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流感与新型冠状病毒全基因组共扩增引物池及其建库方法

文献发布时间：2023-06-19 19:28:50

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地，涉及一种流感与新型冠状病毒全基因组共扩增引物池及其建库方法。

背景技术

呼吸道病毒感染是一个重大的全球性健康问题。据估计，流感的年度季节性流行会造成全球5％～10％的人群被感染，导致300万至500万的住院病例和29万至65万的死亡病例。感染人类的流感病毒有甲型、乙型、丙型三种，较为常见且能造成严重危害的通常为甲型和乙型流感。2019年12月下旬爆发的一种新型冠状病毒SARS-CoV-2也是一种危害性极大的呼吸道病毒，其感染与传播能力明显强于之前的SARS和MERS。流感和新冠病毒引起的呼吸道传染病给人类健康带来了巨大的威胁，因此对流感病毒和新冠病毒的检测、监测及实时追踪变得极为重要和迫切。

有研究表明在新冠病毒核酸阳性患者中，存在一定比例的流感病原合并感染者，即患者同时感染上流感病毒和新冠病毒，而在临床上流感与新冠病毒引起的肺炎表现具有一定相似性，难以直接区分，因此非常需要一种灵敏度强、准确性高，且能够同时检测流感与新冠病毒的方法，以帮助快速诊断病情。但若仅仅鉴定是否患新冠或者流感感染是远远不够的，流感与新冠的病毒均属于RNA病原，抗原高度易变，传播迅速，想要对新冠和流感病毒进行常态化的防治，还需要获取病原的全基因组序列，时刻监控其病毒的变异情况。

当前，呼吸道病原的常规检测方法是基于实时荧光定量PCR检测的，其检测的原理主要是针对病毒基因组中某些靶标序列设计一对或几对引物进行扩增，其优势是方便、快速，在人群确诊中具有举足轻重的作用。但该方法检测通量低，且仅能检测病原而无法获得病毒的全基因组，在面对快速变异的流感与新冠病毒时，该方法易产生假阴性，也无法满足对病毒变异监控的需求。相比于传统PCR技术，高通量测序方法可以在微量的样本的情况下获得病毒全长信息，在对病原体进行分型的基础上，判断其同源性远近，分辨出不同的进化路线，可追踪或预防流行性疾病的大暴发。目前基于基因组测序技术(NGS)的病原检测主要有宏基因组测序技术(mNGS)、基于探针捕获的全基因组靶向测序和基于多重PCR的全基因组靶向测序方法。mNGS在对未知病毒病原体的发现具有突出优势，但所需测序数据量大，真正有意义的基因片段数据量比例较低，方法灵敏度低，容易导致漏检。基于探针捕获的方法先对样本进行建库再靶向富集病毒，然后测序，其操作过程非常繁琐，并且所需要时间长，不利于病毒的防控；基于多重PCR的全基因组捕获方法采用特异性的引物对靶标病毒进行百万倍的富集建库，然后测序获得病毒全基因组数据，该方法操作简单，有非常高的灵敏度，对于弱阳性的样本也能灵敏检测，是较为理想的技术手段。但由于流感病毒分型种类多，只有长片段的首尾序列为保守区，仅能在保守区设计引物进行长PCR扩增，且若要实现新冠与流感一管共扩增，新冠病毒也需采用同样的长片段PCR方法，使新冠病毒的连续区域也能够在一管中扩增，由此可见，要通过多重PCR捕获方法将流感和新冠病毒一管共扩增和建库存在很高技术难度，对两类病毒的引物设计要求非常高，目前市面上暂无相应引物池或产品能够满足需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何筛查同时感染流感病毒与新型冠状病毒的患者。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一个引物组，所述引物组包括正向引物和反向引物；

所述正向引物包括名称分别为influenza A-01F、influenza A-02F、influenzaA-03F、influenza A-04F、influenza A-05F、influenza A-06F、influenza A-07F、influenza A-08F、influenza A-09F、influenza B-01F、influenza B-02F、influenza B-03F、influenza B-04F、influenza B-05F、influenza B-06F、influenza B-07F、influenzaB-08F、SARS-CoV-2-01F、SARS-CoV-2-02F、SARS-CoV-2-03F、SARS-CoV-2-04F、SARS-CoV-2-05F、SARS-CoV-2-06F、SARS-CoV-2-07F、SARS-CoV-2-08F、SARS-CoV-2-09F、SARS-CoV-2-10F、SARS-CoV-2-11F、SARS-CoV-2-12F、SARS-CoV-2-13F、SARS-CoV-2-14F、SARS-CoV-2-15F、SARS-CoV-2-16F、SARS-CoV-2-17F、SARS-CoV-2-18F、SARS-CoV-2-19F、SARS-CoV-2-20F的引物；

所述反向引物包括名称分别为influenza A-01R、influenza A-02R、influenzaA-03R、influenza A-04R、influenza A-05R、influenza A-06R、influenza A-07R、influenza A-08R、influenza A-09R、influenza B-01R、influenza B-02R、influenza B-03R、influenza B-04R、influenza B-05R、influenza B-06R、influenza B-07R、influenzaB-08R、C-SARS-CoV-2-01R、C-SARS-CoV-2-02R、C-SARS-CoV-2-03R、C-SARS-CoV-2-04R、C-SARS-CoV-2-05R、C-SARS-CoV-2-06R、C-SARS-CoV-2-07R、C-SARS-CoV-2-08R、C-SARS-CoV-2-09R、C-SARS-CoV-2-10R、C-SARS-CoV-2-11R、C-SARS-CoV-2-12R、C-SARS-CoV-2-13R、C-SARS-CoV-2-14R、C-SARS-CoV-2-15R、C-SARS-CoV-2-16R、C-SARS-CoV-2-17R、C-SARS-CoV-2-18R、C-SARS-CoV-2-19R和C-SARS-CoV-2-20R的引物；

所述influenza A-01F是如下a11)至a14)中的任一种单链DNA：

a11)序列表中SEQ ID No.1的第8-23位所对应的单链DNA；

a12)在a11)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

a13)与a11)或a12)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

a14)在严格条件下与a11)或a12)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-02F是如下a21)至a24)中的任一种单链DNA：

a21)序列表中SEQ ID No.2的第8-24位所对应的单链DNA；

a22)在a21)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

a23)与a21)或a22)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

a24)在严格条件下与a21)或a22)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-03F是如下a31)至a34)中的任一种单链DNA：

a31)序列表中SEQ ID No.3的第8-25位所对应的单链DNA；

a32)在a31)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

a33)与a31)或a32)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

a34)在严格条件下与a31)或a32)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-04F是如下a41)至a44)中的任一种单链DNA：

a41)序列表中SEQ ID No.4的第8-21位所对应的单链DNA；

a42)在a41)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

a43)与a41)或a42)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

a44)在严格条件下与a41)或a42)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-05F是如下a51)至a54)中的任一种单链DNA：

a51)序列表中SEQ ID No.5的第8-24位所对应的单链DNA；

a52)在a51)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

a53)与a51)或a52)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

a54)在严格条件下与a51)或a52)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-06F是如下a61)至a64)中的任一种单链DNA：

a61)序列表中SEQ ID No.6的第8-22位所对应的单链DNA；

a62)在a61)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

a63)与a61)或a62)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

a64)在严格条件下与a61)或a62)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-07F是如下a71)至a74)中的任一种单链DNA：

a71)序列表中SEQ ID No.7的第8-24位所对应的单链DNA；

a72)在a71)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

a73)与a71)或a72)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

a74)在严格条件下与a71)或a72)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-08F是如下a81)至a84)中的任一种单链DNA：

a81)序列表中SEQ ID No.8的第8-24位所对应的单链DNA；

a82)在a81)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

a83)与a81)或a82)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

a84)在严格条件下与a81)或a82)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-09F是如下a91)至a94)中的任一种单链DNA：

a91)序列表中SEQ ID No.9的第8-22位所对应的单链DNA；

a92)在a91)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

a93)与a91)或a92)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

a94)在严格条件下与a91)或a92)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-01F是如下b11)至b14)中的任一种单链DNA：

b11)序列表中SEQ ID No.10的第8-22位所对应的单链DNA；

b12)在b11)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b13)与b11)或b12)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

b14)在严格条件下与b11)或b12)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-02F是如下b21)至b24)中的任一种单链DNA：

b21)序列表中SEQ ID No.11的第8-22位所对应的单链DNA；

b22)在b21)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b23)与b21)或b22)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

b24)在严格条件下与b21)或b22)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-03F是如下b31)至b34)中的任一种单链DNA：

b31)序列表中SEQ ID No.12的第8-21位所对应的单链DNA；

b32)在b31)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b33)与b31)或b32)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

b34)在严格条件下与b31)或b32)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-04F是如下b41)至b44)中的任一种单链DNA：

b41)序列表中SEQ ID No.13的第8-27位所对应的单链DNA；

b42)在b41)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b43)与b41)或b42)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

b44)在严格条件下与b41)或b42)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-05F是如下b51)至b54)中的任一种单链DNA：

b51)序列表中SEQ ID No.14的第8-21位所对应的单链DNA；

b52)在b51)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b53)与b51)或b52)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

b54)在严格条件下与b51)或b52)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-06F是如下b61)至b64)中的任一种单链DNA：

b61)序列表中SEQ ID No.15的第8-21位所对应的单链DNA；

b62)在b61)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b63)与b61)或b62)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

b64)在严格条件下与b61)或b62)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-07F是如下b71)至b74)中的任一种单链DNA：

b71)序列表中SEQ ID No.16的第8-21位所对应的单链DNA；

b72)在b71)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b73)与b71)或b72)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

b74)在严格条件下与b71)或b72)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-08F是如下b81)至b84)中的任一种单链DNA：

b81)序列表中SEQ ID No.17的第8-25位所对应的单链DNA；

b82)在b81)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b83)与b81)或b82)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

b84)在严格条件下与b81)或b82)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-01F是如下c11)至c14)中的任一种单链DNA：

c11)序列表中SEQ ID No.18的第8-30位所对应的单链DNA；

c12)在c11)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c13)与c11)或c12)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c14)在严格条件下与c11)或c12)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-02F是如下c21)至c24)中的任一种单链DNA：

c21)序列表中SEQ ID No.19的第8-29位所对应的单链DNA；

c22)在c21)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c23)与c21)或c22)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c24)在严格条件下与c21)或c22)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-03F是如下c31)至c34)中的任一种单链DNA：

c31)序列表中SEQ ID No.20的第8-27位所对应的单链DNA；

c32)在c31)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c33)与c31)或c32)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c34)在严格条件下与c31)或c32)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-04F是如下c41)至c44)中的任一种单链DNA：

c41)序列表中SEQ ID No.21的第8-26位所对应的单链DNA；

c42)在c41)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c43)与c41)或c42)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c44)在严格条件下与c41)或c42)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-05F是如下c51)至c54)中的任一种单链DNA：

c51)序列表中SEQ ID No.22的第8-39位所对应的单链DNA；

c52)在c51)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c53)与c51)或c52)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c54)在严格条件下与c51)或c52)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-06F是如下c61)至c64)中的任一种单链DNA：

c61)序列表中SEQ ID No.23的第8-26位所对应的单链DNA；

c62)在c61)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c63)与c61)或c62)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c64)在严格条件下与c61)或c62)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-07F是如下c71)至c74)中的任一种单链DNA：

c71)序列表中SEQ ID No.24的第8-25位所对应的单链DNA；

c72)在c71)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c73)与c71)或c72)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c74)在严格条件下与c71)或c72)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-08F是如下c81)至c84)中的任一种单链DNA：

c81)序列表中SEQ ID No.25的第8-28位所对应的单链DNA；

c82)在c81)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c83)与c81)或c82)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c84)在严格条件下与c81)或c82)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-09F是如下c91)至c94)中的任一种单链DNA：

c91)序列表中SEQ ID No.26的第8-37位所对应的单链DNA；

c92)在c91)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c93)与c91)或c92)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c94)在严格条件下与c91)或c92)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-10F是如下c101)至c104)中的任一种单链DNA：

c101)序列表中SEQ ID No.27的第8-35位所对应的单链DNA；

c102)在c101)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c103)与c101)或c102)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c104)在严格条件下与c101)或c102)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-11F是如下c111)至c114)中的任一种单链DNA：

c111)序列表中SEQ ID No.28的第8-36位所对应的单链DNA；

c112)在c111)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c113)与c111)或c112)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c114)在严格条件下与c111)或c112)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-12F是如下c121)至c124)中的任一种单链DNA：

c121)序列表中SEQ ID No.29的第8-36位所对应的单链DNA；

c122)在c121)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c123)与c121)或c122)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c124)在严格条件下与c121)或c122)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-13F是如下c131)至c134)中的任一种单链DNA：

c131)序列表中SEQ ID No.30的第8-27位所对应的单链DNA；

c132)在c131)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c133)与c131)或c132)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c134)在严格条件下与c131)或c132)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-14F是如下c141)至c144)中的任一种单链DNA：

c141)序列表中SEQ ID No.31的第8-39位所对应的单链DNA；

c142)在c141)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c143)与c141)或c142)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c144)在严格条件下与c141)或c142)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-15F是如下c151)至c154)中的任一种单链DNA：

c151)序列表中SEQ ID No.32的第8-40位所对应的单链DNA；

c152)在c151)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c153)与c151)或c152)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c154)在严格条件下与c151)或c152)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-16F是如下c161)至c164)中的任一种单链DNA：

c161)序列表中SEQ ID No.33的第8-29位所对应的单链DNA；

c162)在c161)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c163)与c161)或c162)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c164)在严格条件下与c161)或c162)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-17F是如下c171)至c174)中的任一种单链DNA：

c171)序列表中SEQ ID No.34的第8-28位所对应的单链DNA；

c172)在c171)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c173)与c171)或c172)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c174)在严格条件下与c171)或c172)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-18F是如下c181)至c184)中的任一种单链DNA：

c181)序列表中SEQ ID No.35的第8-26位所对应的单链DNA；

c182)在c181)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c183)与c181)或c182)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c184)在严格条件下与c181)或c182)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-19F是如下c191)至c194)中的任一种单链DNA：

c191)序列表中SEQ ID No.36的第8-34位所对应的单链DNA；

c192)在c191)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c193)与c191)或c192)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c194)在严格条件下与c191)或c192)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SARS-CoV-2-20F是如下c201)至c204)中的任一种单链DNA：

c201)序列表中SEQ ID No.37的第8-36位所对应的单链DNA；

c202)在c201)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c203)与c201)或c202)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

c204)在严格条件下与c201)或c202)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-01R是如下d11)至d14)中的任一种单链DNA：

d11)序列表中SEQ ID No.40的第8-25位所对应的单链DNA；

d12)在d11)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

d13)与d11)或d12)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

d14)在严格条件下与d11)或d12)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-02R是如下d21)至d24)中的任一种单链DNA：

d21)序列表中SEQ ID No.41的第8-24位所对应的单链DNA；

d22)在d21)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

d23)与d21)或d22)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

d24)在严格条件下与d21)或d22)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-03R是如下d31)至d34)中的任一种单链DNA：

d31)序列表中SEQ ID No.42的第8-25位所对应的单链DNA；

d32)在d31)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

d33)与d31)或d32)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

d34)在严格条件下与d31)或d32)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-04R是如下d41)至d44)中的任一种单链DNA：

d41)序列表中SEQ ID No.43的第8-24位所对应的单链DNA；

d42)在d41)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

d43)与d41)或d42)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

d44)在严格条件下与d41)或d42)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-05R是如下d51)至d54)中的任一种单链DNA：

d51)序列表中SEQ ID No.44的第8-25位所对应的单链DNA；

d52)在d51)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

d53)与d51)或d52)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

d54)在严格条件下与d51)或d52)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-06R是如下d61)至d64)中的任一种单链DNA：

d61)序列表中SEQ ID No.45的第8-24位所对应的单链DNA；

d62)在d61)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

d63)与d61)或d62)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

d64)在严格条件下与d61)或d62)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-07R是如下d71)至d74)中的任一种单链DNA：

d71)序列表中SEQ ID No.46的第8-25位所对应的单链DNA；

d72)在d71)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

d73)与d71)或d72)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

d74)在严格条件下与d71)或d72)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-08R是如下d81)至d84)中的任一种单链DNA：

d81)序列表中SEQ ID No.47的第8-25位所对应的单链DNA；

d82)在d81)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

d83)与d81)或d82)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

d84)在严格条件下与d81)或d82)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza A-09R是如下d91)至d94)中的任一种单链DNA：

d91)序列表中SEQ ID No.48的第8-25位所对应的单链DNA；

d92)在d91)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

d93)与d91)或d92)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

d94)在严格条件下与d91)或d92)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-01R是如下e11)至e14)中的任一种单链DNA：

e11)序列表中SEQ ID No.49的第8-25位所对应的单链DNA；

e12)在e11)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

e13)与e11)或e12)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

e14)在严格条件下与e11)或e12)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-02R是如下e21)至e24)中的任一种单链DNA：

e21)序列表中SEQ ID No.50的第8-25位所对应的单链DNA；

e22)在e21)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

e23)与e21)或e22)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

e24)在严格条件下与e21)或e22)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-03R是如下e31)至e34)中的任一种单链DNA：

e31)序列表中SEQ ID No.51的第8-25位所对应的单链DNA；

e32)在e31)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

e33)与e31)或e32)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

e34)在严格条件下与e31)或e32)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-04R是如下e41)至e44)中的任一种单链DNA：

e41)序列表中SEQ ID No.52的第8-25位所对应的单链DNA；

e42)在e41)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

e43)与e41)或e42)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

e44)在严格条件下与e41)或e42)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-05R是如下e51)至e54)中的任一种单链DNA：

e51)序列表中SEQ ID No.53的第8-25位所对应的单链DNA；

e52)在e51)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

e53)与e51)或e52)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

e54)在严格条件下与e51)或e52)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-06R是如下e61)至e64)中的任一种单链DNA：

e61)序列表中SEQ ID No.54的第8-25位所对应的单链DNA；

e62)在e61)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

e63)与e61)或e62)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

e64)在严格条件下与e61)或e62)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-07R是如下e71)至e74)中的任一种单链DNA：

e71)序列表中SEQ ID No.55的第8-25位所对应的单链DNA；

e72)在e71)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

e73)与e71)或e72)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

e74)在严格条件下与e71)或e72)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述influenza B-08R是如下e81)至e84)中的任一种单链DNA：

e81)序列表中SEQ ID No.56的第8-25位所对应的单链DNA；

e82)在e81)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

e83)与e81)或e82)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

e84)在严格条件下与e81)或e82)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-01R是如下f11)至f14)中的任一种单链DNA：

f11)序列表中SEQ ID No.57的第8-35位所对应的单链DNA；

f12)在f11)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f13)与f11)或f12)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f14)在严格条件下与f11)或f12)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-02R是如下f21)至f24)中的任一种单链DNA：

f21)序列表中SEQ ID No.58的第8-35位所对应的单链DNA；

f22)在f21)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f23)与f21)或f22)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f24)在严格条件下与f21)或f22)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-03R是如下f31)至f34)中的任一种单链DNA：

f31)序列表中SEQ ID No.59的第8-40位所对应的单链DNA；

f32)在f31)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f33)与f31)或f32)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f34)在严格条件下与f31)或f32)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-04R是如下f41)至f44)中的任一种单链DNA：

f41)序列表中SEQ ID No.60的第8-39位所对应的单链DNA；

f42)在f41)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f43)与f41)或f42)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f44)在严格条件下与f41)或f42)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-05R是如下f51)至f54)中的任一种单链DNA：

f51)序列表中SEQ ID No.61的第8-42位所对应的单链DNA；

f52)在f51)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f53)与f51)或f52)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f54)在严格条件下与f51)或f52)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-06R是如下f61)至f64)中的任一种单链DNA：

f61)序列表中SEQ ID No.62的第8-33位所对应的单链DNA；

f62)在f61)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f63)与f61)或f62)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f64)在严格条件下与f61)或f62)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-07R是如下f71)至f74)中的任一种单链DNA：

f71)序列表中SEQ ID No.63的第8-35位所对应的单链DNA；

f72)在f71)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f73)与f71)或f72)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f74)在严格条件下与f71)或f72)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-08R是如下f81)至f84)中的任一种单链DNA：

f81)序列表中SEQ ID No.64的第8-38位所对应的单链DNA；

f82)在f81)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f83)与f81)或f82)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f84)在严格条件下与f81)或f82)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-09R是如下f91)至f94)中的任一种单链DNA：

f91)序列表中SEQ ID No.65的第8-42位所对应的单链DNA；

f92)在f91)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f93)与f91)或f92)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f94)在严格条件下与f91)或f92)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-10R是如下f101)至f104)中的任一种单链DNA：

f101)序列表中SEQ ID No.66的第8-40位所对应的单链DNA；

f102)在f101)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f103)与f101)或f102)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f104)在严格条件下与f101)或f102)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-11R是如下f111)至f114)中的任一种单链DNA：

f111)序列表中SEQ ID No.67的第8-41位所对应的单链DNA；

f112)在f111)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f113)与f111)或f112)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f114)在严格条件下与f111)或f112)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-12R是如下f121)至f124)中的任一种单链DNA：

f121)序列表中SEQ ID No.68的第8-35位所对应的单链DNA；

f122)在f121)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f123)与f121)或f122)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f124)在严格条件下与f121)或f122)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-13R是如下f131)至f134)中的任一种单链DNA：

f131)序列表中SEQ ID No.69的第8-34位所对应的单链DNA；

f132)在f131)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f133)与f131)或f132)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f134)在严格条件下与f131)或f132)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-14R是如下f141)至f144)中的任一种单链DNA：

f141)序列表中SEQ ID No.70的第8-41位所对应的单链DNA；

f142)在f141)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f143)与f141)或f142)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f144)在严格条件下与f141)或f142)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-15R是如下f151)至f154)中的任一种单链DNA：

f151)序列表中SEQ ID No.71的第8-40位所对应的单链DNA；

f152)在f151)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f153)与f151)或f152)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f154)在严格条件下与f151)或f152)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-16R是如下f161)至f164)中的任一种单链DNA：

f161)序列表中SEQ ID No.72的第8-38位所对应的单链DNA；

f162)在f161)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f163)与f161)或f162)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f164)在严格条件下与f161)或f162)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-17R是如下f171)至f174)中的任一种单链DNA：

f171)序列表中SEQ ID No.73的第8-31位所对应的单链DNA；

f172)在f171)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f173)与f171)或f172)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f174)在严格条件下与f171)或f172)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-18R是如下f181)至f184)中的任一种单链DNA：

f181)序列表中SEQ ID No.74的第8-31位所对应的单链DNA；

f182)在f181)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f183)与f181)或f182)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f184)在严格条件下与f181)或f182)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-19R是如下f191)至f194)中的任一种单链DNA：

f191)序列表中SEQ ID No.75的第8-36位所对应的单链DNA；

f192)在f191)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f193)与f191)或f192)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f194)在严格条件下与f191)或f192)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述C-SARS-CoV-2-20R是如下f201)至f204)中的任一种单链DNA：

f201)序列表中SEQ ID No.76的第8-26位所对应的单链DNA；

f202)在f201)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

f203)与f201)或f202)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；

f204)在严格条件下与f201)或f202)限定的单链DNA杂交的单链DNA。

上述引物组中，a12)、a22)、a32)、a42)、a52)、a62)、a72)、a82)、a92)所述单链DNA分别为序列表中SEQ ID No.1-9所对应的单链DNA；

b12)、b22)、b32)、b42)、b52)、b62)、b72)、b82)所述单链DNA分别为序列表中SEQID No.10-17所对应的单链DNA；

c12)、c22)、c32)、c42)、c52)、c62)、c72)、c82)、c92)、c102)、c112)、c122)、c132)、c142)、c152)、c162)、c172)、c182)、c192)、c202)所述单链DNA分别为序列表中SEQ IDNo.18-37所对应的单链DNA；

d12)、d22)、d32)、d42)、d52)、d62)、d72)、d82)、d92)所述单链DNA分别为序列表中SEQ ID No.40-48所对应的单链DNA；

e12)、e22)、e32)、e42)、e52)、e62)、e72)、e82)所述单链DNA分别为序列表中SEQID No.49-56所对应的单链DNA；

f12)、f22)、f32)、f42)、f52)、f62)、f72)、f82)、f92)、f102)、f112)、f122)、f132)、f142)、f152)、f162)、f172)、f182)、f192)、f202)所述单链DNA分别为序列表中SEQ IDNo.57-76所对应的单链DNA。

上述引物组中，所述正向引物可仅由influenza A-01F、influenza A-02F、influenza A-03F、influenza A-04F、influenza A-05F、influenza A-06F、influenza A-07F、influenza A-08F、influenza A-09F、influenza B-01F、influenza B-02F、influenzaB-03F、influenza B-04F、influenza B-05F、influenza B-06F、influenza B-07F、influenza B-08F、SARS-CoV-2-01F、SARS-CoV-2-02F、SARS-CoV-2-03F、SARS-CoV-2-04F、SARS-CoV-2-05F、SARS-CoV-2-06F、SARS-CoV-2-07F、SARS-CoV-2-08F、SARS-CoV-2-09F、SARS-CoV-2-10F、SARS-CoV-2-11F、SARS-CoV-2-12F、SARS-CoV-2-13F、SARS-CoV-2-14F、SARS-CoV-2-15F、SARS-CoV-2-16F、SARS-CoV-2-17F、SARS-CoV-2-18F、SARS-CoV-2-19F、SARS-CoV-2-20F组成，所述反向引物可仅由influenza A-01R、influenza A-02R、influenza A-03R、influenza A-04R、influenza A-05R、influenza A-06R、influenza A-07R、influenza A-08R、influenza A-09R、influenza B-01R、influenza B-02R、influenzaB-03R、influenza B-04R、influenza B-05R、influenza B-06R、influenza B-07R、influenza B-08R、C-SARS-CoV-2-01R、C-SARS-CoV-2-02R、C-SARS-CoV-2-03R、C-SARS-CoV-2-04R、C-SARS-CoV-2-05R、C-SARS-CoV-2-06R、C-SARS-CoV-2-07R、C-SARS-CoV-2-08R、C-SARS-CoV-2-09R、C-SARS-CoV-2-10R、C-SARS-CoV-2-11R、C-SARS-CoV-2-12R、C-SARS-CoV-2-13R、C-SARS-CoV-2-14R、C-SARS-CoV-2-15R、C-SARS-CoV-2-16R、C-SARS-CoV-2-17R、C-SARS-CoV-2-18R、C-SARS-CoV-2-19R和C-SARS-CoV-2-20R组成。

上述引物组可仅由所述正向引物与所述反向引物组成，还可由所述正向引物、所述反向引物与外参基因的引物(即外参引物)组成。

在本发明的一个实施例中，所述外参基因的引物序列为序列表中SEQ ID No.38、39、77和/或78。

上述引物组中，所述正向引物、所述反向引物和外参基因的引物可包含tag序列(如GGGTGGG)。

上述引物组中各单链DNA均可独立包装，也可包装在一起。上述引物组中各单链DNA的摩尔数均相等。

所述引物组可具有如下任一种或多种用途：

X1、检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒；

X2、制备检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒产品；

X3、筛查或辅助筛查流感病毒和/或新型冠状病毒感染患者；

X4、制备筛查或辅助筛查流感病毒和/或新型冠状病毒感染患者产品；

X5、检测或辅助检测待测样品是否含有流感病毒和/或新型冠状病毒；

X6、制备检测或辅助检测待测样品是否含有流感病毒和/或新型冠状病毒产品；

X7、定量检测或辅助检测待测样品流感病毒和/或新型冠状病毒含量；

X8、制备定量检测或辅助检测待测样品流感病毒和/或新型冠状病毒含量产品；

X9、检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒突变；

X10、制备检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒突变产品；

X11、流感病毒和/或新型冠状病毒基因组建库；

X12、制备流感病毒和/或新型冠状病毒基因组建库产品。

上述引物组中，所述定量可为相对定量(如相对于外参基因的含量)。

本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有所述引物组。

所述试剂盒还可含有建库所需的其他试剂(如MGI或NGS建库所需试剂)、高通量测序所需的其他试剂(如在MGISEQ-2000或MGI或illumina或proton平台测序所需试剂)。

所述试剂盒可具有如下任一种或任多种用途：

X1、检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒；

X2、制备检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒产品；

X3、筛查或辅助筛查流感病毒和/或新型冠状病毒感染患者；

X4、制备筛查或辅助筛查流感病毒和/或新型冠状病毒感染患者产品；

X5、检测或辅助检测待测样品是否含有流感病毒和/或新型冠状病毒；

X6、制备检测或辅助检测待测样品是否含有流感病毒和/或新型冠状病毒产品；

X7、定量检测或辅助检测待测样品流感病毒和/或新型冠状病毒含量；

X8、制备定量检测或辅助检测待测样品流感病毒和/或新型冠状病毒含量产品；

X9、检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒突变；

X10、制备检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒突变产品；

X11、流感病毒和/或新型冠状病毒基因组建库；

X12、制备流感病毒和/或新型冠状病毒基因组建库产品。

所述引物组，或所述试剂盒的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：

X1、检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒；

X2、制备检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒产品；

X3、筛查或辅助筛查流感病毒和/或新型冠状病毒感染患者；

X4、制备筛查或辅助筛查流感病毒和/或新型冠状病毒感染患者产品；

X5、检测或辅助检测待测样品是否含有流感病毒和/或新型冠状病毒；

X6、制备检测或辅助检测待测样品是否含有流感病毒和/或新型冠状病毒产品；

X7、定量检测或辅助检测待测样品流感病毒和/或新型冠状病毒含量；

X8、制备定量检测或辅助检测待测样品流感病毒和/或新型冠状病毒含量产品；

X9、检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒突变；

X10、制备检测或辅助检测流感病毒和/或新型冠状病毒突变产品；

X11、流感病毒和/或新型冠状病毒基因组建库；

X12、制备流感病毒和/或新型冠状病毒基因组建库产品。

本发明中，所述流感病毒可为甲型流感病毒(如HA(1-16)、NA(1-9)任一亚型)和/或乙型流感病毒(如BV或BY亚型)。

本发明的引物组兼容多种流感型别的引物并覆盖全基因组的特异性引物，还覆盖新冠病毒整个基因组，可以获取病毒的全长及变异信息；所有的引物5’端引入一段5～15bp高Tm值的相同tag序列，一方面增加流感引物的Tm值，使流感与新冠引物可在相同的高温度下退火，提高特异性；另一方面抑制相邻的新冠引物在扩增重叠区域的短片段优势扩增，实现连续区域的一管长PCR扩增。

利用本发明的引物组，采用多重长PCR一管共扩增捕获病毒，通过一步DNA打断、末端修复&加dA和加接头构建PCR free高通量测序文库，进行高通量测序分析。一方面可以通过添加的一定拷贝数的外参，获得病毒的相对含量，另一方面还可以同时获得流感和新冠病毒的全基因组序列数据，突变信息。

本发明引物组的扩增中将反转录和多重长PCR技术合并成一步，减少病毒RNA降解的风险，减少实验步骤；建库中将DNA打断和末端修复&加dA合并一步，进一步减少操作步骤，缩短建库时间。

附图说明

图1为实验流程图。

图2为Tag序列抑制引物二聚体扩增和新冠重叠区域短片段扩增原理图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

甲流标准品GWA：甲流H1N1 RNA质控品(菁良基因，货号CA0959)。

乙流标准品GWB：乙流Victoria RNA质控品(菁良基因，货号CA0959)。

新冠病毒标准品GWS：COVID-19RNA质控品(高拷贝)-L(菁良基因，货号CA0959)。

实施例1、检测流感病毒与新型冠状病毒引物组的制备

本实施例提供了一个可以检测甲型流感病毒、乙型流感病毒与新型冠状病毒的引物组(记为流感新冠病毒检测引物组)，其由正向引物组与反向引物组组成，正向引物组由序列表中序列1-39所示的39条单链DNA组成，反向引物组由序列表中序列40-78所示的39条单链DNA组成，流感新冠病毒检测引物组中各引物的摩尔数均相等。各引物组引物信息如表1和表2所示。表1和2中，Influenza A为甲型流感病毒，Influenza B为乙型流感病毒，SARS-CoV-2为新型冠状病毒；lambda-1F、lambda-2F、lambda-1R、lambda-2R均为外参引物；各引物序列中，GGGTGGG为tag序列，R表示A或G，Y表示C或T，S表示G或C，M表示A或C。

表1、正向引物组序列信息

表2、反向引物组序列信息

实施例2、样本的检测

样本类型一：为单一病毒样本，将甲流标准品GWA、乙流标准品GWB和新冠病毒标准品GWS干粉用1mL无核酸酶水溶解,再分别10倍梯度稀释10

样本类型二：为模拟混合病毒样本，分别将稀释10

在每个待扩增的样本中掺入一定量的lambda DNA分子(

采用BGI的甲型流感病毒通用型核酸检测试剂盒对甲流标准品GWA进行Qpcr验证实验步骤如下：按照下表同时分别配制核酸反应体系和内参反应体系：

将所得反应体系按照以下程序进行反应，得到CT值：

采用BGI的乙型流感病毒核酸检测试剂盒对乙流标准品GWB进行Qpcr验证实验步骤如下：按照下表配制反应体系：

将所得反应体系按照以下程序进行反应，得到CT值：

采用BGI的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对新冠病毒标准品GWS进行Qpcr验证实验步骤如下：按照下表配制反应体系：

将所得反应体系按照以下程序进行反应，得到CT值：

Tag序列抑制引物二聚体扩增和新冠重叠区域短片段扩增原理如图2所示，实验流程如图1所示，具体步骤如下：

1.逆转录和长PCR扩增

采用MGI的反转录酶Alpha Reverse Transcriptase(货号:1000014383)、RNA抑制剂RNase inhibitor(货号:1000015146)和2X PCR反应混合物Multiplex PCR Readymix(货号:1000014386)或其他同等功能的试剂进行一步法RT-PCR扩增捕获。

取0.2ml PCR管子置于冰盒上，按照下表配制反应体系：

其中，正向引物池利用无核酸酶水稀释实施例1中的正向引物组得到，其中每条引物的浓度均为20μM；反向引物池利用无核酸酶水稀释实施例1中的反向引物组得到，其中每条引物的浓度均为20μM。

将所得反应体系按照以下程序进行反应：

反应结束得到多重RT-PCR扩增产物，向其中加入40μl的XP beads进行纯化(beckman公司Agencourt AMPure XP磁珠，货号A63881)，所得纯化产物溶解于30μlTE中并定量浓度，即得到RT-PCR纯化产物；

2.PCR free测序文库构建

取上述RT-PCR纯化产物进行高通量文库构建,使用MGI的MGIEasy Fast PCR-FREE酶切文库制备试剂套装(货号940-000019-00)进行建库操作。

取0.2ml PCR管子置于冰盒上，按照下表配制反应体系：

将所得反应体系按照以下程序进行反应：

反应结束得到片段化产物，将所得片段化产物直接连接测序接头引物，按照下表配制连接接头引物体系：

测序接头是MGI的鼓泡型接头引物(Ad153)，包含长链和短链序列，

长链序列：/5Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAANNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACA-3′，其中N为标签序列，引物5′端磷酸化，用于使接头引物与上一步3′端A突出的双链DNA连接。

短链序列：/5Phos/TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3′，引物5′端磷酸化，用于下一步环化。

针对不同测序平台，可以加入不同平台的接头。

设置反应程序：25℃10min；4℃hold，进行反应；

得到的连接接头的产物加入20μl的En-TE和20μl En-beads进行纯化，产物溶解于30μlTE中，得到高通量测序文库。

上机测序:

得到的高通量测序文库进行等质量混合，并进行平行测序，测序平台为MGISEQ-2000，测序类型PE100。

3.数据分析

分析步骤包括过滤低质量序列和接头引物序列、数据比对等基本的步骤，得到的基本信息。

分别统计测序得到甲型流感病毒基因组、乙型流感病毒基因组、新型冠状病毒基因组和外参基因组(lambda DNA)的read总数，如表3～6，将比对到病毒的序列进行全基因组组装，并获得基因的覆盖度和变异情况。

结果：

1、病毒检测和相对定量

其中，Nv表示病毒reads的数量，Ne表示外参reads的数量。

根据公式1可以得到新冠病毒相对于外参的含量Pct％；如表1、表2、表3和表4所示。

当为单一病毒样本时，甲流(即甲型流感病毒)的5个浓度梯度，得到的病毒相对于外参lambda的含量Pct％分别为99.41％，96.72％，84.43％，25.85％和8.15％，随着稀释倍数增加，病毒含量Pct％逐步减少，而在阴性样本水中得到0.13％，和最后一个10

当为病毒混合样本时，1.甲、乙流病毒混合样本检测得到的病毒相对于外参lambda的含量Pct％分别为77.9％和80.5％，而新冠病毒仅为0.4％，有显著差异，因此可以说明该方法检测病毒的准确性及得到的结果可信；2.甲流、新冠病毒混合样本检测得到的病毒相对于外参lambda的含量Pct％分别为38.8％和32.1％，而乙流病毒仅为0.1％，有显著差异；3.乙流、新冠病毒混合样本检测得到的病毒相对于外参lambda的含量Pct％分别为51.7％和41.7％，而乙流病毒仅为0.1％，有显著差异(如表6)。

2、病毒的全基因组覆盖度和变异

甲流、乙流和新冠病毒的5个浓度梯度稀释样本均可以获得一定的病毒序列数据，当稀释倍数小于10

当为病毒混合样本时，病毒均被正确检出，且检出的病毒100x reads覆盖度＞95％，可以获得病毒全长序列。

梯度稀释的所有甲流、乙流和新冠样本文库均未检出变异突变，与标准品序列一致性为100％。

表3、甲流病毒检测结果

表4、乙流病毒检测结果

表5、新冠病毒检测结果

表6、混合病毒检测结果

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110>深圳华大智造科技股份有限公司

<120>流感与新型冠状病毒全基因组共扩增引物池及其建库方法

<160>78

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>23

<212>DNA