可生物降解的聚合物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及可生物降解的聚合物，尤其涉及使用麻类植物废弃物作为碳源的可生物降解的聚合物组合物及其制备方法。

背景技术

塑料是一种轻巧、耐用且用途广泛的材料，并且是从建筑到医疗保健以及从消费品到包装材料的许多行业的不可或缺的一部分。许多塑料材料的生产依赖不可再生资源，因此长期可行性在经济和环境上都是不可持续的。对许多类型的塑料进行环境分解所需的时间也加剧了这些问题。通常，消费品(诸如塑料吸管)中使用的塑料在环境中分解大约需要200年。诸如钓鱼线中使用的那些更耐用的塑料可能需要长达600年才能分解。

因此，塑料废弃物的环境聚集已经成为越来越紧迫的公众关注问题，从而使人们努力减少塑料废弃物，诸如禁止包括吸管在内的一次性塑料物品。其他努力，诸如增加塑料回收的计划，受到成本考虑的限制，并且因为大多数塑料在其物理性质变得不适合进一步使用之前只能回收有限的次数。解决塑料废弃物的环境聚集问题的另一种选择是生产在环境中分解速度更快的塑料。

可生物降解的塑料是可以被微生物降解为简单分子(诸如水、二氧化碳或甲烷和生物质)的塑料，比典型塑料所需的时间短得多。许多可生物降解的塑料也可以由可再生资源生产，而不是不可再生的石化资源。然而，已知可生物降解的塑料具有许多不希望的特性，诸如易碎或热稳定性低。其他已知的可生物降解的塑料的生产成本过高，这阻碍了它们的广泛应用。

因此，需要具有改善的机械特性的新型可生物降解塑料。另外，需要用于从可再生原料生产可生物降解的塑料以降低生产成本的新方法。

为消费者生产一公斤麻类植物将产生八公斤废料。当前的麻类植物废弃物处置方法包括严格管制的做法，包括将麻类植物废弃物与化学品和其他要处置的材料混合。

因此，需要开发有用的应用，以解决由该新产业产生的越来越多的麻类植物废弃物。

发明内容

根据本发明的可生物降解的聚合物组合物包含与以下物质共混的聚羟基丁酸酯和聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)：热塑性淀粉，选自由磺基琥珀酸二己酯钠和马来酸酐组成的组的一种或多种增容剂，以及选自由微晶纤维素和纤维素组成的组的一种或多种添加剂。

在另一个实施方案中，该可生物降解的聚合物组合物包含5重量％至70重量％的聚羟基丁酸酯、5重量％至70重量％的聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)、5重量％至45重量％的热塑性淀粉、0.5重量％至35重量％的所述一种或多种增容剂以及0.5重量％至15重量％的所述一种或多种添加剂。

在另一个实施方案中，该可生物降解的聚合物组合物包含10重量％至30重量％的聚羟基丁酸酯、20重量％至60重量％的聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)、10重量％至30重量％的热塑性淀粉、10重量％至20重量％的所述一种或多种增容剂以及1重量％至10重量％的所述一种或多种添加剂。

在另一个实施方案中，该可生物降解的聚合物组合物包含20重量％的聚羟基丁酸酯、40重量％的聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)、20重量％的热塑性淀粉、15重量％的所述一种或多种增容剂以及5重量％的所述一种或多种添加剂。

根据本发明的另一方面，一种使用麻类植物废弃物作为碳源来生产可生物降解的聚合物的方法，包括以下步骤：a)通过机械破碎处理麻类植物废弃物；b)将麻类植物废弃物在矿物酸溶液中在至少121℃的温度下加热至少25分钟，以产生麻类植物/酸溶液；c)冷却、中和并过滤麻类植物/酸溶液以产生滤液；d)将滤液与无机盐培养基以1:1至1:2的比率混合以产生生产培养基；e)用微生物的起子培养物对生产培养基进行接种，该微生物选自由以下菌的天然菌株和工程改造菌株组成的组：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、新月柄杆菌(Caulobacter cresentus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、圆形芽孢杆菌(Bacilllus circulands)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、积磷小月菌(Microlanatus phosphovorous)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、蚕豆根瘤菌(Rhizobium viciae)、日本根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、蔗糖伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sacchari)、铜杯痣(Cupriavidus necactor)、南极海神单胞菌(Neptunamonas Antarctica)、维氏固氮菌(Azobacter vinelandii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、点状气单胞菌(Aeromonaspunctate)、产碱杆菌(Alcaligenes latus)、玻利维亚盐单胞菌(Halomonasboliviensis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和厚壁菌(Fermicutesbacterium)，然后在至少30℃的温度下孵育48至72小时以产生培养物；以及f)从培养物中提取可生物降解的聚合物。

在另一个实施方案中，从培养物中提取可生物降解的聚合物的步骤包括以下步骤：a)通过孔径约1mm的膜过滤培养物；b)从经过滤的培养物中分离出微生物的细胞；c)将细胞悬浮在NaOH溶液中，然后在至少30℃的温度下孵育至少1.5小时，以从细胞中释放出可生物降解的聚合物；d)从NaOH溶液中分离出可生物降解的聚合物，然后将可生物降解的聚合物重新悬浮在水中；e)从水中分离出可生物降解的聚合物，然后将可生物降解的聚合物重新悬浮在乙醇溶液中；以及f)从乙醇溶液中分离出可生物降解的聚合物。

根据本发明的另一方面，一种由麻类植物废弃物产生生产培养基以用于生产可生物降解的聚合物的方法，包括以下步骤：a)通过机械破碎来处理原始麻类植物废弃物以增加麻类植物废弃物的可用表面积；b)将麻类植物废弃物在矿物酸溶液中在至少121℃的温度下加热至少25分钟，以产生麻类植物/酸溶液；c)冷却、中和并过滤麻类植物/酸溶液以产生滤液；以及d)将滤液与矿物盐培养基以1:1至1:2的比率混合。

在另一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：在水中搅动经处理的麻类植物废弃物以分解麻类植物废弃物。过滤所得的混合物，然后将滤液在氢氧化钠和过氧化氢中加热并搅拌。在将麻类植物废弃物在矿物酸溶液中加热的步骤之前，过滤所得浆液、中和pH值并干燥以产生经干燥的生物质。

在另一个实施方案中，冷却、中和并过滤麻类植物/酸溶液的步骤包括通过添加冷的去离子水来停止反应。离心所得的混合物，并用去离子水洗涤沉淀物直至达到中性pH。在70℃下在67％氯化锌中以0.5M进行酸水解而将纤维素水解，然后在无菌磷酸盐缓冲盐水中稀释最终产物。

根据本发明的另一方面，一种生产可生物降解的聚合物的方法包括以下步骤：a)用微生物的起子培养物对具有经处理的植物废料作为碳源的限氮生产培养基进行接种，该微生物选自由以下菌的天然菌株和工程改造菌株组成的组：枯草芽孢杆菌、钩虫贪铜菌、蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌、新月柄杆菌、球形芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆形芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、积磷小月菌、苜蓿根瘤菌、蚕豆根瘤菌、日本根瘤菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、蔗糖伯克霍尔德氏菌、铜杯痣、南极海神单胞菌、维氏固氮菌、恶臭假单胞菌、绿脓假单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌、点状气单胞菌、产碱杆菌、玻利维亚盐单胞菌、鼠李糖乳杆菌和厚壁菌，然后在至少30℃的温度下孵育48至72小时以产生培养物；b)通过孔径约1mm的膜过滤培养物；c)从经过滤的培养物中分离出微生物的细胞；d)将细胞悬浮在NaOH溶液中，然后在至少30℃的温度下孵育至少1.5小时，以从细胞中释放出可生物降解的聚合物；e)从NaOH溶液中分离出可生物降解的聚合物，然后将可生物降解的聚合物重新悬浮在水中；f)从水中分离出可生物降解的聚合物，然后将可生物降解的聚合物重新悬浮在乙醇溶液中；以及g)从乙醇溶液中分离出可生物降解的聚合物。

在另一个实施方案中，该方法使用由麻类植物废弃物产生的生产培养基来生产PHB，并且包括以下步骤：使一种或多种能够生产PHB的微生物在营养肉汤中由母种生长。用所述一种或多种微生物接种生产培养基。用限制氮源补充生产培养基，并使所述一种或多种微生物在生产培养基中生长。对生产培养基离心以从生产培养基中分离出所述一种或多种微生物的细胞并干燥这些细胞。将干燥的细胞重新悬浮在蒸馏水中，并添加氢氧化钠以从细胞中提取PHB。通过将pH调节至7.0并将所得混合物离心以从悬浮液中分离出PHB颗粒来终止反应。必要时，用蒸馏水冲洗颗粒，然后将所得混合物重新离心。通过添加矿物酸并将混合物离心来分离颗粒。弃去液相并在碱性浴中洗涤产物以纯化PHB。必要时，用水冲洗PHB并离心。

具体实施方式

本发明涉及可生物降解的聚合物组合物及其生产方法。可生物降解的聚合物组合物包含与热塑性淀粉(TPS)、一种或多种增容剂和一种或多种添加剂共混的聚羟基丁酸酯(PHB)和聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)(PHBHHx)。

本文所述的可生物降解的聚合物组合物中使用的PHB和PHBHHx之一或两者优选地由天然的或工程改造以产生PHB和/或PHBHHx的微生物产生。PHBHHx可以是PHB和HHx单体的无规或非无规共聚物。优选地，生物合成的PHBHHx共聚物的3-羟基己酸酯单元保留在半结晶PHBHHx的无定形相中。

用于生产包括PHB和/或PHBHHx在内的可生物降解的聚合物的合适微生物包括以下菌的天然菌株或工程改造菌株：枯草芽孢杆菌、钩虫贪铜菌、蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌、新月柄杆菌、球形芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、圆形芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、积磷小月菌、苜蓿根瘤菌、蚕豆根瘤菌、日本根瘤菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、蔗糖伯克霍尔德氏菌、铜杯痣、南极海神单胞菌、维氏固氮菌、恶臭假单胞菌、绿脓假单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌、点状气单胞菌、产碱杆菌、玻利维亚盐单胞菌、鼠李糖乳杆菌和厚壁菌。优选地，如本文所述，使用枯草芽孢杆菌、钩虫贪铜菌、鼠李糖乳杆菌或厚壁菌的工程改造菌株生产用于可生物降解的聚合物组合物的PHB和PHBHHx。枯草芽孢杆菌是优选的，因为它是革兰氏阳性细菌，因此不含革兰氏阴性细菌中存在的有毒脂质A。在某些应用中，诸如在食品包装、医疗设备或包装、卫生包装以及儿童产品中，不希望可生物降解的聚合物被脂质A污染。

对在本文所述的方法中使用的工程改造微生物进行基因修饰，以表达产生一种或多种可生物降解的聚合物所需的基因，包括转基因。优选地，所产生的可生物降解的聚合物是PHB。合适的基因包括编码乙酰辅酶A乙酰基转移酶、乙酰辅酶A还原酶和PHB聚合酶的phaA、phaB、phaC、phaJ和phaP基因中的一种或多种。许多微生物天然表达这些基因中的一种或多种。一些微生物还可以表达编码一种或多种解聚酶的基因，这些解聚酶降解一种或多种可生物降解的聚合物，包括PHB。优选地，在本文描述的方法中使用的工程改造微生物将表达产生PHB所必需的基因，而不表达编码能够降解PHB或由所选微生物产生的任何其他所需可生物降解的聚合物的解聚酶的任何基因。

一旦例如根据本文所述的方法之一被合成和提取，就将PHB与PHBHHx、热塑性淀粉、一种或多种增容剂和一种或多种添加剂共混。用于本发明的可生物降解的塑料组合物中的热塑性淀粉是增塑的天然聚合物，其优选地具有低浓度的抗坏血酸和柠檬酸、30％的甘油作为增塑剂以及相对于淀粉为约20重量％的水。热塑性淀粉可以以可生物降解的聚合物组合物的至多45重量％的量存在。

可以通过任何合适的制备增塑的天然聚合物的方法来制备热塑性淀粉，诸如通过在双螺杆挤出机中在约30℃至约200℃的升高温度下将天然淀粉与增塑剂混合。水和甘油的混合物优选用作增塑剂。热塑性淀粉的增塑既可以在将热塑性淀粉混合到可生物降解的聚合物组合物中之前实现，也可以通过一次性添加所有组分(即，淀粉、甘油、水以及可生物降解的聚合物组合物的其他组分)以产生最终共混物来实现。

增容剂可包括琥珀酸二己酯、磺基琥珀酸二己酯钠、马来酸酐、亚甲基二苯基二异氰酸酯、富马酸二辛酯或其他极性单体接枝的聚烯烃中的一种或多种。优选地，琥珀酸二己酯和马来酸酐均以0.5重量％至35重量％的量存在。

添加剂可以包括微晶纤维素或纤维素中的一种或多种。优选地，微晶纤维素和纤维素均以0.5重量％至35重量％的量存在。

可生物降解的聚合物组合物分解所需的时间量可以通过控制组合物中热塑性淀粉、微晶纤维素和/或纤维素的量来选择性地增加或减少。随着热塑性淀粉、微晶纤维素和/或纤维素的相对量增加，组合物分解所需的时间减少。优选地，调节热塑性淀粉的相对量以便选择性地增加或减少组合物的分解时间，而不是调节微晶纤维素或纤维素的相对量。此外，可生物降解的聚合物组合物分解所需的时间量可以通过控制组合物中PHBHHx的量来选择性地增加或减少。随着PHBHHx的相对量的增加，组合物分解所需的时间也会增加。

用于生产可生物降解的聚合物的碳源可以包括：麻类植物废弃物、树叶、鱼固体废弃物、槭树液、南瓜籽、葡萄残渣或葡萄酒渣、或葡萄酒生产/酿造/蒸馏废弃物。优选地，将麻类植物废料用作生产PHB的碳源。麻类植物废弃物包括植物的根、剪屑、叶和茎，除麻类植物(Cannabis sativa L.)植物的花蕾外，基本上每个部分都包含在内。

麻类植物废弃物特别适合用作微生物生产PHB的碳源，因为麻类植物植物的生物质含量高，并且麻类植物植物在大多数气候中仅需适量的水和肥料即可迅速生长。与其他潜在的碳源(诸如农业和森林生物质、煤炭、石油残留物和骨头)相比，麻类植物废弃物具有独特的分层孔隙结构和连通的大孔。因此，麻类植物废弃物具有用作碳源的理想特性，包括其孔隙率、吸附能力和表面反应度。相对于其他潜在的碳源，麻类植物废弃物还具有较高的碳浓度和较低的氮、钾和磷含量，这有利于微生物生产PHB。

根据以下方法，首先通过机械破碎来处理麻类植物废弃物，以用于生产PHB。可以通过切碎、研磨、压榨或其他合适的机械破碎手段来处理原始麻类植物废弃物，以增加可用表面积以去除纤维素和脂肪酸。然后从经处理的麻类植物废弃物中分离出脂肪酸，以提供用于合成PHB的碳源，例如，如下所述。

将经处理的麻类植物废弃物按每100mL酸性溶液10g植物废弃物的比例混合到1％硫酸溶液中。将该溶液优选在高压釜中于121℃加热25分钟，然后冷却至室温。然后用2MNaOH溶液中和该溶液，并通过筛子过滤以除去较大的植物废弃物颗粒。然后将溶液以1500g离心20分钟，并将上清液通过孔径约1mm的膜过滤。所得的滤液(麻类植物废弃物水解产物)可以立即使用或在4℃下储存直到需要为止。

通过将滤液与2X矿物盐培养基(0.9g(NH

可生物降解的聚合物的合成和提取可以根据以下方法进行。使合适的微生物在营养肉汤中在30℃下由母种生长，以150rpm振荡72小时，以产生起子培养物。72小时后，将起子培养物以1/10(v/v)接种到生产培养基1中，并在30℃下以150rpm振荡孵育72小时以产生培养物。

然后将培养物通过孔径约1mm的膜过滤以除去不溶性植物物质。然后通过以1500g离心20分钟从经过滤的培养物中分离出微生物的细胞。丢弃上清液，然后通过将细胞重新悬浮在矿物盐培养基中并重复离心来洗涤细胞，然后再次丢弃上清液。

然后将细胞重新悬浮在150mL的0.2M NaOH溶液中，剧烈涡旋使溶液均匀，并在30℃下孵育1.5小时。这导致细胞裂解并将可生物降解的塑料释放到NaOH溶液中。然后通过在1500g下离心20分钟从NaOH溶液中分离出可生物降解的聚合物，并丢弃上清液。

将可生物降解的聚合物重新悬浮在150mL的milliQ水中，然后通过以1500g离心20分钟与水分离。丢弃上清液以除去杂质。然后将可生物降解的聚合物重新悬浮在150mL的1％乙醇溶液中，并通过以1500g离心20分钟与乙醇溶液分离。再次丢弃上清液以除去其他杂质。

在室温下用300mL去离子水对5g植物废弃物进行超声处理。用Whatman 1号滤纸过滤，然后加热并在55℃下使用100mL氢氧化钠溶液(5％，w/v)和过氧化氢溶液(11％，v/v)剧烈搅拌滤液90分钟。过滤浆液，中和pH值并在50℃下干燥。在剧烈搅拌下将5g干燥的生物质添加到100mL 6M的硫酸中保持30分钟，然后通过添加500mL的冷去离子水终止反应。以10,000rpm离心10分钟，然后用去离子水洗涤直至达到中性pH。通过施加67％的氯化锌并在0.5M和70℃下进行酸水解，从纤维素中获得简单的单体，理想情况下，这导致可溶性糖的收率>80％。然后将最终的葡萄糖产物在1L pH 7.0的无菌磷酸盐缓冲盐水中稀释，从而产生生产培养基2(最终浓度：8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na

用于本发明的可生物降解的聚合物组合物中的PHB的合成和提取可以根据以下方法进行。使合适的芽孢杆菌属种在营养肉汤中在37℃下由母种生长过夜，以120rpm振荡。可以以1/10v/v将1.5×10

可以测量干燥细胞团，然后可以使用氢氧化钠提取和选择性溶解来提取PHB。通过将细胞重新悬浮在蒸馏水中并添加NaOH(30℃下0.2N NaOH持续1-5小时)来进行氢氧化钠提取。用HCl将pH调至7.0以终止反应。以2500g离心20分钟。通过用蒸馏水轻轻冲洗来回收PHB颗粒，再次离心并风干。

选择性溶解是通过向混合物中施加矿物酸(诸如硫酸)而实现的，从而导致颗粒在固相中分离，而不想要的物质在液相中分离。这些相可以进一步通过以5000g离心而分离。在固相继续进行处理时，将不想要的上清液(液相)丢弃。矿物酸成功地从混合物中分离出PHB，但优选地在使用前提高纯度。这通过在碱性浴诸如NaOH(pH 10)中洗涤产物来完成。洗涤后，将具有高产率和高纯度(>97％)。为了使产物脱色，可以使用市售的漂白剂。最终离心并用水冲洗后，即可使用PHB产物。

为了测量PHB的产量，离心并用醇洗涤沉淀。将沉淀溶解在氯仿中，转移到干净并预先称重的血清试管中。使氯仿蒸发并称重试管，以计算所得PHB的量。本方法可以从7-9g/L的干燥细胞团产生2-5g/L的PHB。这种生长方法可适于与芽孢杆菌属种一起使用，同样以较小体积的培养基和较短的时间产生大量的PHB。替代性地，也可以使用类似工程改造的钩虫贪铜菌菌株。

在另一个实施方案中，可以根据以下方法，使用钩虫贪铜菌作为微生物并且使用麻类植物废弃物作为碳源来合成和提取PHB。使用能够产生PHB的钩虫贪铜菌菌株，称为富养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)H16(钩虫贪铜菌以前称为富养产碱菌)。将富养产碱菌H16在含1％(v/v)麻类植物油和0.05％(w/v)NH

可以通过提取3的方法以每小时每克麻类植物油约0.0128g PHB的速率生产PHB。

在另一个实施方案中，可以根据以下方法，使用钩虫贪铜菌作为微生物并且使用麻类植物废弃物作为碳源来合成和提取PHB。任选地，可以将表面活性剂阿拉伯树胶添加到反应培养基中以增强钩虫贪铜菌与麻类植物油相互作用/利用麻类植物油的能力，因为它无毒且不会抑制钩虫贪铜菌的生长。钩虫贪铜菌可以在含有以下物质的基本培养基中由母种生长：2％果糖和0.1％NH

可以通过提取4的方法以每克麻类植物油约0.2415g PHB的速率生产PHB。

在另一个实施方案中，可以根据以下方法使用钩虫贪铜菌和大肠杆菌工程改造菌株以及任选地具有phbA和phbB基因的嗜水气单胞菌工程改造菌株的混合物作为微生物以及使用麻类植物废弃物作为碳源来合成和提取PHB。首先，将麻类植物废弃物切碎，然后以约2％(w/v)并在约30℃的温度下放入水中。将麻类植物与水的混合物用钩虫贪铜菌和大肠杆菌以及任选地嗜水气单胞菌的混合培养物接种，并添加肥料，诸如0.1％的米糠提取物。然后将反应培养基搅拌20小时以使其生长。在初始生长期之后，将反应培养基再搅拌15小时，无需添加任何其他肥料以引起氮缺乏状态并促进PHB的产生。

通过在约35小时后向反应培养基中添加矿物酸诸如硫酸来完成PHB的提取。通过以5000g离心而分离PHB颗粒。在固相继续进行处理时，将不想要的上清液(液相)丢弃。矿物酸从混合物中分离出PHB。化合物的纯度可以通过在碱性浴诸如NaOH(pH 10)中洗涤然后进行最终离心和水冲洗来提高。该方法提供了高产率和高纯度的PHB(>97％)。任选地，可以使用市售的漂白剂使产物脱色。

在另一个实施方案中，可以根据以下方法，使用恶臭假单胞菌GPp104作为微生物并且使用麻类植物废弃物作为碳源来合成和提取PHB。使恶臭假单胞菌在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中于30℃以200rpm振荡生长过夜。用于培养该菌株的磷酸盐缓冲盐水溶液由9.0g/L Na

可以以1/10v/v将1.5×10

已经参考示例性实施方案描述了本发明，但是，本领域技术人员将理解，在不脱离如以下权利要求所示的本发明范围的情况下，可以进行各种改变，并且可以用等同物代替其要素。因此，意图是本发明不限于本文公开的特定实施方案。