一种基于磁控量子点CRISPR报告元件的弓形虫核酸检测方法

技术领域

本发明为生物传感器技术领域，具体涉及一种基于新型磁控量子点CRISPR报告元件的弓形虫核酸检测方法。

背景技术

CRISPR检测技术被誉为“下一代分子检测技术”，仅需一段RNA和CRISPR相关蛋白(Cas)组成二元复合物就可发挥生物传感和信号放大功能，具有操作简单、特异性强、灵敏度高、反应迅速等特点。为进一步提高CRISPR检测技术的灵敏度，将CRISPR系统与扩增技术耦联为常用策略，其中，重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)常温扩增技术能够有效降低设备要求和反应时间，在提高检测性能的同时可满足现场即时检测对CRISPR检测技术的要求。然而，CRISPR检测技术常用于信号读出的荧光基团修饰报告元件存在荧光强度弱、结构不稳定、价格昂贵、光漂白等缺点，这直接导致检测系统背景信号升高，灵敏度降低。因此，有必要开发出荧光强度大、荧光稳定、背景信号低的新型报告元件。

发明内容

本发明的目的在于针对现有报告元件的性能缺陷，开发一种基于强荧光、光稳定、高响应的磁控量子点(MB-QD)报告元件以及基于该磁控量子点(MB-QD)报告元件构建的一种CRISPR/Cas12a生物传感器。

本发明的另一目的是提供上述基于MB-QD报告元件的CRISPR/Cas12a生物传感器在弓形虫核酸检测中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种磁控量子点报告元件(MB-QD报告元件)，该磁控量子点报告元件由链霉亲和素化磁珠(MB

作为一种优选技术方案，所述的磁控量子点报告元件的制备过程为：由链霉亲和素化磁珠和生物素化DNA1在Binding&Washing缓冲液中混合连接，然后利用磁铁吸附磁珠，用缓冲液洗去游离生物素化DNA1，再加入量子点-DNA2在缓冲液中混合连接，用缓冲液洗去游离量子点-DNA2，获得磁控量子点报告元件并置于冰水浴中保存。

作为一种优选技术方案，所述的量子点-DNA2由CdCl

进一步优选的，所述的溶液环境中CdCl

作为一种优选技术方案，所述的Biotin-DNA1为：

CGGTAATAGGAAAGTGTGTAAACTGAATA-Biotin；

所述DNA2的核苷酸序列为：

TATTCAGTTTACACACTTTCCTATTACCGTACTATTAG*G*G*G*G*G*G*G*G(其中*代表的是硫代磷酸化修饰)。

一种基于MB-QD报告元件的CRISPR/Cas12a生物传感器，该生物传感器包含上述的磁控量子点报告元件、CRISPR/Cas12a识别体系和RAA扩增体系；

所述的CRISPR/Cas12a识别体系包括crRNA和Cas12a蛋白，两者通过氢键紧密结合，crRNA能识别目标核酸，诱导Cas12a蛋白激活；

所述的RAA扩增体系为包含特异性引物对的RAA试剂盒，所述的特异性引物对为针对目标核酸设计的特异性引物对。所述RAA试剂盒的其他组分如RAA干粉测试管(包含重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶等)、Buffer A、Buffer B等均是本领域技术人员公知的。

所述RAA扩增体系由RAA干粉测试管加入包含上游引物(Primer F)、下游引物(Primer R)、Buffer A和无菌水和待测核酸的混合溶液，然后在测试管盖上加入Buffer B，盖上管盖，上下颠倒5～6次，低速离心10sec置于39℃孵育进行RAA扩增反应，RAA产物用于后续CRISPR/Cas12a识别反应。进一步优选的，RAA扩增反应时间为10～20min。

所述crRNA为crRNA1或crRNA2，优选为crRNA1。

crRNA1：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACCCUCCAGGAAAAGCAGCCA；

crRNA2：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCTCGTGGTGATGGCGGAGAG。

所述的特异性引物对为Primer F1/Primer R1、Primer F2/Primer R2、PrimerF3/Primer R3、Primer F4/Primer R4、Primer F5/Primer R5、Primer F6/Primer R6中的任意一对引物，优选为Primer F1/Primer R1；

PrimerF1：TGAGGATGAGGGGGTGGCGTGGTTGGGAAGC

Primer R1：TGTCTCCCTCGCCCTCTTCTCCACTCTTCAA

PrimerF2：AGGATGAGGGGGTGGCGTGGTTGGGAAGCGA

Primer R2：ACTCTGTCTCCCTCGCCCTCTTCTCCACTCT

PrimerF3：GAAGGGACAGAAGTCGAAGGGGA

Primer R3：GAAAAGCAGCCAAGCCGGAAACA

PrimerF4：GAGCCACAGAAGGGACAGAAGTCG

Primer R4：CCTCCAGGAAAAGCAGCCAAGCCG

PrimerF5：ACTACAGACGCGATGCCGCTCCTCC

Primer R5：TGTCTCCCTCGCCCTCTTCTCCACT

PrimerF6：TATCAGGACTGTAGATGAAGGCGAGGGTG

PrimerR6：CGTCTCGTCTGGATCGCATTCCGGTGTCT。

所述的CRISPR/Cas12a识别体系由Cas12a蛋白与crRNA在反应缓冲溶液中混合孵育得到，随后加入MB-QD报告元件置于冰水浴保存；所述的反应缓冲溶液包含NaCl、Tris-HCl、MgCl

优选的，所述的反应缓冲溶液中NaCl、Tris-HCl和MgCl

上述的CRISPR/Cas12a生物传感器在制备弓形虫核酸检测产品或弓形虫核酸检测中的应用。所述的弓形虫核酸检测的过程为：将待测目标核酸加入RAA扩增体系混匀进行恒温反应，然后将扩增产物加入含有MB-QD报告元件的CRISPR/Cas12a识别体系震荡混匀，避光孵育后用磁铁吸引磁珠至底部，取上清进行荧光检测。

一种基于磁控量子点报告元件的弓形虫核酸检测方法，该方法为：将待测核酸加入RAA扩增体系混匀进行恒温反应，然后将扩增产物加入含有上述的磁控量子点报告元件的CRISPR/Cas12a识别体系震荡混匀，避光孵育后用磁铁吸引磁珠至底部，取上清进行荧光检测。

本发明中MB-QD报告元件依赖DNA1与DNA2互补的dsDNA连接，在靠近QD端有一段ssDNA区域，所述报告元件具体结构为MB-dsDNA-ssDNA-QD(如图1所示)。其中，ssDNA可作为激活的Cas12a的切割对象，待目标核酸激活Cas12a，切割报告元件的ssDNA区域，使得量子点与磁珠分离，磁珠由磁铁吸至底部，量子点游离在反应液中，从而能够从上清液中的荧光检测结果实现目标核酸检测。

本发明的原理图见附图2，Cas12a与crRNA在溶液中组装成crRNA-Cas12a二元复合物，待测核酸经RAA特异扩增，扩增产物由crRNA-Cas12a特异结合和识别。目标核酸能够与crRNA序列互补诱导Cas12a由非活性状态变构成具有ssDNA核酸酶活性状态。当待测核酸存在目标核酸时，经过RAA扩增后得到大量能够与crRNA互补的dsDNA，激活Cas12a核酸酶活性，剪切MB-QD报告元件的ssDNA区域，量子点与磁珠的连接断裂。在磁场作用下，磁珠聚集在底部，量子点游离在溶液中，溶液荧光信号强。相反，当待测核酸不存在目标核酸时，量子点与磁珠保持连接，在磁场作用下，量子点被磁珠带到底部，溶液荧光信号较弱。在检测过程中，目标核酸浓度越高，溶液中的荧光信号越强。

本发明使用量子点代替传统的荧光基团报告元件，相比于荧光有机小分子，量子点具有良好的光学性能和生物特性，其荧光激发范围宽发射范围窄，发射位置可由尺寸大小决定、荧光强度和稳定性高、光漂白现象小，同时该报告探针通过双链DNA连接比单链DNA连接结构更稳定，更适合在复杂环境中进行现场检测。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：

(1)本发明采用硫代磷酸化DNA进行原位合成量子点，与磁珠组装成一种荧光强度大、结构稳定、利于保存的MB-QD报告元件。

(2)本发明基于MB-QD报告元件的CRISPR/Cas12a生物传感器灵敏度高、特异性好、设备要求低，可以现场快速检测致病核酸。

(3)本发明的crRNA具有可编辑性，能够根据检测对象的特征核酸进行设计，所设计的crRNA与致病核酸的在一定序列要求下进行碱基互补，就能诱导Cas12a激活，从而实现其他致病核酸的检测。

(4)本发明基于MB-QD报告元件的CRISPR生物传感器用于弓形虫核酸检测，相较于常用的PCR检测，该生物传感器借助RAA等温扩增再连接CRISPR系统，目标核酸经两次信号放大和两次特异性筛选，再者荧光强度优异的量子点作为报告元件，灵敏度和特异性都大幅度提升；其次，两个技术都是在恒温条件下进行，常温也可进行反应，设备要求更低；再次，两个技术反应时间短，RAA扩增仅需10～20min，CRISPR/Cas12a反应仅需10～20min，整个检测过程最快可在20min得到检测结果。综上，本发明所述生物传感器更适合用于弓形虫核酸现场检测。

附图说明

图1是磁控量子点(MB-QD)报告元件合成示意图；

图2是基于MB-QD报告元件的CRISPR/Cas12a生物传感器用于弓形虫检测的原理图；

图3是本发明对不同浓度的弓形虫核酸检测荧光结果；

图4是本发明对不同致病菌核酸检测荧光结果；

图5是PCR-CRISPR对不同浓度的弓形虫核酸检测荧光结果。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。药品和试剂：实验中使用的DNA、crRNA均由生工生物工程(上海，中国)合成，并且经HPLC纯化。Cas12a蛋白由实验室自供，CdCl

实施例1

基于MB-QD报告元件的CRISPR/Cas12a生物传感器用于弓形虫检测

(1)配制MB-QD报告元件：将5μL 1μM链霉亲和素化磁珠与5μL 10μM Biotin-DNA1在10μL Binding&Washing缓冲液中常温孵育0.5h，然后低速离心10sec后，在磁场作用下，与磁珠连接的Biotin-DNA1吸至底部，弃溶液去除溶液中游离Biotin-DNA1，加入10μLBinding&Washing洗两次。之后加入10μL 10μM QD-DNA2，常温孵育0.5h，然后低速离心10sec后，在磁场作用下，与磁珠-DNA1连接的QD-DNA2吸至底部，弃溶液去除溶液中游离QD-DNA2，加入10μLBinding&Washing洗两次，使用超纯水重悬即得到MB-QD报告元件并置于冰水浴中保存。

所述的量子点-DNA2由CdCl

所述Biotin-DNA1和所述QD-DNA2的DNA2的核苷酸序列见表1。

(2)配制CRISPR/Cas12a反应体系：将Cas12a蛋白(500nM,20μL)与crRNA(100nM,40μL)在20μL 10×反应缓冲溶液(500mM NaCl、100mM Tris-HCl、100mM MgCl

另外，所述的crRNA可以为crRNA1或crRNA2，序列见表1；实施例中选用crRNA1。

(3)RAA扩增反应：使用RAA等温扩增试剂盒。将13.5μLddH

所述的特异性引物对Primer F/Primer R可以为Primer F1/Primer R1、PrimerF2/Primer R2、Primer F3/Primer R3、Primer F4/Primer R4、Primer F5/Primer R5、Primer F6/Primer R6中的任意一对引物，序列见表1；实施例中选用Primer F1/PrimerR1。

(4)取上述(3)的2μL RAA产物(不同浓度弓形虫核酸质粒)和(2)的18μLCRISPR/Cas12a反应体系(即含有MB-QD报告元件的CRISPR/Cas12a识别体系)加入PCR管中，37℃孵育15min。

(5)待上述(4)反应结束后，将PCR管置于磁铁上方，磁珠沉至底部，吸取溶液进行荧光检测。采用多功能酶标仪检测，选用384孔检测荧光终点学检测模式，检测条件为：λ

实施例2

如上述实施例1制备MB-QD报告元件后将2μL RAA扩增产物加入18μLCRISPR/Cas12a反应体系孵育，结束后在磁场作用下吸取上清进行荧光检测，检测设备及参数不变。RAA扩增操作加入的核酸模板分别为5*10

实施例3

本发明RAA-CRISPR与PCR-CRISPR实时荧光检测方法在检测弓形虫核酸上的性能比较。

(1)制备PCR Mix：将25μL 2×Taq Master Mix、2μL Primer F5、2μL Primer R5和16μLddH

(2)制备CRISPR/Cas12a报告溶液：将Cas12a蛋白(500nM,20μL)与crRNA1(100nM,40μL)在20μL 10×反应缓冲溶液(500mMNaCl、100mMTris-HCl、100mM MgCl

(3)PCR反应：将2μL不同浓度弓形虫核酸(ddH

(4)类似上述实施例1将2μL PCR扩增产物加入18μL CRISPR/Cas12a报告溶液37℃孵育30min后使用多功能全自动酶标仪进行荧光检测，选用384孔检测荧光动力学检测模式，检测条件为：λ

表1本发明涉及核酸序列