确定微囊对特定细胞类型的特异性

在WO 002019020665A1中描述了作为生物分子和“小分子化合物”在细胞中的运输介质的聚电解质纳米微囊。这种纳米微囊可以使用所谓的逐层技术围绕固体或液体核芯构建。所述纳米微囊的大小取决于所用核芯的大小。对于特定细胞摄入的选择和效率，除了表面构造外，纳米颗粒的大小也很重要。在WO 002019020665 A1中描述了所述微囊围绕着由碳酸钙构成的核芯形成，其中这种核芯通过硝酸钙和碳酸钠溶液的沉淀反应形成。各种助剂影响沉淀并关系到沉淀碳酸钙核的不同尺寸。

其中的问题是大小分布范围非常宽，即生产60nm的颗粒时也会产生超过100nm的颗粒，反之亦然。然而，这对于在某些细胞类型中成功应用这些纳米微囊，必须能够将颗粒的粒度精确到约10至最大20nm，从而可以减少被摄入不希望的细胞。因为造血细胞主要转染20-60nm大小的纳米微囊，肿瘤细胞优选100-200nm的大小。这意味着纳米微囊必须具有正确的大小，以避免非特异性摄取导致的非特异性影响。

现有技术中的另一个重要问题是大于100nm的颗粒对造血来源的细胞如CD34+造血祖细胞和T细胞的毒性。此类细胞至今只能通过使用病毒进行转导或电穿孔。伴随着所有由此关联的问题。

现有技术中的另一个重要问题是装满运载物的微囊的稳定性相对较低。有时只有载有siRNA的微囊被证明是极其稳定的；其它分子，特别是mRNA和DNA，在微囊中不稳定，并会阻止长期储存，从而导致基因组运载物降解和/或微囊聚集。此外，长期储存会导致小分子和化疗药物的扩散效应，其目前也不允许有效使用这些类别的物质。通过对微囊层和/或RNA或DNA进行化学改性，可以显著提高稳定性。此外，通过这些改性可以实现细胞或器官特异性的引入。

至今在自下而上的方法中生产的颗粒具有的问题在于它们具有广泛的大小分布并且生产过程非常多变。因此，该方法不适用于技术生产相同粒度的纳米颗粒。另一方面，自上而下的工艺生产的颗粒容易获得且价格低廉，但存在形状不均一的问题。

因此，本发明的第一个目的是提供一种微囊，该微囊被靶细胞类型摄入并永久或暂时地改变靶细胞，而不会就此对所述特定靶细胞类型产生任何毒性作用。第二个任务是通过上述化学改性来稳定长期储存。

根据本发明的微囊在于使用单分散纳米颗粒以生产具有细胞特异性尺寸并根据需要进行化学改性的聚电解质纳米微囊，其对于造血细胞的尺寸在20-80nm范围内，优选在40-60nm范围内，对于上皮细胞和非造血细胞为60-280nm，如WO0020199020665中所述。颗粒的尺寸在此必须在非常窄的范围内，以防止发生毒性作用。用于微囊构建的可生物降解聚合物，例如葡聚糖和聚-L-精氨酸，可以根据需要进行化学改性(通过连接官能团，如包含烃、氧、氮、硫或含磷酸根的官能团；为此的方法是现有技术已知的)以防止微囊的自发聚集和自发运载物扩散并提高微囊的稳定性。为了保持纳米微囊的低毒性，此外在某些情况下有利的是，在使用前去除围绕其构建微囊的纳米颗粒(所谓的核芯)。用于此的方法在现有技术中是已知的(例如用EDTA溶解)。

使用通过沉淀获得的核芯不能有效地进行足够窄的尺寸选择，因为尺寸分布非常宽。在本发明的上下文中，具有平均值的±15nm或可选地±25％，优选±10nm(或平均值的±20％)的狭窄尺寸分布的纳米颗粒和纳米微囊被称为单分散的。

令人惊讶的是，核芯尺寸的问题不是只能通过使用尺寸分选的机械生产的纳米颗粒来解决。通过在球磨机中研磨碳酸钙，可以产生尺寸为15-60nm的纳米颗粒，然后可以通过分级(通过沉降或离心)产生均匀的级分(±10nm)。然后可以在逐层工艺中用聚合物涂覆这些颗粒。然而，这些颗粒的不均匀形状是困扰性的，因为它破坏了颗粒的分选。只有这些颗粒的进一步纯化，例如通过核芯溶解后的错流过滤，才能实现足够精确的尺寸选择。

可以使用众所周知的逐层法生产纳米微囊。分子如化疗药物、小分子和大分子如核酸和蛋白质可以引入层间，然后可以在细胞中释放。例如，嵌合T细胞受体可以通过将载有DNA的纳米微囊引入T细胞来产生。也可以将RNA分子引入细胞中，以便仅产生细胞的暂时改性。此外，所有提及的分子和大分子可以单独或以任何可想到的组合引入。这种特性例如可以转染CRISPR/Cas复合物。所提到的化学改性可用于微囊聚合物和运载物，以调节稳定性并因此调节靶细胞中的释放。

原代细胞是已经从身体获取并且没有通过培养失去其组织特异性特性的细胞。原代细胞例如但不限于干细胞、生殖细胞、造血细胞、肿瘤细胞，或者还有间充质干细胞、体内和离体组织细胞。

干细胞通常被称为可以分化成不同细胞类型或组织的体细胞。分别根据干细胞的类型及其影响，它们有可能发育成任何组织(胚胎干细胞)或某些特定的组织类型(成体干细胞/祖细胞)。

构建纳米微囊层的适宜聚合物是聚阳离子和聚阴离子，它们交替形成纳米微囊层。由于相反的电荷，聚合物可以通过自组织形成层。在每一层形成之后，聚合物的未使用部分必须从纳米微囊中分离出来。在本发明的意义中，聚合物还包括经典聚合物和共聚物还有生物聚合物，例如具有氨基酸、核酸和多糖或寡糖的有序构造的大分子。

聚阳离子的实例有：

-聚乙烯亚胺(PEI)，

-壳聚糖(CS)，

-聚(L-赖氨酸)(PLL)，

-聚(酰胺胺)型(PAA)，

-寡聚赖氨酸

-聚-(I)-鸟氨酸(PLO)

-聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDAC)

-富含组氨酸和赖氨酸的肽和蛋白质，例如Cys-Gly-Ala-Gly-Pro-(Lys)3-Arg-Lys-Val-Cys

聚阴离子的实例有：

-聚(甲基丙烯酸)(PMA)

-聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)

-单宁酸(TA)

-聚(2-n-丙基-2-恶唑啉)(PnPropOx)

-聚(1-乙烯基咪唑)

-聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)

-硫酸葡聚糖，

-聚乙二醇，

-牛血清白蛋白，

-人血清白蛋白

-硫酸鱼精蛋白

-1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)

可以使用稳定核酸的物质，是与微囊中的核酸一起施加的物质，或者是通过与完成的微囊一起孵育而扩散到微囊中并进入微囊内腔并在那里至少部分逗留直到微囊进入细胞的物质。此类物质的实例有：

-硫酸鱼精蛋白

-细胞穿透肽

-谷胱甘肽

-TAT蛋白

-RNA酶抑制剂

-DNA酶抑制剂

适合作为核芯用于生产纳米微囊的纳米颗粒的实例有：

-铁纳米颗粒(包括磁铁矿)

-二氧化硅纳米颗粒

-市售CaCO

-其它碳酸盐纳米颗粒，如MgCO

-囊泡

-金纳米颗粒

-乳胶纳米颗粒

纳米颗粒的表面可以用另外的基团进行改性，以提高靶细胞的穿透性。这样的基团是例如叶酸基团、COOH基团、NH

实施例1：碳酸钙纳米颗粒的分级

碳酸钙纳米颗粒购自SkySpring Nanomaterials。平均粒径为15-40nm。用所述颗粒制备在PBS中的10mg/ml悬浮液。使用超声波5分钟以分散颗粒。然后通过在Eppendorf离心机中根据大小分级离心对它们进行纯化。在500RCF、1000RCF、2000RCF、5000RCF、10000RCF、15000RCF和20000RCF下离心2ml悬浮液。在此以最低的RCF开始，取出上清液并用下一个更高的RCF离心。然后测量来自离心的沉淀斑。丢弃500RCF级分(颗粒聚集或太大)。

实施例2：制备聚电解质纳米微囊

如WO 002019020665 A1中所述，硫酸葡聚糖(作为钠盐)和聚-L-精氨酸盐酸盐用于包被纳米颗粒。可以在层之间引入一种或多种核酸(加上额外的生物分子)。核酸通过静电结合粘附在微囊壁上，从而将微囊与生物分子一起孵育就足够了。该方法描述于WO002019020665 A1中。

这些可以进行化学改性以改变储存稳定性和细胞内降解时间。通过应用一种或不同官能团如烃、含氧、含氮基团、硫(S/SH)、N/NH和其它含P基团引入并测试化学改性。所述化学改性在第一次测试中表明可以保证更长的存储时间。此外，微囊现在还可以在室温下储存一段时间，这特别是对于运输(货运)代表了极大的简便，因为它将降低成本和管理工作(关键词：干冰和冷藏产品的海关规定)。

实施例3：通过切向流过滤纯化成品纳米微囊

然后使用具有50nm过滤器模块的KrosFlo Research II系统清洁成品纳米微囊以去除可能存在的任何较大的纳米微囊。大于50nm的颗粒被拦住。为此，制备了50ml的10mg/ml在PBS中的纳米微囊悬浮液。这是根据制造商的说明过滤的。

实施例4不对称流场流分级(AF4)后的分离：

然后使用Wyatt Technology的Eclipse AF4清洁成品纳米微囊，以去除可能存在的较大纳米微囊。根据电荷和大小分离颗粒。为此，制备了50ml的10mg/ml在PBS中的纳米微囊悬浮液。这是根据制造商的说明分开的。

实施例5：原代细胞的转染

尤其是对于造血细胞，40-80nm大小的纳米微囊显然更有优势。蛋白质、DNA、mRNA、miRNA和siRNA被用作尺寸从50nm到80nm的纳米微囊的运载物。CD34+造血干细胞、CD4+和CD8+T细胞与微囊一起孵育48小时。使用10个微囊/细胞。在荧光标记的微囊和PCR的情况下，借助共聚焦显微镜检查到成功的引入。

实施例6：其它原代细胞的转染

为胚胎干细胞以及诱导的多功能干细胞(iPS细胞)制备了大小为50-120nm的纳米微囊。蛋白质、DNA、mRNA、miRNA和siRNA被用作尺寸从50到120nm的纳米微囊的运载物。胚胎干细胞和iPS细胞与微囊一起孵育48小时。使用20个微囊/细胞。在荧光标记的微囊和PCR的情况下，借助共聚焦显微镜检查到成功的引入。

实施例7：微囊在室温(RT)下的稳定化和储存。

对于前面实施例中列出的所有微囊，通过引入官能团如烃、含氧、含氮基团、硫(S/SH)、N/NH和其它含磷基团进行在核芯或层上的进一步改性，从而可以实现微囊的稳定化并因此实现在室温下储存的期望目标。

实施例8：微囊自然降解的影响

通过在实施例2和7中说明的在核芯以及层上的官能团改性可以在相应靶细胞中影响微囊在引入后的自然降解。对此发现，例如在间充质细胞系和肿瘤细胞系中每层的降解时间为4小时，而在造血来源的细胞中的降解时间为24小时。

实施例9：靶向导入：借助AK、肽、蛋白质

为了进一步指定将运载物靶向引入所需的靶细胞，将相应的抗体、肽或蛋白质引入微囊的外层。

实施例10：具有小分子运载物的微囊的稳定化

为了稳定载有小分子或化疗药物的微囊，使用点击化学将小分子或化疗药物固定在微囊中并由此防止扩散效应。