一种防治立枯丝核菌病害的dsRNA纳米农药的制备及其应用

技术领域

本发明涉及一种防治立枯丝核菌病害的dsRNA纳米农药的制备及其应用，涉及植物病害的生物防治，属于植物保护学科中的生物防治研究与应用领域。

背景技术

立枯丝核菌（

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种成熟的病原真菌基因功能研究和农作物病害防治方法，但以往基于RNAi的技术均建立在转基因基础之上，而许多植物和病原真菌很难被遗传操作，再加上世界各国对转基因农产品接受度低，因此这些方法的安全性和广适性也一直倍受质疑。最近发展起来的喷施诱导的基因沉默技术（Spray-induced genesilencing，SIGS），不需要建立病菌遗传转化体系，也不需要形成转基因作物，只是通过外源喷施dsRNA诱导病原物靶标基因沉默，从而达到控制病害的目的。相对于至目前为止还未有完善遗传转化体系的立枯丝核菌来说，该技术为其引起的病害的田间防控提供了一种新的手段。

dsRNA虽不像单链RNA那样极易被降解，但病原菌体内外的大量RNA酶还是容易使dsRNA失活。纳米材料因其小尺寸效应、界面效应和高渗透效应，可以改善药效成分的稳定性，促进对靶沉积与剂量的转移，减少流失，提高利用率。将dsRNA装载至纳米材料，通过其高渗透性将更多量的dsRNA运输至植物体内，从而提高外源dsRNA对病原菌靶基因的干涉效应，减轻其危害，可大大提高dsRNA对植物病害的防控效果。

本发明以立枯丝核菌为对象，选择对病菌致病功能有影响的多聚半乳糖醛酸酶基因

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，研发一种新型纳米农药，针对植物病害防治化学药剂使用量大、次数多、容易引起抗药性和农药残留问题，应减少化学药剂的使用，增强生物防治措施，具体为一种防治立枯丝核菌病害的dsRNA纳米农药的制备及其应用。

本发明的目的是这样实现的：

一种防治立枯丝核菌病害的dsRNA纳米农药的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

步骤1）：通过体外转录合成靶向立枯丝核菌多聚半乳糖醛酸酶基因

RsCAT

RsCAT

RsPG1

RsPG1

RsCRZ1

RsCRZ1

步骤2）：利用引物对

RsPG1

RsCRZ1

RsPG1

RsCRZ1

步骤3）：根据诺唯赞T7 RNAi Transcription Kit说明书进行体外转录，后纯化,即

步骤3）中，dsRNA纳米农药保存在-80℃冰箱备用。

一种防治立枯丝核菌病害的dsRNA纳米农药的在防治立枯丝核菌病害上的应用。应用方法为：将合成的

本发明方法先进科学，通过本发明，一种防治立枯丝核菌病害的dsRNA纳米农药的制备包括：

步骤1：通过体外转录合成靶向立枯丝核菌多聚半乳糖醛酸酶基因

步骤2：然后利用引物对

步骤3：根据诺唯赞T7 RNAi Transcription Kit说明书进行体外转录。最后纯化后保存在-80℃冰箱备用。

利用引物对

通过体外转录合成靶向立枯丝核菌多聚半乳糖醛酸酶基因

将体外转录的约200 bp的

在本氏烟叶片上喷施

将合成的

本发明优点及效果：SIGS因不需要转基因，解决了许多植物不能进行遗传操作的难题，且dsRNA来源于病原菌本身，不会在土壤和环境中留下有毒残留物而对环境造成污染，从而具有更广阔的应用前景。虽然目前世界各国对dsRNA产品的应用与管理还未有共识，但包括欧洲科学界在内各国科学家和相关组织已开始评估此类产品的监管框架，基于dsRNA农药将很快在生产上被广泛应用。

附图说明

图1为立枯丝核菌可以摄取外源dsRNA图；

图2为RsPCC-dsRNA处理对立枯丝核菌生长发育和靶基因表达的影响图；

图3为通过纳米材料LDH可有效负载dsRNA图；

图4为LDH可促进dsRNA进入叶片组织和在其中运输图；

图5为叶片喷施RsPCC-dsRNA可减轻立枯丝核菌的危害；

图6为外源喷施RsPCC-dsRNA防治立枯丝核菌病害。

具体实施方式

以下结合附图以及附图说明对本发明作进一步详细说明。

：立枯丝核菌摄取外源dsRNA；

利用引物对

：

通过体外转录合成靶向立枯丝核菌3个基因多聚半乳糖醛酸酶基因

：LDH可负载dsRNA；

将体外转录的约200 bp的

：LDH帮助dsRNA进入植物组织；

为明确纳米材料LDH是否可促进dsRNA进入植物叶片，在本氏烟叶片上喷施

：外源喷施

将合成的