支链氨基酸在糖尿病神经病理性疼痛诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及支链氨基酸在糖尿病神经病理性疼痛诊断和治疗中的应用。

背景技术

糖尿病是最常见的复杂的、综合的代谢性疾病，目前成人糖尿病发病率高达12.8％，这一发病率还在逐年攀升。

同时，长期的血糖增高使得大血管、微血管受损，进一步给全身的不同组织都带来了不同程度的危害，因此糖尿病又是一种并发症最多的疾病，并发症高达一百多种。[Feldman EL,Callaghan BC,Pop-Busui R,Zochodne DW,Wright DE,Bennett DL,Bril V,Russell JW,Viswanathan V.Diabetic neuropathy.Nat Rev Dis Primers.2019Jun13；5(1):42.]

其中，糖尿病多发性神经病变(Diabetic Polyneuropathy，DPN)是最常见的糖尿病并发症，约50％的糖尿病患者最终会受到神经病变的折磨，症状表现为麻木、发冷、四肢疼痛、胃肠功能受阻等，这些都严重影响了患者的生活质量。

最新的《糖尿病神经病变诊治专家共识(2021年版)》[中华医学会糖尿病学分会神经并发症学组.糖尿病神经病变诊治专家共识(2021年版)[J].中华糖尿病杂志,2021,13(06):540-557.]指出，糖尿病神经病变发病机制尚不明确，早期诊断困难、主要依靠临床症状，尚无特殊的治疗手段，具体存在的问题如下：

1)糖尿病神经病变的病因和发病机制尚未完全阐明，目前认为主要与高血糖、脂代谢紊乱以及胰岛素信号通路异常所导致的一系列病理生理变化相关。然而，大量的临床经验和研究表明，糖尿病神经病变的发生和糖尿病病程不严格正相关，同时对于很多2型糖尿病患者而言很好地控制血糖也不能有效地减缓糖尿病神经病变。这些现象说明，血糖并不是影响糖尿病神经病变的关键因素，还有其他途径调控糖尿病神经病变的发生。

2)此外，糖尿病神经病变诊断主要是依据临床症状和体征，临床上并没有针对糖尿病神经病变的诊断标记物，同时早期的临床表现常较隐匿、易被忽略，待临床作出诊断时，其往往已处于不可逆阶段。

3)糖尿病神经病变的危害巨大，但目前尚无针对糖尿病神经损伤的特殊治疗手段，主要依赖于改善生活方式、控制血糖、营养神经、药物疼痛管理等。而且，目前还没有强有力的证据支持血糖控制和生活方式干预能够改善糖尿病神经病变。大量的糖尿病患者饱受疼痛折磨，严重的神经痛影响糖尿病患者的生活质量，包括活动受限、抑郁、社会功能受损等。因此寻找有效的诊治手段极为重要且迫切！

发明内容

本发明旨在克服上述缺陷，从代谢物的角度入手，利用代谢组学技术检测临床上有无神经病变的糖尿病患者血清代谢物谱，寻找可以作为风险因素指征糖尿病神经病变发生的代谢物，进一步提出干预治疗的手段。

本发明提供了一种小分子化合物的应用，其特征在于：

上述小分子化合物选自支链氨基酸；

上述应用为：用于制备缓减糖尿病病变的药物。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物的应用，其特征还在于：

上述糖尿病病变为糖尿病神经疼痛症状。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物的应用，其特征还在于：

上述支链氨基酸选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸中的至少一种。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物的应用，其特征还在于：

上述药物中，所包含支链氨基酸的组成如下：

亮氨酸：异亮氨酸：缬氨酸＝2:0.5-2:0.5-2。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物的应用，其特征还在于：

上述应用还包括：用于制作一种诊断糖尿病神经病变与否的筛查工具，或预测工具，或诊断工具。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物的应用，其特征还在于：

上述筛查工具，或预测工具，或诊断工具可选试纸、试剂盒、诊断软件、检验平台、检验分析仪。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物的应用，其特征还在于：

上述诊断工具包含，用于检测亮氨酸、和/或异亮氨酸、和/或缬氨酸含量的试剂；

上述诊断工具的诊断策略为：当检测结果为亮氨酸、和/或异亮氨酸、和/或缬氨酸下调时，判定糖尿病神经病变的概率为高。

该下调的量化指标为：不低于20％。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物的应用，其特征还在于：

上述检测的检测对象为患者的离体血清样本。

另外，本发明还提供了一种获得糖尿病神经疼痛患者代谢标志物的方法，其特征在于：

对糖尿病患者和糖尿病神经疼痛患者的离体血清样本进行核磁共振波谱仪非靶向检测后，筛选差异化代谢物。

本发明的作用和效果：

在本发明中的研究中发现相比于糖尿病患者而言，糖尿病神经疼痛患者血清中3种支链氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸都有显著下调(P<0.0001)。

其后，在本发明的研究中，通过小鼠实验，进一步证明了在饲料中补充支链氨基酸可以有效缓减糖尿病神经疼痛症状。

由此，本发明不仅首次发现了支链氨基酸和糖尿病神经病变的相关性，为糖尿病神经病变的早期诊断提供了新的有效的可靠的筛查手段，也为治疗糖尿病神经疼痛、缓建病人痛苦提出了新的治疗手段。

附图说明

图1、使用核磁共振波谱技术非靶向检测临床收集到的患者血清样品代谢物谱。

分为两组：Diabetic：糖尿病患者，无神经病变，n＝73；DPN：糖尿病神经病变患者，临床症状表现为疼痛，n＝56。

图2、检测补充支链氨基酸(branched-chainaminoacids，BCAA)对小鼠糖尿病神经疼痛的缓解效果。

Naive：正常饲喂的野生型C57/BL6小鼠；DPN：高脂饮食饲喂诱导糖尿病神经疼痛表型小鼠；DPN+BCAA：用BCAA治疗DPN小鼠。分别用0.07g(图2A)和0.4g(图2B)刺激小鼠，检测小鼠机械痛缩足频率。

具体实施方式

1.研究方案

1.1受试者

依据临床症状将患者分为两组：糖尿病患者组(diabetic，n＝73)和糖尿病神经疼痛组(DPN，n＝56)，两组患者可排除年龄、性别、BMI、用药史等其他因素干扰。样本的收集符合伦理审查和知情同意。

1.2临床样本代谢组学分析

收集病人血清样本，每200μL血清样本加入800μL提前预冷的甲醇，于-80℃静置过夜。液氮反复冻融3次，4℃，12000rpm离心15分钟收集上清，向沉淀中加入预冷的500μL80％甲醇后涡旋1分钟，然后4℃，12000rpm离心15分钟，收集上清与上一步上清液混合；重复一次。

将收集到的代谢物提取液使用Eppendorf Concentrator plus真空浓缩仪初步浓缩并干燥样品，再使用Labconco

1.3小鼠实验

所有C57/BL6小鼠都是健康的、免疫能力正常的、对疼痛敏感度相近的，并且没有接受过其他药物和测试，且符合动物学实验伦理审查。将小鼠饲养在无特殊微生物的独立通气鼠笼中，并提供充足的标准食物和水。定期监测动物的食物和水消耗。给6周大的雄性小鼠喂食高脂肪食物(HFD，脂肪热量60％)，对照组喂养对照饲料(脂肪热量10％)，持续9周。通过随机血糖(>16.7mMol/L)，腹腔注射葡萄糖耐量测试(IPGTT)和胰岛素耐量测试(ITT)确定高脂喂养诱发了小鼠2型糖尿病。并定期检测小鼠机械痛行为变化，确定诱发了糖尿病神经疼痛表型。

将糖尿病神经疼痛小鼠分为两组，一组延续高脂饮食饲喂，另一组加入支链氨基酸混合物(亮氨酸：异亮氨酸：缬氨酸＝2:1:1)。继续进行机械痛行为学检测，观察支链氨基酸的治疗效果。

机械痛缩足频率(paw withdrawal frequency，PWF)测定：小鼠提前断食12h，将单个小鼠放在透明亚克力盒中与其它小鼠分离，置于金属网格架上固定。待小鼠适应1h左右安静后，先用0.07g的VonFrey纤维丝，通过金属网格孔，垂直刺激小鼠足底中央部位，并施压使纤维丝弯曲呈“S”形，持续约1.5s，共刺激10次，每次间隔不小于5min并记录小鼠缩腿的次数。换0.4g的Von Frey纤维丝重复上述步骤，并记录。0.07g代表低强度刺激(allodynia，痛觉异常)，0.4g代表高强度刺激(hyperalgesia，痛觉过敏)下的机械性刺激缩足频率。

2.结果

2.1临床患者糖尿病神经疼痛患者血清中支链氨基酸显著下调

用核磁共振波谱仪非靶向检测73名糖尿病患者(Diabetic)和56名糖尿病神经疼痛患者(DPN)血清，一共筛查到16种代谢物，如图1所示，发现3种支链氨基酸在糖尿病神经疼痛患者血清中都有显著下调(P<0.0001)。

2.2糖尿病神经疼痛小鼠补充支链氨基酸可以有效缓减疼痛

如图2所示，给糖尿病神经疼痛的小鼠补充支链氨基酸，发现补充支链氨基酸5-7天后就可以显著减轻小鼠糖尿病神经疼痛症状，在9天后小鼠对机械痛刺激的响应几乎恢复到了正常水平。

图2:检测补充支链氨基酸(branched-chain amino acids，BCAA)对小鼠糖尿病神经疼痛的缓解效果。Naive：正常饲喂的野生型C57/BL6小鼠；DPN：高脂饮食饲喂诱导糖尿病神经疼痛表型小鼠；DPN+BCAA：用BCAA治疗DPN小鼠。分别用0.07g(图2A)和0.4g(图2B)刺激小鼠，检测小鼠机械痛缩足频率。

本实施例的作用和效果：

糖尿病神经病变作为最常见的糖尿病慢性并发症，发病机制和病因尚未完全阐明，目前的研究主要集中在糖、脂代谢紊乱和胰岛素信号通路异常所带来的一系列病理变化以及进一步的大、小纤维病变等。我们应该清楚地辨识到糖尿病并发症与糖尿病的区别，二者的致病机理是不完全一样的。

就糖尿病神经病变而言，大量的临床经验和研究都表明，很多2型糖尿病患者很好地控制血糖也不能有效地减缓糖尿病神经病变，目前还没有强有力的证据支持血糖控制和生活方式干预能够改善糖尿病神经病变。这些都表明血糖并不是影响糖尿病神经病变的关键因素，还有其他的代谢途径调控糖尿病神经病变的发生。

本发明从代谢物的角度入手，收集临床上糖尿病患者(n＝73)和糖尿病神经疼痛患者(n＝56)的血清样品，使用核磁共振波谱技术非靶向检测血样中不同种类代谢物的变化，筛查到三种支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)在糖尿病神经疼痛患者血清中显著下调。小鼠的实验进一步表明补充支链氨基酸确实可以有效减缓糖尿病神经疼痛症状。

由此，本发明为揭示糖尿病神经病变的致病机理提供了线索。支链氨基酸导致胰岛素抵抗是众所周知的事情，故而，本发明的内容也许要打破对支链氨基酸的传统认知，代谢物没有绝对的“好”和“坏”，代谢物在疾病发生发展的不同阶段所扮演的角色和行使的功能功能是不同的。

对糖尿病患者而言，也许高水平的支链氨基酸建立了新的稳态，未知因素使得支链氨基酸水平下降反而导致了神经病变的发生。

因此，本发明发现了支链氨基酸和糖尿病神经病变的联系，这一发现对糖尿病神经病变的诊断和治疗都有极为重要的意义：临床血清检测较为方便快捷可靠，支链氨基酸将来也许可以用于临床检测和早期诊断，该发现填补了这方面的空白；同时也为解决糖尿病神经病变的治疗问题提供了可能的方案。