一种生产香兰素的酿酒酵母重组菌株及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产香兰素的酿酒酵母重组菌株及其构建方法。

背景技术

香兰素又称香草醛，是世界上使用最广泛的调味料之一，具有“香料之王”的美称，在食品、药品、化妆品、农业等领域被广泛应用。香兰素还具有抗菌、抗氧化、抗突变、降血脂、抗刺痛和抗炎的活性。此外，香兰素还是制造L-多巴、多巴胺和醛胺等药物的重要原料。作为一种植物次级代谢产物，天然香兰素是从兰花的种球中提取的。全世界每年消费的香兰素超过16,000吨，使其成为食品和饮料中最广泛使用的调味品添加剂之一。然而，由于香草兰成长缓慢，其成熟的种子荚果中的香兰素浓度很低，整个香兰素产量中只有一小部分(约0.25％)来自香草兰。因此，这种调味料的市场需求主要由木质素和/或化石碳氢化合物的化学合成来满足，这也被认为是对环境不友好和不可持续的过程。另外，还可利用生物催化法生产，往往可以作为“天然提取的产品”销售，导致价格比“化学合成的产品”香兰素高250倍。

日益增长的需求催生很多生物技术用于合成天然的香兰素。阿魏酸等植物化学物质是天然香兰素生产方法中使用的主要底物。尽管在过去十年中，已经分离和研究了不同的微生物，它们能够将阿魏酸转化为香兰素，但阿魏酸的高价格限制了其应用。

从简单碳源(如葡萄糖)生物合成香兰素更具吸引力，因其碳源更易得、更便宜。2009年，Hansen等以葡萄糖为初始底物，分别向裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中引入来自粪生霉菌的3-脱氢莽草酸脱水酶、诺卡氏菌属Nocardia genus的细菌芳香羧酸还原酶(Carboxylic acid reductase，CAR)和来自人源Homo sapiens 2-氧-甲基转移酶(O-methyltransferase，OMT)，同时敲除降解香兰素的基因，分别获得0.065g/L和0.045g/L香兰素。但其发酵液中合成的香兰素大部分转化为香草醇，下游分离成本也很高，使得香兰素的纯度和产量受限。因此，需进一步提高利用微生物合成香兰素的效率，以满足日益增长的市场需求。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种生产香兰素的酿酒酵母重组菌株的构建方法。该重组菌株可提高香兰素的纯度和产量。

为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种生产香兰素的酿酒酵母重组菌株的构建方法，其包括：

将酿酒酵母的ADH6基因、ADH7基因、SFA1基因、GRE2基因、HFD1基因、GRE3基因、GCY1基因、YPR1基因、YDL124W基因、ARI1基因、AAD3基因和YDR541C基因进行敲除，获得工程菌株；

使所述工程菌株异源表达3-脱氢莽草酸脱水酶ASBF或AROZ、2-氧-甲基转移酶HsOMT、芳香羧酸还原酶CAR和磷酸泛酸转移酶PPTASE，获得酿酒酵母重组菌株。

根据本发明实施例的一种生产香兰素的酿酒酵母重组菌株的构建方法，该方法通过敲除酿酒酵母氧化还原酶ADH6、ADH7、SFA1、GRE2、HFD1、GRE3、GCY1、YPR1、YDL124W、ARI1、AAD3和YDR541C，获得可避免香兰素被内源氧化还原酶转变为香草醇和香草酸的菌株，再整合异源表达3-脱氢莽草酸脱水酶ASBF或AROZ、2-氧-甲基转移酶HsOMT、芳香羧酸还原酶CAR和磷酸泛酸转移酶PPTASE，获得重组菌株，重组菌株经培养120h后，胞外香兰素(纯度>99％)含量为85.39±0.94mg/L，解决了酿酒酵母无法生产高纯度香兰素的问题，具有广阔的工业化应用前景。

另外，根据本发明上述实施例提出的生产香兰素的酿酒酵母重组菌株的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：

可选地，包括以下步骤：

(1)PCR扩增获取基因编辑技术的gRNA表达片段：ADH6、ADH7、SFA1、GRE2、HFD1、GRE3、GCY1、YPR1、YDL124W、ARI1、AAD3和YDR541C，将gRNA表达片段分别与表达载体p426-SNR52-GGA连接，得到重组质粒p426-gRNA(ADH6)、重组质粒p426-gRNA(ADH7)、重组质粒p426-gRNA(SFA1)、重组质粒p426-gRNA(GRE2)、重组质粒p426-gRNA(HFD1)、重组质粒p426-gRNA(GRE3)、重组质粒p426-gRNA(GCY1)、重组质粒p426-gRNA(YPR1)、重组质粒p426-gRNA(YDL124W)、重组质粒p426-gRNA(ARI1)、重组质粒p426-gRNA(AAD3)和重组质粒p426-gRNA(YDR541C)；

(2)将所述重组质粒p426-gRNA(ADH6)、重组质粒p426-gRNA(ADH7)、重组质粒p426-gRNA(SFA1)、重组质粒p426-gRNA(GRE2)、重组质粒p426-gRNA(HFD1)、重组质粒p426-gRNA(GRE3)、重组质粒p426-gRNA(GCY1)、重组质粒p426-gRNA(YPR1)、重组质粒p426-gRNA(YDL124W)、重组质粒p426-gRNA(ARI1)、重组质粒p426-gRNA(AAD3)和重组质粒p426-gRNA(YDR541C)与其对应的基因编辑整合片段按顺序依次转入酿酒酵母感受态细胞，得到重组菌株JS-RARE3；

(3)向重组菌株JS-RARE3中导入重组质粒pRS423-ASBF/HsOMT和重组质粒pRS425-CAR/PPTASE，以便得到酿酒酵母重组菌株JS-A4；或者，向重组菌株JS-RARE3中导入重组质粒pRS423-AROZ/HsOMT质粒和pRS425-CAR/PPTASE质粒，得到酿酒酵母重组菌株JS-A5。

进一步地，还包括将重组质粒p426-gRNA(ROX1)和基因编辑整合片段ΔROX1P

进一步地，还包括将重组质粒p426-gRNA(BTS1)和基因编辑整合片段ΔBTS1P

可选地，所述重组质粒pRS423-ASBF/HsOMT是以蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:72所示的ASBF_P1_fwd和核苷酸序列如SEQ IDNO:73所示的ASBF_P1_rev为引物，经PCR扩增得到ASBF基因，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物；以核苷酸序列如SEQ ID NO:82所示的人工合成的基因HsOMT为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:74所示的HsOMT_P2_fwd和核苷酸序列如SEQ ID NO:75所示的HsOMT_P2_rev为引物，经PCR扩增得到HsOMT基因，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物；pRS423A-GGA1质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后ASBF基因片段和HsOMT基因片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶连接，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQID NO:75引物验证获取阳性克隆菌落，提取表达质粒pRS423-ASBF/HsOMT。

可选地，所述重组质粒pRS425-CAR/PPTASE是以塞格尼氏杆菌Segniliparusrugosus基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:78所示的CAR_P1_fwd和核苷酸序列如SEQ ID NO:79所示的CAR_P1_rev为引物，经PCR扩增得到CAR基因，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物；以艾阿华诺卡氏菌Nocardia iowensis基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:80所示的PPTASE_P2_fwd和核苷酸序列如SEQ ID NO:81所示的PPTASE_P2_rev为引物，经PCR扩增得到PPTASE基因，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物；pRS425A-GGA1质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与CAR基因片段和PPTASE基因片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶连接，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81验证获取阳性克隆菌落，提取表达质粒pRS425-CAR/PPTASE。

可选地，所述重组质粒pRS423-AROZ/HsOMT是以p423-H7-ArCatA,TaGDC1,PaAroZ载体为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示的AROZ_P1_fwd和核苷酸序列如SEQ IDNO:77所示的AROZ_P1_rev为引物，经PCR扩增得到AROZ基因，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物；pRS423A-GGA1质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，AROZ基因片段和HsOMT基因片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶连接，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77引物验证获取阳性克隆菌落，提取表达质粒pRS423-AROZ/HsOMT。

可选地，所述重组质粒p426-gRNA(ROX1)是以p426-SNR52-gRNA载体为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的F_gRNA.ROX1和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物，经PCR扩增得到gRNA(ROX1)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物；将胶回收产物与表达载体p426-SNR52-GGA连接。

可选地，所述基因编辑整合片段ΔROX1 P

进一步地，所述重组质粒p426-gRNA(BTS1)是以p426-SNR52-gRNA载体为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的F_gRNA.BTS1和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物，经PCR扩增得到gRNA(BTS1)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物；将胶回收产物与表达载体p426-SNR52-GGA连接。

进一步地，所述基因编辑整合片段ΔBTS1 P

在本发明的第二个方面，本发明提出由上述的构建方法构建得到的生产香兰素的酿酒酵母重组菌株。

根据本发明实施例的重组酿酒酵母菌，该重组菌株可提高香兰素的纯度和产量。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为酿酒酵母中异源表达ASBF或AROZ、HsOMT、CAR、PPTASE四种酶催化合成香兰素的路径；

图2为根据本发明实施例的酿酒酵母工程菌JS-CR、JS-RARE1、JS-RARE2、JS-RARE3香兰素消耗分析图；

图3为根据本发明实施例的酿酒酵母工程菌JS-A1、JS-A2、JS-A3、JS-A4、JS-A5的发酵产量图；

图4为根据本发明实施例的酿酒酵母工程菌JS-B2发酵产量图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得；涉及的实验如无特别说明，均为常规实验方法。

所用材料来源：工程菌株JS-CR为酿酒酵母BY4741衍生(Fan,C.,EngineeringSaccharomyces cerevisiae-based biosensors for copper detection,MicrobialBiotechnology.2022,00,1–7.Available from:https://doi.org/10.1111/1751-7915.14105)和DH5α为市售，DH5α用于载体构建。酿酒酵母表达载体p426-SNR52-gRNA、p426-SNR52-GGA、p414-TEF2-Cas9、pRS423-GGA1、pRS425-GGA1为市售。Phusion高保真DNA聚合酶、T4连接酶、限制性内切酶购买自厦门鹭隆生物科技发展有限公司。质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒和酵母基因组DNA提取试剂盒购买自上海生物工程有限公司。

LB培养基组成为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl，双蒸水补齐至1L，0.1Mpa压力115℃下灭菌30min。

YPD培养基组成为：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖，双蒸水补齐至1L，0.1Mpa压力115℃下灭菌30min。

YNBD-TRP培养基组成为：6.7g/L酵母氮源基础、1.4g/L酵母营养缺陷型培养基补充剂(不含色氨酸)、20g/L D-葡萄糖，双蒸水补齐至1L，0.1Mpa压力115℃下灭菌20min。

YNBD-TRP-URA培养基组成为：6.7g/L酵母氮源基础、1.4g/L酵母营养缺陷型培养基补充剂(不含色氨酸和尿嘧啶)、20g/L D-葡萄糖，双蒸水补齐至1L，0.1Mpa压力115℃下灭菌20min。

YNBD-HIS-LEU培养基组成为：6.7g/L酵母氮源基础、1.4g/L酵母营养缺陷型培养基补充剂(不含组氨酸和亮氨酸)、20g/L D-葡萄糖，双蒸水补齐至1L，0.1Mpa压力115℃下灭菌20min。

YNBD全培养基组成为：6.7g/L酵母氮源基础、1.4g/L酵母营养缺陷型培养基补充剂、20g/L D-葡萄糖，双蒸水补齐至1L，0.1Mpa压力115℃下灭菌20min。

100x 5-氟乳清酸：100mg 5-氟乳清酸使用DMSO定溶于1mL。

香兰素/香草醇含量高效液相色谱的检测：

发酵后的发酵液吸出400μL，加入400μL100％乙醇，离心机14000rpm离心5min，用过滤进入液相瓶；使用Shimadzu高效液相色谱仪检测分析，采用光电二极管阵列检测器(工作波长275nm)；色谱条件为：0分钟，95％溶剂A+5％溶剂B；8分钟，20％溶剂A+80％溶剂B；10分钟，80％溶剂A+20％溶剂B；11分钟，95％溶剂A+5％溶剂B。采用Shimadzu C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速为1mL/min，流动相包括溶剂A(0.1％三氟乙酸水溶液)和溶剂B(0.1％三氟乙酸乙腈溶液)，柱温35℃、进样量10μL，测定香兰素和香草醇的含量。

下述实施例中所涉及质粒的构建在E.coli DH5α中进行，质粒构建完成后作为敲除或表达载体，转化到酿酒酵母JS-CR中进行基因敲除和异源表达。

表1 PCR扩增所用引物

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下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1构建CRISPR的gRNA表达模块

(1)构建p426-gRNA(ADH6)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的F_gRNA.AHD6和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(ADH6)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(ADH6)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(ADH6)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(2)构建p426-gRNA(ADH7)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的F_gRNA.ADH7和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(ADH7)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(ADH7)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(ADH7)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(3)构建p426-gRNA(SFA1)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的F_gRNA.SFA1和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(SFA1)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(SFA1)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(SFA1)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(4)构建p426-gRNA(GRE2)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的F_gRNA.GRE2和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(GRE2)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(GRE2)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(GRE2)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(5)构建p426-gRNA(HFD1)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的F_gRNA.HFD1和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(HFD1)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(HFD1)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(HFD1)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(6)构建p426-gRNA(GRE3)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的F_gRNA.GRE3和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(GRE3)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(GRE3)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(GRE3)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(7)构建p426-gRNA(GCY1)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的F_gRNA.GCY1和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(GCY1)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(GCY1)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(GCY1)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(8)构建p426-gRNA(YPR1)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的F_gRNA.YPR1和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(YPR1)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(YPR1)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(YPR1)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(9)构建p426-gRNA(YDL124W)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的F_gRNA.YDL124W和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(YDL124W)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(YDL124W)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(YDL124W)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(10)构建p426-gRNA(ARI1)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的F_gRNA.ARI1和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(ARI1)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(ARI1)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(ARI1)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(11)构建p426-gRNA(AAD3)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的F_gRNA.AAD3和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(AAD3)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(AAD3)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(AAD3)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(12)构建p426-gRNA(YDR541C)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的F_gRNA.YDR541C和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(YDR541C)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(YDR541C)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(YDR541C)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(13)构建p426-gRNA(BTS1)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的F_gRNA.BTS1和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(BTS1)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(BTS1)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(BTS1)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(14)构建p426-gRNA(ROX1)质粒：

以p426-SNR52-gRNA载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的F_gRNA.ROX1和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的R_SUP4为引物(表1)，经PCR扩增得到gRNA(ROX1)片段，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。p426-SNR52-GGA质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与gRNA(ROX1)片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环4次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15引物验证获取阳性克隆菌落，提取gRNA表达质粒p426-gRNA(ROX1)，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

实施例2靶向敲除片段制备

(1)以核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的F-ADH6-Del和核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的R-ADH6-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到ADH6敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

(2)以核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示的F-ADH7-Del和核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示的R-ADH-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到ADH7敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

(3)以核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示的F-SFA1-Del和核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示的R-SFA1-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到SFA1敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

(4)以核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示的F-GRE2-Del和核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示的R-GRE2-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到GRE2敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

(5)以核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示的F-HFD1-Del和核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示的R-HFD1-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到HFD1敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

(6)以核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示的F-GRE3-Del和核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示的R-GRE3-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到GRE3敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

(7)以核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示的F-GCY1-Del和核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示的R-GCY1-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到GCY1敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

(8)以核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示的F-YPR1-Del和核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示的R-YPR1-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到YPR1敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

(9)以核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示的F-YDL124W-Del和核苷酸序列如SEQ IDNO:33所示的R-YDL124W-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到YDL124W敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

(10)以核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示的F-ARI1-Del和核苷酸序列如SEQ IDNO:35所示的R-ARI1-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到ARI1敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

(11)以核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示的F-AAD3-Del和核苷酸序列如SEQ IDNO:37所示的R-AAD3-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到AAD3敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

(12)以核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示的F-YDR541C-Del和核苷酸序列如SEQ IDNO:39所示的R-YDR541C-Del为引物(表1)，经PCR扩增得到YDR541C敲除整合片段，PCR扩增条件为94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。

实施例3构建质粒

(1)以蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus基因组(NZ_CP017060.1)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:72所示的ASBF_P1_fwd和核苷酸序列如SEQ ID NO:73所示的ASBF_P1_rev为引物(表1)，经PCR扩增得到ASBF基因，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃15s，56℃2min，72℃4min，循环30次；72℃2min。以核苷酸序列如SEQ ID NO:82所示的人工合成的基因HsOMT为模板，以核苷酸序列如SEQ IDNO:74所示的HsOMT_P2_fwd和核苷酸序列如SEQ ID NO:75所示的HsOMT_P2_rev为引物(表1)，经PCR扩增得到HsOMT基因，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃15s，56℃2min，72℃4min，循环30次；72℃2min。pRS423A-GGA1质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后ASBF基因片段和HsOMT基因片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环8次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75引物验证获取阳性克隆菌落，提取表达质粒pRS423-ASBF/HsOMT，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(2)以p423-H7-ArCatA,TaGDC1,PaAroZ载体(Brückner Christine,et al.,Anexpanded enzyme toolbox for production of cis,cis-muconic acid and othershikimate pathway derivatives in Saccharomyces cerevisiae,FEMS YeastResearch.2018,2:2.)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示的AROZ_P1_fwd和核苷酸序列如SEQ ID NO:77所示的AROZ_P1_rev为引物(表1)，经PCR扩增得到AROZ基因，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃15s，56℃2min，72℃4min，循环30次；72℃2min。随后AROZ基因片段和步骤(1)获得的HsOMT基因片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环8次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77引物验证获取阳性克隆菌落，提取表达质粒pRS423-AROZ/HsOMT，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

(3)以塞格尼氏杆菌Segniliparus rugosus基因组(NZ_KI391953.1)为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:78所示的CAR_P1_fwd和核苷酸序列如SEQ ID NO:79所示的CAR_P1_rev为引物(表1)，经PCR扩增得到CAR基因，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃15s，56℃2min，72℃4min，循环30次；72℃2min。以艾阿华诺卡氏菌Nocardia iowensis基因组(NZ_CP078145.1)为模板，以核苷酸序列如SEQ IDNO:80所示的PPTASE_P2_fwd和核苷酸序列如SEQ ID NO:81所示的PPTASE_P2_rev为引物(表1)，经PCR扩增得到PPTASE基因，将目的条带经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。PCR扩增条件：98℃2min，98℃15s，56℃2min，72℃4min，循环30次；72℃2min。pRS425A-GGA1质粒通过BsaI酶切4h后，胶回收大片段和小片段，随后与CAR基因片段和PPTASE基因片段混合，使用T4连接酶和BsaI酶，连接条件为：37℃10min；37℃10min，16℃10min，循环8次；20℃10min，将连接好的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用核苷酸序列如SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81验证获取阳性克隆菌落，提取表达质粒pRS425-CAR/PPTASE，测序结果与设计的质粒DNA序列完全一致。

实施例4靶向整合表达片段制备

(1)以实施例3步骤(2)中的pRS423-AROZ/HsOMT质粒为模板，以核苷酸序列如SEQID NO:42所示的F-ROX1-Int和核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示的R-ROX1-Int为引物(表1)，经PCR扩增得到敲除整合片段ΔROX1 P

(2)以实施例3步骤(3)中的pRS423-CAR/PPTASE质粒为模板，以核苷酸序列如SEQID NO:40所示的F-BTS1-Int和核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示的R-BTS1-Int为引物(表1)，经PCR扩增得到敲除整合片段ΔBTS1 P

实施例5：构建工程改造菌株JS-RARE1

(1)将酿酒酵母JS-CR制备感受态细胞，转化入p414-TEF2-Cas9质粒，在YNBD-TRP平板上于30℃培养2～4天，获得的单菌落命名为酿酒酵母Y1。再将Y1制备感受态细胞，将实施例1步骤(1)中获得的质粒p426-gRNA(ADH6)和实施例2步骤(1)中获得的ADH6敲除整合片段转化入Y1感受态细胞中，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6，命名为重组菌株JS-M1。

(2)将步骤(1)中的JS-M1划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(AHD6)质粒，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(2)中p426-gRNA(ADH7)和实施例2步骤(2)中的AHD7敲除整合片段，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6ΔADH7，命名为重组菌株JS-M2。

(3)将步骤(2)中的JS-M2划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(ADH7)质粒，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(3)p426-gRNA(SFA1)和实施例2步骤(3)中的SFA1敲除整合片段，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6ΔADH7ΔSFA1，命名为重组菌株JS-M3。

(4)将步骤(3)中的JS-M3划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(SFA1)质粒，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(4)p426-gRNA(GRE2)和实施例2步骤(4)中的GRE2敲除整合片段，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6ΔADH7ΔSFA1ΔGRE2，命名为重组菌株JS-M4。

(5)将步骤(4)中的JS-M4划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(GRE2)质粒，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(5)p426-gRNA(HFD1)和实施例2步骤(5)中的HFD1敲除整合片段，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6ΔADH7ΔSFA1ΔGRE2ΔHFD1，命名为重组菌株JS-M5，随后划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(HFD1)质粒，并命名为JS-RARE1。

实施例6：构建工程改造菌株JS-RARE2

(1)将实施例5步骤(5)中的JS-RARE1制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(6)p426-gRNA(GRE3)和实施例2步骤(6)中的GRE3敲除整合片段，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6ΔADH7ΔSFA1ΔGRE2ΔHFD1ΔGRE3，命名为重组菌株JS-M6。

(2)将步骤(1)中的JS-M6划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(GRE3)质粒，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(7)p426-gRNA(GCY1)和实施例2步骤(7)中的GCY1敲除整合片段，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6ΔADH7ΔSFA1ΔGRE2ΔHFD1ΔGRE3ΔGCY1，命名为重组菌株JS-M7。

(3)将步骤(2)中的JS-M7划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(GCY1)质粒，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(8)p426-gRNA(YPR1)和实施例2步骤(8)中的YPR1敲除整合片段，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6ΔADH7ΔSFA1ΔGRE2ΔHFD1ΔGRE3ΔGCY1ΔYPR1，命名为重组菌株JS-M8。

(4)将步骤(3)中的JS-M8划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(YPR1)质粒，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(9)p426-gRNA(YDL124W)和实施例2步骤(9)中的YDL124W敲除整合片段，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6ΔADH7ΔSFA1ΔGRE2ΔHFD1ΔGRE3ΔGCY1ΔYPR1ΔYDL124W，命名为重组菌株JS-M9，随后划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(YDL124W)质粒，并命名为JS-RARE2。

实施例7：构建工程改造菌株JS-RARE3

(1)将实施例6步骤(4)中的JS-RARE2制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(10)p426-gRNA(ARI1)和实施例2步骤(10)中的ARI1敲除整合片段，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6ΔADH7ΔSFA1ΔGRE2ΔHFD1ΔGRE3ΔGCY1ΔYPR1ΔYDL124WΔARI1，命名为重组菌株JS-M10。

(2)将步骤(1)中的JS-M10划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(ARI1)质粒，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(11)p426-gRNA(AAD3)和实施例2步骤(11)中的AAD3敲除整合片段，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6ΔADH7ΔSFA1ΔGRE2ΔHFD1ΔGRE3ΔGCY1ΔYPR1ΔYDL124WΔARI1ΔAAD3，命名为重组菌株JS-M11。

(3)将步骤(2)中的JS-M11划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(AAD3)质粒，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(12)p426-gRNA(YDR541C)和实施例2步骤(12)中的YDR541C敲除整合片段，在YNBD-TRP-URA平板上于30℃培养2～4天，将长出的单菌落分别划在YNBD-TRP-URA固体平板上，用引物SEQID NO:66、SEQ ID NO:67进行PCR验证，正确的酿酒酵母菌株JS-CRΔADH6ΔADH7ΔSFA1ΔGRE2ΔHFD1ΔGRE3ΔGCY1ΔYPR1ΔYDL124WΔARI1ΔAAD3ΔYDR541C，命名为重组菌株JS-M12，随后划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(YDR541C)质粒，并命名为JS-RARE3。

实施例8：不同改造菌株香兰素的积累能力

分别将实施例5、实施例6、实施例7中构建的重组菌株JS-RARE1、重组菌株JS-RARE2、重组菌株JS-RARE3和对照菌株JS-CR，分别挑取单克隆接种装有2mL YNBD全液体培养基的15mL小摇管中，在30℃，250rpm条件下培养12～16h，制备得到种子液，将制备得到的种子液按1％(v/v)的接种量接种于装有5mL YNBD全液体培养基的50mL离心管，在30℃，250rpm条件下培养16h。离心机5000rpm离心1min，去上清收集菌体，再用5mL磷酸缓冲液(200mM，pH＝8.0)洗两次，去上清收集菌体；在收集的菌体中加入5mL香兰素消耗液(包含5mM香兰素、20g/L葡萄糖、200mM磷酸缓冲液PH＝8.0补齐至5mL)，分别于4h、8h、24h和48h各取400uL加入，按照1：1比例加入100％乙醇，再用漩涡振荡器混均，离心机14000rpm离心5min，上清经滤膜过滤于液相进样瓶，进行液相色谱仪进行检测，通过与香兰素、香草醇标品峰面积进行换算得出重组菌株的消耗情况。

结果如图2所示，对照菌株JS-CR在48h，香兰素已消耗殆尽，而重组菌株JS-RARE1、JS-RARE2、JS-RARE3，随着氧化还原酶基因敲除的增加，香兰素转化为香草醇的量变少且改造菌株JS-RARE3几乎不会把香兰素转变为香草醇。

实施例9：构建合成香兰素菌株JS-A1

将工程菌株JS-CR制备感受态细胞，转化入实施例3中获取的pRS423-ASBF/HsOMT质粒和pRS425-CAR/PPTASE质粒，在YNBD-HIS-LEU平板上于30℃培养2～4天，获取阳性克隆JS-A1酿酒酵母重组菌株。

实施例10：构建合成香兰素菌株JS-A2

将实施例5步骤(5)中构建的工程菌株JS-RARE1通过在YPD固体培养基传代培养去除Cas9表达载体，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例3中获取的pRS423-ASBF/HsOMT质粒和pRS425-CAR/PPTASE质粒，在YNBD-HIS-LEU平板上于30℃培养2～4天，获取阳性克隆JS-A2酿酒酵母重组菌株。

实施例11：构建合成香兰素菌株JS-A3

将实施例6步骤(4)中构建的工程菌株JS-RARE2通过在YPD固体培养基传代培养去除Cas9表达载体，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例3中获取的pRS423-ASBF/HsOMT质粒和pRS425-CAR/PPTASE质粒，在YNBD-HIS-LEU平板上于30℃培养2～4天，获取阳性克隆JS-A3酿酒酵母重组菌株。

实施例12：构建合成香兰素菌株JS-A4

将实施例7步骤(3)中构建的工程菌株JS-RARE3通过在YPD固体培养基传代培养去除Cas9表达载体，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例3中获取的pRS423-ASBF/HsOMT质粒和pRS425-CAR/PPTASE质粒，在YNBD-HIS-LEU平板上于30℃培养2～4天，获取阳性克隆JS-A4酿酒酵母重组菌株。

实施例13：构建合成香兰素菌株JS-A5

将实施例7步骤(3)中构建的工程菌株JS-RARE3通过在YPD固体培养基传代培养去除Cas9表达载体，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例3中获取的pRS423-AROZ/HsOMT质粒和pRS425-CAR/PPTASE质粒，在YNBD-HIS-LEU平板上于30℃培养2～4天，获取阳性克隆JS-A5酿酒酵母重组菌株。

实施例14：构建工程改造菌株JS-B1

将实施例7步骤(3)中构建的工程菌株JS-RARE3用于制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(14)p426-gRNA(ROX1)和实施例4步骤(1)中的敲除整合片段ΔROX1 P

实施例15：构建工程改造菌株JS-B2

将实施例14步骤(1)中构建的工程菌株JS-B1划线于含有浓度为1mg/mL的5-氟乳清酸的YNBD-TRP平板上去除胞内的p426-gRNA(ROX1)质粒，之后用于制备感受态细胞，转化入实施例1步骤(13)p426-gRNA(BTS1)和实施例4步骤(2)中的敲除整合片段ΔBTS1 P

实施例16：摇瓶发酵条件下重组菌株的香兰素和香草醇的产量

(1)分别将实施例9、实施例10、实施例11、实施例12和实施例13中构建的重组菌株JS-A1、重组菌株JS-A2、重组菌株JS-A3、重组菌株JS-A4、重组菌株JS-A5，分别挑取单克隆接种装有2mL YNBD-HIS-LEU液体培养基的15mL小摇管中，在30℃，250rpm条件下培养12～16h，制备得到种子液，将制备得到的种子液按1％(v/v)的接种量接种于装有20mL YNBD-HIS-LEU液体培养基的250mL三角瓶，并加入20μM硫酸铜诱导表达，在30℃，250rpm条件下培养120h，制备得到发酵液。

(2)将实施例15中构建的重组菌株JS-B2单克隆接种于装有2mL YNBD全液体培养基的15mL小摇管中，在30℃，250rpm条件下培养12～16h，制备得到种子液，将制备得到的种子液按1％(v/v)的接种量接种于装有20mL YNBD全液体培养基的250mL三角瓶，并加入20μM硫酸铜诱导表达，在30℃，250rpm条件下培养120h，制备得到发酵液。

(3)计算胞外香兰素、香草醇的产量：

将发酵液中吸取400μL，加入400μL 100％乙醇，漩涡振荡器混均，离心机14000rpm离心5min，上清经滤膜过滤于液相进样瓶，进行高效液相色谱检测，通过与香兰素、香草醇标品峰面积进行换算得出工程菌株发酵产量。

结果如表2和图3所示，JS-A1菌株胞外香草醇含量为29.35±2.00mg/L；JS-A2菌株胞外香兰素含量为11.66±0.38mg/L和香草醇含量为28.26±1.80mg/L；JS-A3菌株胞外香兰素含量为11.82±1.44mg/L和香草醇含量为20.81±3.27mg/L；JS-A4菌株胞外香兰素含量为21.91±1.08mg/L；JS-A5菌株胞外香兰素含量为38.12±1.31mg/L，说明重组菌株JS-RARE3利用pRS423-ASBF/HsOMT质粒和pRS425-CAR/PPTASE质粒表达，可合成高纯度香兰素。同时，重组菌株JS-A5中使用AROZ替换ASBF，香兰素产量提高了73.9％。

如表2和图4所示，JS-B2菌株胞外香兰素含量为85.39±0.94mg/L，说明香兰素合成途径整合到基因组中，相比于质粒表达，香兰素产量提高了124％。

表2：不同重组酿酒酵母胞外分泌香兰素、香草醇产量

综上，根据本发明实施例的酿酒酵母重组菌株，通过敲除酿酒酵母氧化还原酶ADH6、ADH7、SFA1、GRE2、HFD1、GRE3、GCY1、YPR1、YDL124W、ARI1、AAD3和YDR541C，最终构建的重组菌株JS-RARE3可避免香兰素被内源氧化还原酶转变为香草醇和香草酸，通过质粒异源表达3-脱氢莽草酸脱水酶ASBF和2-氧-甲基转移酶HsOMT、芳香羧酸还原酶CAR和磷酸泛酸转移酶PPTASE，重组菌株经培养120小时后，胞外香兰素(纯度>99％)含量为21.91±1.08mg/L，把3-脱氢莽草酸脱水酶ASBF替换为类似功能的AROZ，在重组菌株JS-A5菌株摇瓶发酵中，胞外香兰素(纯度>99％)含量为38.12±1.31mg/L。为了解决质粒表达的不稳定性，进一步把3-脱氢莽草酸脱水酶AROZ、2-氧-甲基转移酶HsOMT、芳香羧酸还原酶CAR和磷酸泛酸转移酶PPTASE整合到工程菌株JS-RARE3中，得到重组菌株JS-B2，经培养120小时后，最终胞外香兰素(纯度>99％)产量达到85.39±0.94mg/L，解决了酿酒酵母无法稳定生产高纯度香兰素的问题，具有广阔的工业化应用前景。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。