一种精浆丙二醛含量的定量测定方法及试剂盒

技术领域

本发明属于精子生化指标体外检测的技术领域，涉及一种精浆丙二醛含量的定量测定方法及试剂盒。

背景技术

现代社会中对于男性不育症的的病因学探讨发现,精子在过量活性氧自由基的过氧化作用后可导致精子功能丧失，是男性不育的重要原因之一。氧自由基为机体氧代谢过程中所产生的一类高活性化学基团,可攻击精子细胞膜中的多聚不饱和脂肪酸产生丙二醛(MDA)等脂质过氧化产物，因此，精浆MDA含量是精子脂质过氧化损伤严重程度的指标，精浆中MDA含量升高,表明精子质膜的脂质过氧化损害加强,抗氧化能力减弱。所以对于MDA的检测对于治疗男性不育症有重要的意义。

现有技术中，申请号为CN03818036.7的发明专利公开了测定尿液中MDA的试剂盒，虽然能够检测尿液中MDA的存在，但是仅限于定性测量，不能定量测量；而申请号为CN201910985706.0的发明专利公开了一种检测尿液中MDA的试剂条，将检测结果通过化学分析仪进行颜色分析得到尿液中MDA的含量，但是该产品不能消除标本中可溶性糖以及不饱和脂肪酸对MDA测定的影响，检测结果误差较大，临床应用价值较低。

申请号为CN108572224A的发明专利公开了一种生物组织中丙二醛含量的测定方法，该方法采用使用吖啶酮乙酰肼作为荧光标记试剂在三氯乙酸溶液的催化作用下对生物组织提取液和丙二醛标准溶液中的丙二醛进行衍生化，使用带有荧光检测器的高效液相色谱进行定量检测分析，该方法虽然检测准确度较高，但是操作繁琐，需要高效液相色谱仪进行检测，不适于推广。

申请号为CN201910242240.5的发明公开了一种测定楸树叶片丙二醛含量的测定方法，采用TBA法对MDA进行检测，但该专利适用于楸树叶片等植物叶片标本中丙二醛含量测定，样本处理方法与精浆差异较大，不适合进行精浆丙二醛含量测定。另外，由于人类精浆标本中含有一定量果糖，会对TBA反应产生干扰，精浆标本中含有的果糖等可溶性糖也可以与TBA试剂反应，反应产物在450nm处有吸收峰，同时在532nm处也会产生吸光度，使MDA测定结果偏高，该专利技术未给出消除果糖等可溶性糖对检测结果影响的方法，不适合用于测定人精浆丙二醛含量。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种精浆丙二醛含量的定量测定方法，通过对精浆样本加入三氯乙酸处理之后，使用加入硫酸铁溶液的TBA试剂与精浆混合，采用分光光度法进行处理，再经过计算得到精浆中MDA的浓度。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种精浆丙二醛含量的定量测定方法，包括步骤如下：

步骤一：取精液标本，离心，取上清液于离心管中，得到精浆标本，想所述精浆标本中加入标本处理液消除所述精液标本中的蛋白质以及脂类的干扰，混匀，静置，离心，吸取上清液得到处理标本；

步骤二：取丙二醛标准品与TBA试剂混匀作为标准管，取所述处理标本与TBA试剂混匀作为样品管，所述TBA试剂包括硫代巴比妥酸溶液以及硫酸铁溶液；

步骤三：将所述标准管和所述样品管在95℃条件下反应30min，冷却，使用分光光度计在532nm、450nm、600nm处，测定所述标准管和所述样品管的吸光度；

步骤四：将测定值通过以下公式进行计算，所述公式为：

得到所述样品管中丙二醛的浓度。

进一步，所述丙二醛标准品为1-30umol/L，所述丙二醛标准品的配置步骤为：称取丙二醛二甲缩醛1.64-49.26mg，加入0.01-1.0mol/L盐酸1000ml，室温充分搅拌10-120min，待丙二醛二甲缩醛充分溶解后制得所述丙二醛标准品。

进一步，所述标本处理液为0.5-5.0mol/L三氯乙酸。

进一步，所述TBA试剂包括质量分数为0.1-2.0％的硫代巴比妥酸溶液以及0.05-5.0mg/L硫酸铁溶液。

进一步，所述TBA试剂的配置步骤为：称取硫代巴比妥酸100-2000mg，加入0.2-2.0mol/L氢氧化钠溶液1-30ml，充分搅拌，使硫代巴比妥酸完全溶解，加入10-100ml所述标本处理液，加入50-5000mg/L硫酸铁溶液50-500ul，用去离子水定容至100ml。

本申请一种精浆丙二醛含量的定量测定方法，通过TBA试剂对丙二醛进行检测，操作方便，采用采用分光光度法读取检测结果，无需高压液相色谱等昂贵仪器，易于临床实验室开展。另外使用三氯乙酸对精浆标本进行处理，将蛋白、脂类等成分祛除，消除其对反应的干扰；通过在TBA试剂中加入0.1mg/L硫酸铁，有效增加了反应产物在532nm处的吸光度值，增加了检测的敏感性；同时，由于精浆标本中含有的果糖等可溶性糖也可以与TBA试剂反应，反应产物在450nm处有吸收峰，同时在532nm处也会产生吸光度，使MDA测定结果偏高。本申请对反应产物同时进行450nm与532nm吸光度检测，通过计算，有效消除精浆果糖等可溶性糖对结果的影响。

本发明还提供了一种精浆丙二醛含量的检测试剂盒，技术方案如下：

一种精浆丙二醛含量的检测试剂盒，包括，丙二醛标准品、标本处理液以及TBA试剂；其中，所述丙二醛标准品浓度为1-30umol/L，所述标本处理液为0.5-5.0mol/L三氯乙酸，所述TBA试剂包括质量分数为0.1-2.0％的硫代巴比妥酸溶液以及0.05-5.0mg/L硫酸铁溶液。

进一步，所述试剂盒中包括规格为0.5-5.0ml的离心管，所述丙二醛标准品、标本处理液以及TBA试剂分别独立装于瓶中。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的方案，下面结合本发明示例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的示例仅仅是本发明的一部分示例，而不是全部的示例。基于本发明的中示例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施方式都应当属于本发明保护的范围。

在本实施方式的描述中，术语“内”、“外”、“前”、“后”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系均仅仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

为清楚地说明本发明的设计思想，下面结合实施例对本发明进行说明。

实施例一

试剂组成：10umol/L丙二醛溶液(标准品)、2mol/L三氯乙酸(标本处理液)、TBA试剂。

试剂配制：

0.02mol/L盐酸配制：量取10mL0.24mol/L盐酸加水稀释至120mL。

丙二醛标准品(10umol/L)配制(分子量164.2)：准确称取丙二醛二甲缩醛(TMP)16.42mg，加入0.02mol/L盐酸1000ml，室温充分搅拌60min，待TMP充分溶解后，分装为0.5ml/瓶，2-8℃保存。

标本处理液配制：准确称取三氯乙酸16.34g，溶于50ml去离子水中，2-8℃保存。

1mol/L氢氧化钠溶液配制：准确称取氢氧化钠4g，溶于100ml去离子水中，2-8℃保存。

100mg/L硫酸铁溶液配制：准确称取Fe2(SO4)310mg，溶于100ml去离子水中，2-8℃保存。

TBA试剂配制：称取硫代巴比妥酸(TBA)800mg，加入1mol/L氢氧化钠溶液10ml，充分搅拌，使TBA完全溶解，加入30ml标本处理液，加入100mg/L硫酸铁溶液100ul，用去离子水定容至100ml，2-8℃保存。

一种精浆丙二醛含量的定量测定方法，以完全液化的精液标本作为原材料，步骤为：

取完全液化的精液标本1000g离心15min。取上清液200ul置于离心管中，得到精浆标本，向其中加入200ul标本处理液，充分混匀，静置5min，7000g离心15min，弃去沉淀，吸取上清液备用。

取丙二醛标准品与TBA试剂混匀作为标准管，取所述处理标本与TBA试剂混匀作为样品管，所述TBA试剂包括质量分数为0.8％的硫代巴比妥酸溶液以及0.1mg/L硫酸铁溶液。将标准管与样品管分别混匀，95℃反应30min，用冷水冷却。使用分光光度计分别在532nm、450nm、600nm处，测定各管吸光度值。

将测定值通过以下公式进行计算，所述公式为：

得到所述样品管中丙二醛的浓度。

为了证明本申请中标本处理液对于精浆标本的检测结果的影响，申请人做了以下实验：

取完全液化的精液标本5ml，1000g离心15min，弃去沉淀，留取上清液，即为精浆标本。按下表制备标本1、标本2、标本3、标本4。

将上述标本分别充分混匀，静置5min，7000g离心15min，弃去沉淀，吸取上清液。

按照上述步骤对四种标本以及标准管加入TBA试剂，如下表所示。

将各管混匀，95℃条件下反应30min，使用冷水冷却。在532nm、450nm、600nm处，分别测定各管吸光度值。按照上述公式进行计算，得到结果如下表所示。

上述结果中，精浆标本1经标本处理液将标本中蛋白、脂类去除后检测MDA含量结果比标本4(标本中不去除蛋白、脂类)检测结果低，说明精浆标本中蛋白、脂类等物质会使检测结果升高，为进一步验证标本中蛋白是否会造成MDA检测结果偏高，我们将精浆标本中加入一定量白蛋白，标本2在加入蛋白后采用标本处理液将蛋白去除，标本3在加入蛋白后不去除蛋白，加过表明，标本2检测MDA结果与标本1结果相近，而标本3检测MDA结果显著高于标本1及标本2检测结果，表明精浆标本中人工加入白蛋白会引起检测结果假性升高，而去除蛋白后检测结果降低到真实水平。本申请中采用的标本处理液可将蛋白等干扰物质有效去除，保证结果的准确可靠。

为了证明本申请中精浆标本内的果糖对精浆标本MDA的检测结果的影响，申请人做了以下实验：

留取完全液化的精液标本5ml，1000g离心15min，弃去沉淀，留取上清液，作为精浆标本。按下表制备标本1、标本2。

将上述标本分别充分混匀，静置5min，7000g离心15min，弃去沉淀，吸取上清液。

按照上述步骤对两种标本以及标准管加入TBA试剂，如下表所示。

将各管混匀，95℃条件下反应30min，使用冷水冷却。在532nm、450nm、600nm处，分别测定各管吸光度值。按照上述公式进行计算，得到结果如下表所示。

由于精浆标本中含有一定量果糖等可溶性糖，可溶性糖可与TBA试剂反应，其产物在450nm处有吸收峰，同时在532nm也有光吸收，造成MDA检测结果假性偏高，本专利采用同时检测反应产物532nm、450nm、600nm吸光度值，然后利用公式计算MDA浓度。结果表明，精浆标本加入果糖(标本2)与不加入果糖标本(标本1)与TBA试剂反应后生成物在532nm及450nm处吸光度值有差别，但经计算后MDA检测结果无差异，表明本方法可有效消除可溶性糖对MDA检测结果的影响。

为了证明本申请中不同浓度的硫酸铁对精浆标本MDA的检测结果的影响，申请人做了以下实验：

制得含5mg/L硫酸铁TBA试剂：准确称取Fe

在五支管中分别加入体积10umol/L的丙二醛标准品，记为标准1、标准2、标准3、标准4、标准5。

留取完全液化的精液标本5ml，1000g离心15min，弃去沉淀，留取上清液，作为精浆标本。按照上述步骤，向精浆标本中加入标本处理液，充分混匀，静置5min，7000g离心15min，弃去沉淀，吸取上清液备用，将上清液分别置于五个管中，作为标本1、标本2、标本3、标本4、标本5。

将标准1-5和标本1-5分别与上述含不同浓度硫酸铁的TBA试剂混合，如下表所示。

充分混匀，在95℃条件下反应30min，使用冷水冷却。在532nm、450nm、600nm处，分别测定各管吸光度值。按照上述公式进行计算，得到结果如下表所示。

产物吸光度值的适当增加可提升检测的敏感度。上述结果表明，虽然含有不同浓度Fe

上述示例中，精浆丙二醛(MDA)含量是常用的精子膜脂过氧化指标，MDA在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮)，该产物在532nm处有吸收峰。通过TBA试剂对丙二醛进行检测，操作方便，采用采用分光光度法读取检测结果，无需高压液相色谱等昂贵仪器，易于临床实验室开展。另外使用三氯乙酸对精浆标本进行处理，将蛋白、脂类等成分祛除，消除其对反应的干扰；通过在TBA试剂中加入0.1mg/L硫酸铁，有效增加了反应产物在532nm处的吸光度值，增加了检测的敏感性；同时，由于精浆标本中含有的果糖等可溶性糖也可以与TBA试剂反应，反应产物在450nm处有吸收峰，同时在532nm处也会产生吸光度，使MDA测定结果偏高。本申请对反应产物同时进行450nm与532nm吸光度检测，通过计算，有效消除精浆果糖等可溶性糖对结果的影响。

实施例二

一种精浆丙二醛含量的定量检测试剂盒，包括，丙二醛标准品、标本处理液以及TBA试剂；其中，所述丙二醛标准品浓度为10umol/L，所述标本处理液为2mol/L三氯乙酸，所述TBA试剂包括质量分数为0.8％的硫代巴比妥酸溶液以及0.1mg/L硫酸铁溶液。试剂盒中包括规格为0.5-5.0ml的离心管，所述丙二醛标准品、标本处理液以及TBA试剂分别独立装于瓶中。

上述示例中，丙二醛标准品(10umol/L)配制步骤：准确称取丙二醛二甲缩醛(TMP)16.42mg，加入0.02mol/L盐酸1000ml，室温充分搅拌60min，待TMP充分溶解后，分装为0.5ml/瓶，2-8℃保存。

标本处理液配制步骤：准确称取三氯乙酸16.34g，溶于50ml去离子水中，5℃保存。

100mg/L硫酸铁溶液配制步骤：准确称取Fe

TBA试剂的配置步骤为：称取硫代巴比妥酸(TBA)800mg，加入1mol/L氢氧化钠溶液10ml，充分搅拌，使TBA完全溶解，加入30ml标本处理液，加入100mg/L硫酸铁溶液100ul，用去离子水定容至100ml，2-8℃保存。

实施例三

一种精浆丙二醛含量的定量检测试剂盒，包括，丙二醛标准品、标本处理液以及TBA试剂；其中，所述丙二醛标准品浓度为1umol/L，所述标本处理液为0.5mol/L三氯乙酸，所述TBA试剂包括质量分数为0.1％的硫代巴比妥酸溶液以及0.05mg/L硫酸铁溶液。试剂盒中包括规格为0.5-5.0ml的离心管，所述丙二醛标准品、标本处理液以及TBA试剂分别独立装于瓶中。

上述示例中，丙二醛标准品(1umol/L)配制步骤：准确称取丙二醛二甲缩醛(TMP)1.64mg，加入0.01mol/L盐酸1000ml，室温充分搅拌10min，待TMP充分溶解后，分装为0.5ml/瓶，8℃保存。

标本处理液配制步骤：准确称取三氯乙酸4.085g，溶于50ml去离子水中，8℃保存。

50mg/L硫酸铁溶液配制步骤：准确称取Fe

TBA试剂的配置步骤为：称取硫代巴比妥酸(TBA)100mg，加入0.2mol/L氢氧化钠溶液1ml，充分搅拌，使TBA完全溶解，加入10ml标本处理液，加入50mg/L硫酸铁溶液50ul，用去离子水定容至100ml，8℃保存。

实施例四

一种精浆丙二醛含量的定量检测试剂盒，包括，丙二醛标准品、标本处理液以及TBA试剂；其中，所述丙二醛标准品浓度为30umol/L，所述标本处理液为5.0mol/L三氯乙酸，所述TBA试剂包括质量分数为2.0％的硫代巴比妥酸溶液以及5.0mg/L硫酸铁溶液。试剂盒中包括规格为0.5-5.0ml的离心管，所述丙二醛标准品、标本处理液以及TBA试剂分别独立装于瓶中。

上述示例中，丙二醛标准品(30umol/L)配制步骤：准确称取丙二醛二甲缩醛(TMP)49.26mg，加入1.0mol/L盐酸1000ml，室温充分搅拌120min，待TMP充分溶解后，分装为0.5ml/瓶，2℃保存。

标本处理液配制步骤：准确称取三氯乙酸40.85g，溶于50ml去离子水中，2℃保存。

5000mg/L硫酸铁溶液配制步骤：准确称取Fe

TBA试剂的配置步骤为：称取硫代巴比妥酸(TBA)2000mg，加入2mol/L氢氧化钠溶液30ml，充分搅拌，使TBA完全溶解，加入100ml标本处理液，加入5000mg/L硫酸铁溶液500ul，用去离子水定容至100ml，2℃保存。

需要说明的是，除了上述给出的具体示例之外，其中的一些部分可有不同选择。而这些都是本领域技术人员在理解本发明思想的基础上基于其基本技能即可做出的，故在此不再一一例举。

最后，可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。