用于烟草缺锌营养诊断的基因标志物集及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于烟草缺锌营养诊断的基因标志物集及其应用。

背景技术

烟草（

以高通量测序技术为基础的基因组学策略可以更加精准、高效地挖掘和筛选烟草应答缺锌胁迫的分子生物标志物，建立基于生物标志的营养诊断方法，为构建烟草绿色种植体系提供新方法和新思路。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于烟草缺锌营养诊断的基因标志物集及其应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明首先提供了一种用于烟草缺锌营养诊断的基因标志物集，所述基因标志物集由Nitab4.5_0000143g0340、Nitab4.5_0000572g0110、Nitab4.5_0003605g0060、Nitab4.5_0001724g0060和Nitab4.5_0006169g0020组成，Nitab4.5_0000143g0340的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，Nitab4.5_0000572g0110的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，Nitab4.5_0003605g0060的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，Nitab4.5_0001724g0060的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，Nitab4.5_0006169g0020的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明还提供了上述一种基因标志物集在烟草缺锌营养诊断中的应用。

本发明还提供了一种烟草缺锌营养诊断试剂盒，所述试剂盒包括通过RT-qPCR技术检测上所述的基因标志物集的试剂。

进一步的，上述试剂盒包括特异性检测Nitab4.5_0000143g0340、Nitab4.5_0000572g0110、Nitab4.5_0003605g0060、Nitab4.5_0001724g0060、Nitab4.5_0006169g0020的引物。

进一步的，上述特异性检测Nitab4.5_0000143g0340、Nitab4.5_0000572g0110、Nitab4.5_0003605g0060、Nitab4.5_0001724g0060、Nitab4.5_0006169g0020的引物的序列如下：

Nitab4.5_0000143g0340的特异性引物：

RT-0143-F: 5ʹ-CGGCTTGTTACACCTCATTACTC-3ʹ，

RT-0143-R: 5ʹ-TTCACCACTTGCTTCAACTCTTC-3ʹ；

Nitab4.5_0000572g0110的特异性引物：

RT-0572-F: 5ʹ-GATAGACCTCTTGCTTCC-3ʹ，

RT-0572-R: 5ʹ-GATTAGTTGCTTGTGATGG-3ʹ；

Nitab4.5_0003605g0060的特异性引物：

RT-3605-F: 5ʹ-TTCAGCAAGAGTAATTGTTG-3ʹ，

RT-3605-R: 5ʹ- ATTCGGAAGTTCGTCAAG-3ʹ；

Nitab4.5_0001724g0060的特异性引物：

RT-1724-F: 5ʹ-GCTTCAGTCATTCCTTAG-3ʹ，

RT-1724-R: 5ʹ-TGCTGTCAATATCATCCT-3ʹ；

Nitab4.5_0006169g0020的特异性引物：

RT-6169-F: 5ʹ-TCTCACTTACAACTCCAG-3ʹ，

RT-6169-R: 5ʹ- AATACTCCTTCCACAATGA-3ʹ。

本发明还提供了上述一种烟草缺锌营养诊断试剂盒在烟草缺锌营养诊断中的应用。

本发明还提供了一种烟草缺锌营养诊断的方法，所述方法包括如下步骤：

1）采集待测烟草叶片，提取总RNA，反转录成cDNA；

2）以反转录得到的cDNA为模板，利用上述的特异性引物进行RT-qPCR检测，根据基因是否上调表达判断待测烟草是否受缺锌胁迫。

进一步的，若待测烟草中Nitab4.5_0000143g0340、Nitab4.5_0000572g0110、Nitab4.5_0003605g0060、Nitab4.5_0001724g0060、Nitab4.5_0006169g0020的表达较正常烟草显著上调，则该待测烟草处于缺锌胁迫状态。

本发明的显著优点在于：

本发明利用转录组策略研究烟草应答锌胁迫的机制，筛选到了一种由Nitab4.5_0000143g0340、Nitab4.5_0000572g0110、Nitab4.5_0003605g0060、Nitab4.5_0001724g0060和Nitab4.5_0006169g0020五个基因，其可以作为诊断由锌元素缺乏引起烟草生长不良的基因标志物集，本发明具有实际意义。

附图说明

图1为不同锌浓度营养液中培养的烟草植株的生长发育表型（白色标尺为10cm）。

图2为不同锌浓度营养液中培养的烟草植株的Nitab4.5_0000143g0340表达水平。

图3为不同锌浓度营养液中培养的烟草植株的Nitab4.5_0000572g0110表达水平。

图4为不同锌浓度营养液中培养的烟草植株的Nitab4.5_0003605g0060表达水平。

图5为不同锌浓度营养液中培养的烟草植株的Nitab4.5_0001724g0060表达水平。

图6为不同锌浓度营养液中培养的烟草植株的Nitab4.5_0006169g0020表达水平的结果。

具体实施方式

以下实施方式用来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所用到的锌适量营养液，缺锌营养液，锌不足营养液及锌过量营养液的配方如表1所示。

表1 营养液的配方（单位：mg/L）

实施例1

一、材料与方法

1. 植物培养和处理

以翠碧1号为供试品种，通过土壤培养烟草样品，培养一段时间后，挑选处于3叶期、生长状况良好且大小一致的烟草幼苗。小心清除掉幼苗根部土壤残留，将其移栽到装有锌适量的完全营养液（锌浓度为0.00077 mM）的培养罐中进行复苏，转入人工气候箱中进行培养；培养条件为20℃暗培养12小时；25℃光培养12小时。

幼苗复苏5天后，正式开展锌元素不同供应梯度培养试验。剔除恢复差的烟株，将复苏良好的烟株幼苗随机分成四组，每组分别移入缺锌（锌元素浓度0 mM）、锌不足（锌元素浓度0.00019 mM）、锌适量（锌元素浓度0.00077 mM）和锌过量（锌元素浓度0.00308 mM）四种营养液中继续，培养条件为20℃暗培养12小时；25℃光培养12小时。

2. 样品采集

烟草在三种营养液中处理5天、15天、25天后，取烟株完全展开的第一片新叶，迅速转移到液氮中进行保存。试验设置3个生物学重复。

如图1所示，烟草样品处理5天后，各处理组烟株均生长正常，表型无明显差异；处理第15天时，缺锌（0 mM）营养液培养的植株叶片轻微卷曲并发黄，植株生长受到影响、生长速度变缓，锌不足（0.00019 mM）、锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）营养液培养的植株未发现明显异常；第25天时，缺锌（0 mM）营养液培养的植株的样品叶片卷曲严重、叶片发黄且部分枯萎、植株矮小、生长迟缓，而锌不足（0.00019 mM）营养液培养的样品叶片症状相对较轻、叶片发黄、植株矮小、未发生枯萎，锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308mM）营养液培养的植株无明显异常。

3. 转录组测序和分析

获取试验样品后，利用Trizol法提取烟草叶片总RNA，对提取的RNA进行质量检测，剔除不合格样品后构建真核生物RNA-seq文库，并利用IlluminaHiSeq平台进行转录组测序。测序工作由诺禾致源生物科技有限公司完成。

转录组测序工作完成后，进一步利用FASTP软件对RNA-seq的原始数据进行质量控制，目的是获得高质量的纯化测序数据。下一步工作是利用HISAT2软件将纯化数据与烟草参考基因组进行比对，该参考基因组来自于茄科基因组数据库网站（https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome），参考基因组大小为4.5 GB，共注释69500个编码蛋白基因。利用edgR软件（http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html）对比对数据进行差异表达分析，并计算q-value，阈值设置为为q-value小于0.05、差异倍数（foldchange）的对数（以2为底）大于1，根据计算结果筛选显著上调或显著下调的基因基因。

如表2所示，不同锌浓度营养液处理烟草植株5天后，共检测到166个基因在缺锌（0mM）组和锌适量锌适量（0.00077 mM）组之间显著差异表达（其中157个基因上调表达，9个基因下调表达），188个基因在锌不足（0.00019 mM）组和锌适量（0.00077 mM）组之间显著差异表达（其中179个基因上调表达，9个基因下调表达），789个基因在缺锌（0 mM）组和锌过量（0.00308 mM）组之间显著差异表达（其中117个基因上调表达，672个基因下调表达），675个基因在锌不足（0.00019 mM）组和锌过量（0.00308 mM）组之间显著差异表达（其中82个基因上调表达，593个基因下调表达）；在处理15天后，共检测到802个基因在缺锌（0 mM）组和锌适量锌适量（0.00077 mM）组之间显著差异表达，120个基因在锌不足（0.00019 mM）组和锌适量（0.00077 mM）组之间显著差异表达，1711个基因在缺锌（0 mM）组和锌过量（0.00308mM）组之间显著差异表达，755个基因在锌不足（0.00019 mM）组和锌过量（0.00308 mM）组之间显著差异表达；处理25天后，共检测到1328个基因在缺锌（0 mM）组和锌适量锌适量（0.00077 mM）组之间显著差异表达，1121个基因在锌不足（0.00019 mM）组和锌适量（0.00077 mM）组之间显著差异表达，3696个基因在缺锌（0 mM）组和锌过量（0.00308 mM）组之间显著差异表达，1915个基因在锌不足（0.00019 mM）组和锌过量（0.00308 mM）组之间显著差异表达。

表2 RNA-Seq检测烟草缺锌胁迫条件下差异表达的基因数量

注：Zn0为锌元素浓度为0 mM的培养液中培养的烟草样品；Zn0.00019为锌元素浓度为0.00019 mM的培养液中培养的烟草样品；Zn0.00077为锌元素浓度为0.00077mM的培养液中培养的烟草样品；Zn0.00308为锌元素浓度为0.00308 mM的培养液中培养的烟草样品。

进一步比较和挖掘缺锌（（0 mM）、锌不足（0.00019 mM）、锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）组样品的转录组数据，筛选到五个在锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）组中表达值极低，而在缺锌（0 mM）组和锌不足（0.00019 mM）中表达显著上调的差异基因（表3）。五个基因分别是Nitab4.5_0000143g0340、Nitab4.5_0000572g0110、Nitab4.5_0003605g0060、Nitab4.5_0001724g0060和Nitab4.5_0006169g0020。

表3 RNA-Seq鉴定烟草缺锌胁迫条件下5个显著差异表达基因

注：Zn0为锌元素浓度为0 mM的培养液中培养的烟草样品；Zn0.00019为锌元素浓度为0.00019 mM的培养液中培养的烟草样品；Zn0.00077为锌元素浓度为0.00077mM的培养液中培养的烟草样品；Zn0.00308为锌元素浓度为0.00308 mM的培养液中培养的烟草样品。

4. RT-qPCR验证候选差异基因表达量

通过基因差异表达分析，筛选出一批显著表达的基因Nitab4.5_0000143g0340、Nitab4.5_0000572g0110、Nitab4.5_0003605g0060、Nitab4.5_0001724g0060和Nitab4.5_0006169g0020，并利用qRT-PCR进行验证。利用反转录试剂盒进行RNA反转录实验获得cDNA，对cDNA进行质量检测后，选择合格样品进行RT-qPCR验证。反转录试剂盒和RT-qPCR检测试剂盒均由诺唯赞生物科技股份有限公司提供。

特异性检测Nitab4.5_0000143g0340、Nitab4.5_0000572g0110、Nitab4.5_0003605g0060、Nitab4.5_0001724g0060、Nitab4.5_0006169g0020的引物的序列如下：

Nitab4.5_0000143g0340的特异性引物：

RT-0143-F: 5ʹ-CGGCTTGTTACACCTCATTACTC-3ʹ，

RT-0143-R: 5ʹ-TTCACCACTTGCTTCAACTCTTC-3ʹ；

Nitab4.5_0000572g0110的特异性引物：

RT-0572-F: 5ʹ-GATAGACCTCTTGCTTCC-3ʹ，

RT-0572-R: 5ʹ-GATTAGTTGCTTGTGATGG-3ʹ；

Nitab4.5_0003605g0060的特异性引物：

RT-3605-F: 5ʹ-TTCAGCAAGAGTAATTGTTG-3ʹ，

RT-3605-R: 5ʹ- ATTCGGAAGTTCGTCAAG-3ʹ；

Nitab4.5_0001724g0060的特异性引物：

RT-1724-F: 5ʹ-GCTTCAGTCATTCCTTAG-3ʹ，

RT-1724-R: 5ʹ-TGCTGTCAATATCATCCT-3ʹ；

Nitab4.5_0006169g0020的特异性引物：

RT-6169-F: 5ʹ-TCTCACTTACAACTCCAG-3ʹ，

RT-6169-R: 5ʹ- AATACTCCTTCCACAATGA-3ʹ。

qRT-PCR试验反应体系如下：2×SYBRMix 5 ul，Primer-F 0.2 ul，Primer-R 0.2ul，cDNA 1 ul，RNase-free ddH

qRT-PCR实验反应程序共分三个阶段，阶段一：95℃，30 s ；阶段二：（95℃，10 s，60 ℃，30 s，95℃，15 s）40个循环 ；阶段三：60℃，60 s，95 ℃，15 s。

Nitab4.5_0000143g0340的qRT-PCR结果表明，不同锌浓度营养液处理烟草植株5天后，该基因在锌不足（0.00019 mM）组烟草样品中少量表达，而在缺锌（（0 mM）、锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）组烟草样品中几乎不表达。在处理15天和25天后，该基因在缺锌（0 mM）和锌不足（0.00019 mM）组烟草样品中显著表达，尤其是在缺锌（0 mM）组烟草样品中极显著高水平表达，而在锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）组烟草样品中极微弱表达（图2）。

Nitab4.5_0000572g0110的qRT-PCR验证结果表明：不同锌浓度营养液处理烟草植株5天后，该基因在缺锌（0 mM）、锌不足（0.00019 mM）、锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）组烟草样品中都几乎不表达。处理15天后，该基因在缺锌（0 mM）组烟草样品中极显著高水平表达（图3）。

Nitab4.5_0003605g0060的qRT-PCR验证结果表明：不同锌浓度营养液处理烟草植株5天后，该基因在锌不足（0.00019 mM）组烟草样品中少量表达，而在缺锌（0 mM）、锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）组烟草样品中极微弱表达。在处理15天后，Nitab4.5_0003605g0060基因在锌不足（0.00019 mM）组烟草样品中显著表达，在缺锌（0 mM）组烟草样品中极显著表达。而在锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）组烟草样品中微弱表达（图4）。

Nitab4.5_0001724g0060的qRT-PCR验证结果表明：不同锌浓度营养液处理烟草植株5天后，该基因在缺锌（0 mM）、锌不足（0.00019 mM）、锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）组烟草样品中都几乎不表达。第15天时，Nitab4.5_0001724g0060基因在缺锌（0 mM）和锌不足（0.00019 mM）组烟草样品中极显著表达。而在锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）组烟草样品中极微弱表达（图5）。

Nitab4.5_0006169g0020的qRT-PCR验证结果表明：不同锌浓度培养液处理烟草植株5天后，该基因在缺锌（0 mM）、锌不足（0.00019 mM）、锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）组烟草样品中几乎不表达。在处理15天后，Nitab4.5_0001724g0060基因在缺锌（0 mM）和锌不足（0.00019 mM）组烟草样品中极显著表达。而在锌适量（0.00077 mM）和锌过量（0.00308 mM）组烟草样品中表达不明显（图6）。

经过比对分析，上述五个基因的qRT-PCR检测结果与其对应的RNA-seq结果一致，表明当烟草植株处于锌元素缺乏或不足一段时间后，五个基因的表达量会出现显著上调；在锌适量或锌过量状态下，三个基因的表达则基本处于本底水平。综上所述，Nitab4.5_0000143g0340、Nitab4.5_0000572g0110、Nitab4.5_0003605g0060、Nitab4.5_0001724g0060和Nitab4.5_0006169g0020五个基因，可以作为用于诊断烟草应答缺锌胁迫的生物标志物。