一种表达PCV2、PCV3 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体、构建方法与应用

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，尤其涉及一种表达PCV2、PCV3 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体、构建方法与应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是环状单链DNA病毒，无囊膜，属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)。PCV2自1998年被发现后，一直是一种全球传播的频发病原，感染的猪只会出现多系统衰竭症、肠炎、肺炎和生殖障碍等症状，这些疾病被统称为猪圆环病毒病(PCVD)或猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。2016年，PALINSKI在患有猪皮炎肾病综合征(PDNS)、生殖衰竭、心肌炎和多系统炎症的母猪的流产胎儿中检测到了一种新型圆环病毒，命名为PCV3，其与PCV2仅有37％的同源性。随着进一步的研究发现，PCV3在患病或部分健康猪只中均可检测出，主要导致猪只生殖障碍、皮肤疾病以及多系统炎症。许多研究报道指出，猪单独感染PCV单一亚型时不会产生严重的PCVD症状，而PCV2与PCV3之间的共感染会加重临床症状的表现。因此，同时免疫PCV2和PCV3的联合疫苗的研发，对生产上有重要意义。

细胞因子在免疫反应中发挥着重要作用，基于他们功能的不同，细胞因子可以分为炎性因子，Th1和Th2型细胞因子。其中，IL-4是由Th2细胞分泌的细胞因子，它主要在体液免疫中发挥重要作用,如影响免疫球蛋白的产生、类型转变和分泌。除此之外，IL-4在调节淋巴细胞，巨噬细胞，成纤维细胞等细胞的增殖、凋亡方面也发挥着不可替代的作用。因此将其作为疫苗的分子佐剂，可以有效增强免疫反应，加强疫苗效果。

PCV2、PCV3和PRV是危害全球养猪业的重要传染病，在我国很多猪场流行，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。PCV2和PCV3作为近年来常见的混合感染病毒，到目前为止尚无联合疫苗用来防控。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种表达PCV2、PCV3 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将SEQ ID NO.1序列插入到含有伪狂犬gI和28K基因序列同源臂的pEGFP-gI28k真核表达质粒中，获得pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4载体；

(2)pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4质粒和psgRNA-gE质粒转染BHK-21细胞，再接种PRV-XJ-ΔTK病毒液；

(3)待细胞出现80％的病变并观察到发出绿色荧光的病毒蚀斑时，将细胞反复冻融，离心取上清，上清液中含有表达PCV2Cap、PCV3Cap和IL-4且缺失gE、gI、TK的PRV真核表达载体rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4。

进一步地，所述步骤(1)中SEQ ID NO.1序列插入了pEGFP-gI28k真核表达质粒XhoI和BclI酶切识别位点之间。

更进一步地，所述步骤(2)中pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4质粒和psgRNA-gE质粒转染BHK-21细胞24h后，再接种PRV-XJ-ΔTK病毒液。

更进一步地，还包括步骤(4)rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4的纯化。

更进一步地，所述步骤(4)rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4的纯化采用了96孔板有限稀释法和6孔板病毒噬斑纯化方法。

本发明的目的之二在于提供上述构建方法构建得到的重组伪狂犬病毒载体rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4。

本发明的目的之三在于提供上述重组伪狂犬病毒载体rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4在制备猪圆环病毒疫苗中的应用。

进一步地，所述猪圆环病毒为PCV2和PCV3。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明以PRV分离株XJ株为亲本毒株，利用同源重组技术和Crisprcas基因编辑技术构建共表达PCV2Cap蛋白、PCV3Cap蛋白和IL-4蛋白的重组伪狂犬病毒，在小鼠模型中对该重组病毒疫苗的体液免疫和细胞免疫效应进行评价。其不仅达到一针多免的效果，还使用分子佐剂增强疫苗的免疫原性，形成PCV2和PCV3重组伪狂犬病毒减毒活疫苗的初步探索，为研究开发出有效的联合疫苗提供思路。

附图说明

图1为实施例1中质粒CRISPR/Cas-gE和pEGFP-gI28K-2Cap-3Cap-IL4共转染24h后表达带有EGFP绿色荧光的蛋白图。

图2为实施例1中rPRVXJ-△gE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4病毒噬斑图。

图3为实施例1中rPRVXJ-△gE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4F21蛋白样品中外源蛋白PCV2Cap、PCV3 Cap、IL-4的表达情况，其中A：PCV2 Cap；B：PCV3 Cap；C：IL-4。

具体实施方式

实施例1

1.转移质粒的设计和合成

根据PCV2 Cap、PCV3 Cap和IL-4蛋白序列，人工设计能够表达PCV2Cap、PCV3Cap和IL-4蛋白的核酸序列，顺序为XhoI-PCV2Cap-

2.重组蛋白真核表达载体的构建

常规方法传代BHK-21细胞至12孔板，待细胞长至70％～80％时使用Lipefectamine TM3000转染试剂转染(购于Invitrogen公司)，将转移载体pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4质粒和psgRNA-gE质粒转染BHK-21细胞。具体实施步骤为：配制溶液A和溶液B，溶液A为DMEM70μL+LipofectamineTM30007.5μL；溶液B为DMEM70μL+P3000TM5μL+5μg质粒(pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4和CRISPR-CasgE各2.5μg)。将溶液A和溶液B各自震荡混匀，然后将溶液B加入溶液A后点震几次得到混合液，室温静置孵育15min。将上步得到的混合液逐滴滴入铺有BHK-21细胞的12孔板混匀进行转染，随后将细胞置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。转染后12小时可观察到绿色荧光蛋白的表达(参见图1)，在转染24h后每孔加入5μLPRV-XJ-ΔTK病毒液，构建重组伪狂犬病毒株。继续培养24-48小时，待细胞出现80％的病变并观察到发出绿色荧光的病毒蚀斑时(参见图2)将细胞置-80℃反复冻融三次，12000rpm离心取上清，上清液中含有表达PCV2Cap、PCV3Cap和IL-4且缺失gE、gI、TK的PRV真核表达载体，简称为rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4。将该上清液经96孔板有限稀释法和6孔板病毒噬斑纯化方法得到纯化的表达载体，于-80℃保存。

96孔板有限稀释法：常规方法传代BHK-21细胞至96孔板中，待细胞长至致密单层时，取-80℃保存的含有rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4表达载体的上清液，使用无血清DMEM细胞培养液进行10倍梯度稀释。取10

6孔板病毒噬斑纯化方法：常规方法传代BHK-21细胞至6孔板中，待细胞长至致密单层时，去培养液，用PBS润洗细胞3次。取从上述方法中得到的含rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4表达载体的上清液，使用无血清DMEM细胞培养液进行10倍梯度稀释。取10

3.rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4纯化后外源蛋白表达情况

按照常规方法传代BHK-21细胞至96孔板，置37℃，5％CO2培养箱中培养至致密单层。取纯化后F1、F10、F20、F21代rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4，使用含2％血清DMEM进行10倍梯度稀释至10

取F21代rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4接种BHK-21细胞，36h后收取细胞蛋白样品，通过WB进行外源蛋白PCV2Cap、PCV3Cap和IL-4的检验(参见图3)(PCV2Cap、PCV3Cap和IL-4抗体由四川农业大学动物生物技术提供)。

4.rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4安全性试验

6周龄雌性BALB/c小鼠(平均体重18±2g)购自北京华阜康生物科技股份有限公司。将小鼠随机分为4组，前3组为实验组，每组8只小鼠，每组分别按照10

实验结果表明，各浓度rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4均无死亡，且组织切片无病理变化，与对照组相比无明显差异。该重组病毒对小鼠是安全的。

5.重组病毒在小鼠上的免疫效果测定

购买6周龄雌性BALB/c小鼠60只(北京华阜康生物科技股份有限公司)。将小鼠随机分为两组(免疫组和对照组，每组30只)，取纯化后的重组病毒用无血清DMEM稀释，免疫组经肌肉注射10

5.1rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4在小鼠上的细胞免疫效果测定

(1)用细胞因子检测试剂盒(欣博盛：IL-6(EMC004.96)；IFN-γ(EMC101g.96))检测免疫组和对照组小鼠外周血中14与28dpvIL-4与IFN-γ分泌情况。结果见表1。

表1小鼠外周血IL-6与IFN-γ细胞因子检测结果

(2)分离14及28dpv免疫组和对照组小鼠脾细胞，每组设三只小鼠为重复。使用细胞计数板计数，1640培养基稀释脾细胞至细胞个数在5×10

表2小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验

(3)将14及28dpv分离的免疫组和对照组小鼠的脾细胞用PBS稀释至2×10

表3小鼠脾脏淋巴细胞CD3

5.2rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4在小鼠上的体液免疫效果测定

收集0、1、3、5、7、14、21、28、35、42dpv的免疫组和对照组小鼠的血清，参照法国ID.vetinnvativedignose猪伪狂犬病毒gE、gB抗体检测试剂盒说明书检测小鼠gE、gB抗体水平，参照深圳真瑞生物科技有限公司猪圆环病毒抗体检测试剂盒说明书进行PCV2Cap抗体检测，在检测时使用HRP-标记的兔抗小鼠二抗(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)代替原试剂盒中的酶标抗体。参照上海科艾博生物科技有限公司小鼠圆环病毒3型检测试剂盒说明书进行PCV3Cap抗体检测。

测定结果显示所有小鼠各时间点gE抗体呈阴性，21dpv(二次免疫1周后)，免疫组小鼠gB抗体、PCV2Cap抗体、PCV3Cap抗体均转为阳性，且抗体水平随时间升高(结果见表4、5、6、7)。

采用微量中和试验法检测小鼠血清中抗PCV2中和抗体，具体操作如下：预先在96孔板中培养PK-15细胞，待细胞长至50-60％时用于血清中和测定。收集7、14、28、35dpv的免疫组和对照组小鼠血清，56℃水浴灭火30min。待测血清(对照组与免疫组)倍比稀释为(1：2-1：64)，将50uL稀释后血清与50uL200TCID

测定结果显示免疫组小鼠自21dpv开始产生PCV2中和抗体，免疫后35天PCV2中和抗体滴度最高，随后开始降低，具体结果见表8。

以PCV2保守基因Cap为模板，建立关于PCV2的荧光定量PCR检测标曲，y＝-3.3986x+40.099，R

检测结果表明，对照组接种PCV2小鼠心、肝、脾、肺、肠淋和粪便病毒载量中较高，在21dpi达到峰值，28dpi时变化不明显。免疫组病毒载量在14dpi达到峰值，随后逐渐降低，具体数据见表9。

表4 gB抗体测定结果

注：S/N％≤40％为阳性；50％≥S/N％＞40％为可疑；S/N％＞50％为阴性。

表5 gE抗体测定结果

注：S/N％≤60％为阳性；70％≥S/N％＞60％为可疑；S/N％＞70％为阴性。

表6 PCV2Cap抗体测定结果

注：S/P值≥0.2判断为阳性；S/P值<0.2判断为阴性。

表7 PCV3Cap抗体测定结果

注：样品OD450nm≥阈值判断为阳性；样品OD450nm<0.2判断为阴性。

表8PCV2中和抗体测定结果

表9PCV2病毒载量测定结果

SEQ ID NO.1：XhoI-PCV2Cap-F2A-PCV3Cap-P2A-IL4-BclI：

ctcgagATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCAT

CTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTG

GAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAA

GCGAACCACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATG

ACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGA

ATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGG

AGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCAC

CTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCAC

TCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAAC

AACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTGGACCACGTAG

GCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACAA

TGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTgtgaaacagactttgaa

ttttgaccttctcaagttggcgggagacgtggagtccaacccagggcccATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAA

GACCCCGCCCAAGGAGACGACGACGCCACAGAAGGCGCTATGTCAGAAGAAAACTATT

CATTAGGAGGCCCACAGCTGGCACATACTACACAAAGAAATACTCAACCATGAACGTCA

TTTCCGTTGGAACCCCTCAGAATAACAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGC

CTAAACGAATGGGAAACTGCGATTAGCTTTGAATATTATAAGATACTAAAAATGAAAGTT

ACACTCAGCCCTGTAATTTCTCCGGCTCAGCAAACAAAAACTATGTTCGGGCACACAGC

CATAGACCTAGACGGCGCCTGGACCACAAACACTTGGCTCCAAGACGACCCTTATGCGG

AAAGTTCCACTCGTAAAGTTATGACTTCTAAAAAAAAACACAGCCGTTACTTCACCCCC

AAACCAATTCTGGCGGGAACTACCAGCGCTCACCCAGGACAAAGCCTCTTCTTTTTCTC

CAGACCCACCCCATGGCTCAACACATATGACCCCACCGTTCAATGGGGAGCACTGCTTT

GGAGCATTTATGTCCCGGAAAAAACTGGAATGACAGACTTCTACGGCACCAAAGAAGTT

TGGATTCGTTACAAGTCCGTTCTC

GGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTatgggtctcacctcccaactgatcccaaccctggtctgcttactg

gcatgtaccagcaacttcgtccacggacacaagtgcgacatcaccttacaagagatcatcaaaaccttgaacattctcacagcgagagagaact

cgtgcatggagctgcccgtgacggacgtctttgctgccccagagaacacgacggagaaggaaaccttctgccgggcctcgactgtgcttcggc

acatctacagacaccacacgtgcatgaagagcctcctgagcggacttgacaggaacctgagcagcatggcaaacatgacctgttctgtgcatgaagccaagaagagcactttgaaagacttcttggaaaggctaaagacgattatgaaggagaaatactcaaagtgtTGATCA。

SEQ ID NO.2：PCV2Cap

MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTIKRTT

VKTPSWAVDMMRFNINDFLPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSA

VILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSIYDQEYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP。

SEQ ID NO.3:PCV3Cap

MRHRAIFRRRPRPRRRRRHRRRYVRRKLFIRRPTAGTYYTKKYSTMNVISVGTPQNNKPWH

ANHFITRLNEWETAISFEYYKILKMKVTLSPVISPAQQTKTMFGHTAIDLDGAWTTNTWLQ

DDPYAESSTRKVMTSKKKHSRYFTPKPILAGTTSAHPGQSLFFFSRPTPWLNTYDPTVQWGALLWSIYVPEKTGMTDFYGTKEVWIRYKSVL。

SEQ ID NO.4:IL-4MGLTSQLIPTLVCLLACTSNFVHGHKCDITLQEIIKTLNILTARENSCMELPVTDVFAAPENTTEKETFCRASTVLRHIYRHHTCMKSLLSGLDRNLSSMANMTCSVHEAKKSTLKDFLERLKTIMKEKYSKC。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。