85%至约100%、约86%至约100%、约87%至约100%、约88%至约100%、或约90%至约100%的MIL是CD3阳性的(表达CD3)。

在一些实施方案中，组合物包含不表达CD3的MIL群体，或例如相对于来自表达CD3的MIL群体的MIL表达水平，表达低水平的CD3的MIL群体。

在一些实施方案中，组合物包含表达干扰素γ(“IFNγ”)的MIL群体，即其中表达IFNγ的MIL群体中的每个细胞是表达IFNγ的骨髓浸润淋巴细胞，例如，如通过流式细胞术检测的。例如，组合物中至少约2%的细胞可以是表达IFNγ的MIL，或者至少约2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%或甚至至少约18%的MIL表达IFNγ。在一些实施方案中，约2%至约100%的MIL表达IFNγ，例如约2%至约100%、约3%至约100%、约4%至约100%、约5%至约100%、约6%至约100%、约7%至约100%、约8%至约100%、约9%至约100%、约10%至约100%、约11%至约100%、约12%至约100%、约13%至约100%、约14%至约100%、约15%至约100%、约16%至约100%、约17%至约100%、或甚至约18%至约100%的MIL。在一些实施方案中，组合物包含不表达IFNγ的MIL群体，例如如通过流式细胞术检测的，或表达低水平的IFNγ的MIL群体，即相对于来自表达IFNγ的MIL群体的MIL表达水平。

在一些实施方案中，组合物包含表达CXCR4的MIL群体。例如，至少约98%的MIL表达CXCR4，例如至少约98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、或甚至至少约99.7%的MIL。在一些实施方案中，约98%至约100%可以是表达CXCR4的MIL，例如组合物中至少约98.1%至约100%、约98.2%至约100%、约98.3%至约100%、约98.4%至约100%、约98.5%至约100%、约98.6%至约100%、约98.7%至约100%、约98.8%至约100%、约98.9%至约100%、约99.0%至约100%、约99.1%至约100%、约99.2%至约100%、约99.3%至约100%、约99.4%至约100%、约99.5%至约100%、约99.6%至约100%、或甚至约99.7%至约100%的MIL。在一些实施方案中，组合物包含不表达CXCR4的MIL群体，例如如通过流式细胞术检测的，或表达低水平的CXCR4的MIL群体，即相对于来自表达CXCR4的MIL群体的MIL表达水平。

表达CD4的MIL群体可以包含表达4-1BB的多个MIL。例如，组合物中至少约21%的细胞可以是来自表达4-1BB的多个MIL的MIL，例如组合物中至少约22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%或甚至至少约43%的细胞。在一些实施方案中，组合物中约21%至约100%的细胞可以是来自表达4-1BB的多个MIL的MIL，例如组合物中约22%至约100%、约23%至约100%、约24%至约100%、约25%至约100%、约26%至约100%、约27%至约100%、约28%至约100%、约29%至约100%、约30%至约100%、约31%至约100%、约32%至约100%、约33%至约100%、约34%至约100%、约35%至约100%、约36%至约100%、约37%至约100%、约38%至约100%、约39%至约100%、约40%至约100%、约41%至约100%、约42%至约100%、或甚至约43%至约100%的细胞。

组合物可以包含表达CD8的MIL群体。表达CD8的MIL群体可以包含表达CXCR4的多个MIL。

表达CD8的MIL群体可以包含表达4-1BB的多个MIL。例如，组合物中至少约21%的细胞可以是来自表达4-1BB的多个MIL的MIL，例如组合物中至少约8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%或甚至至少约21%的细胞。在一些实施方案中，组合物中约2%至约100%的细胞可以是来自表达4-1BB的多个MIL的MIL，例如组合物中约8%至约100%、约9%至约100%、约10%至约100%、约11%至约100%、约12%至约100%、约13%至约100%、约14%至约100%、约15%至约100%、约16%至约100%、约17%至约100%、约18%至约100%、约19%至约100%、约20%至约100%、或甚至约21%至约100%的细胞。

在一些实施方案中，组合物包含表达4-1BB的MIL群体。例如，组合物中至少约21%的细胞可以是来自表达4-1BB的MIL群体的MIL，例如组合物中至少约22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%或甚至至少约43%的细胞。在一些实施方案中，组合物中约21%至100%的细胞可以是来自表达4-1BB的MIL群体的MIL，例如组合物中约22%至约100%、约23%至约100%、约24%至约100%、约25%至约100%、约26%至约100%、约27%至约100%、约28%至约100%、约29%至约100%、约30%至约100%、约31%至约100%、约32%至约100%、约33%至约100%、约34%至约100%、约35%至约100%、约36%至约100%、约37%至约100%、约38%至约100%、约39%至约100%、约40%至约100%、约41%至约100%、约42%至约100%、或甚至约43%至约100%的细胞。在一些实施方案中，组合物包含不表达4-1BB的MIL群体，例如如通过流式细胞术检测的，或表达低水平的4-1BB的MIL群体，即相对于来自表达4-1BB的MIL群体的MIL表达水平。

在一些实施方案中，组合物包含表达CD4的MIL。

在一些实施方案中，组合物包含表达CD8的MIL。

在一些实施方案中，组合物包含表达CD4的MIL。在一些实施方案中，组合物包含表达CD8的MIL。在一些实施方案中，组合物中存在的CD4

组合物可以包含表达CD8的MIL群体。表达CD8的MIL群体可以包含表达CXCR4的多个MIL。

在一些实施方案中，组合物包含表达CD4的MIL群体。表达CD4的MIL群体可以包含表达CXCR4的多个MIL。

MIL可以单独或彼此组合地表达如本文所述的不同因子或表面受体。因此，例如，MIL可以是CD3+、CD4+和CD8+的。此类细胞也可以表达IFNγ。对于本文提供的各种因子或受体，细胞也可以是阳性或阴性的。

在一些实施方案中，提供了用于预防或治疗受试者中的癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用本文所述的组合物之一，例如但不限于如本文提供的癌症特异性MIL。在一些实施方案中，组合物如本文提供的那样施用。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的任何一种组合物。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的癌症特异性MIL。在一些实施方案中，MIL是激活的。在一些实施方案中，如本文描述和本文提及的，MIL是低氧激活的。在一些实施方案中，如本文描述和本文提及的，MIL在低氧条件下随后在常氧条件下培养。在一些实施方案中，从得自患有癌症的受试者的骨髓样品获得或提取MIL。在一些实施方案中，MIL对于待治疗的受试者是同种异体的。在一些实施方案中，该方法包括在约1%至约3%氧的低氧环境中，使来自受试者的骨髓样品与抗CD3抗体和抗CD28抗体一起培养，以产生激活的骨髓浸润淋巴细胞；并且(b)在常氧环境中，在IL-2的存在下，培养激活的骨髓浸润淋巴细胞，以产生组合物。然后可以将组合物施用于患有癌症的受试者。

本文提供的MIL还可被改造以进一步表达嵌合抗原受体，其也可称为“CAR”。这种CAR的实例为本领域已知的。CAR可用于进一步向癌症特异性MIL增加另外的抗原特异性。

实施例

以下实施例说明而不是限制本文所述的组合物和方法。本领域技术人员已知的其它合适的修改和适应在下述实施方案的范围内。

实施例1：TCRβ CDR3测序和分析.

TCRβ CDR3使用Adaptive Biotechnologies的immunoSEQ测定进行测序，并用于鉴定和追踪MIL T细胞克隆型。将immunoSEQ测定用于来自I期研究的6个患者(3个获得CR的临床反应者和3个疾病进展的非反应者)的11份样本(在治疗前和输注后60、180和360天收集的未分选的MIL、IFNγ捕获-分选的肿瘤抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞以及血液和BM) (参见图1)。

实施例2：肿瘤抗原特异性MIL的IFNγ捕获分离

将MIL产物与CFSE标记的自体BMMC一起培养，所述自体BMMC用SW780膀胱癌细胞系裂解产物(膀胱癌裂解产物)、NIH929和U266多发性骨髓瘤细胞系裂解产物的混合物(骨髓瘤裂解产物)进行脉冲或不用肿瘤细胞裂解产物(无裂解产物)进行脉冲。5天之后，基于IFNγ捕获的FACS用于分离产生IFNγ的CD8+和CD4+肿瘤抗原特异性T细胞。代表性患者的FACS分选数据如图2所示。显示每种培养条件的产生IFNγ的CD8+(图2，上排)和CD4+(图2，下排)T细胞的百分比。

实施例3：克隆性

通过测量克隆频率分布的形状来定量单克隆或寡克隆扩增的程度(参见图3)。数值在0-1的范围内，其中数值接近1表示接近单克隆群体。此外，克隆性等于1减去Pielou的均匀度。图3中的频率分布如下计算：

在这些方程中，

当在BM和血液中追踪MIL T细胞克隆型的累积频率时，在反应者和非反应者之间存在显著差异。反应者在基线处具有较低的克隆型频率，但在BM和血液两者中在克隆型频率上均显示出更大且更持续的增加。在第360天，两个区室中MIL的频率自基线的倍数变化将反应者与非反应者分开。

通常，MIL中的T细胞库为高度多克隆的，并且在肿瘤抗原特异性T细胞中没有富集特异性TCR TCRβ可变基因，表明靶向多种抗原。在所有6个患者中，MIL比扩增前的BM更加多克隆。然而，反应者的起始库更加多克隆，并且反应者的克隆性的输注后增加更大且更持续。在第360天，所有3个反应者的克隆性均保持增加，而所有3个非反应者的克隆性均返回到基线或者更低。

输注后血液和骨髓中克隆性的增加与治疗优势相关。因此，这表明引起血液或骨髓中测量的克隆性增加的MIL组合物可提供治疗优势。数据还表明MIL内肿瘤抗原特异性T细胞具有高度多克隆性，这可提供针对异质性肿瘤的优势。

总之，本文提供的结果提供了关于MIL中T细胞克隆型库以及在用MIL治疗之后T细胞库在血液和BM中如何演变的证据。他们的数据还提供了对肿瘤抗原特异性MIL比例的估计(2-15%)。数据表明MIL内肿瘤抗原特异性T细胞具有高度多克隆性，这应提供针对异质性肿瘤的优势。用MIL治疗可诱导在治疗之前频率非常低并且通过immunoSEQ无法检测到的肿瘤抗原特异性T细胞的扩增。数据表明使用T细胞库选择和监测用MIL治疗的患者的潜力。基线处肿瘤抗原特异性T细胞的较低克隆性和较低频率也可用于预测哪些患者最可能对用MIL治疗有反应。输注后MIL的克隆扩增可用于预测哪些患者对用MIL治疗有反应。

本描述不限于所述的特定过程、组合物或方法，因为这些可以变化。描述中使用的术语仅出于描述特定形式或实施方案的目的，并不预期其限制本文所述的实施方案的范围。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括此类定义不应必然解释为表示与本领域一般理解的显著差异。然而，在冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。

根据前文，应了解，本公开内容的各种实施方案已在本文中进行描述用于说明性目的，并且在不脱离本公开内容的范围和精神的情况下可以进行各种修改。因此，本文公开的各种实施方案不预期是限制性的。