接种有细胞的基质的冷冻保存及相关方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年9月7日提交的美国临时申请号62/728,646的权益，其全部内容通过援引并入本文用于所有目的。

关于联邦政府资助的研发的发明权声明

不适用

背景技术

1.发明领域

本申请总体上涉及用于将超薄基质植入目标组织的仪器和方法，所述超薄基质适于与干细胞一起接种以用于干细胞疗法、微泡和用于药物递送的注入凝胶，以及其他治疗性处理。超薄基质可进一步用于细胞的可复制培养和一旦接种细胞后冷冻保存。

2.相关技术的描述

涉及细胞损失或受损的人类疾病的范围是巨大的，包括但不限于眼病、神经变性疾病、内分泌疾病、心血管疾病和癌症。细胞疗法涉及使用细胞来治疗患病或受损的组织。它正迅速成为准备好治疗许多疾病的技术的最前沿，尤其是会影响对传统药物疗法无应答的个体的那些。这些疾病中的许多会受益于长期集中的目标区域治疗，这会减少全身性副作用。然而，某些药物，例如蛋白质治疗剂，价格昂贵，每小瓶要花费数千美元，并且需要无休止的重复治疗。

实际上，许多可以应用细胞疗法的疾病并不是致命的，而是涉及正常生理功能的丧失。例如，眼病通常涉及影响视觉的各种眼组织的功能变性，并因此影响许多个体的生活质量。

哺乳动物的眼是一种特化的感觉器官，能够将前视光学系统(角膜和晶状体)聚焦的入射光子转换为神经化学信号。这种光转导过程允许通过视神经将动作电位发送到更高的皮层中心，从而实现视觉。眼的视网膜包括对各种水平的光敏感的光感受器和将信号从光感受器传递到视网膜神经节细胞的中间神经元。这些光感受器是眼(如果不是身体)中代谢最活跃的细胞，并由视网膜色素上皮(RPE)细胞在代谢和功能上支持。这些RPE细胞位于眼的单层中，并且对视觉至关重要。

许多病理可能会损害或完全消除个体感知视觉图像的能力，包括眼外伤、感染、变性、血管不规则和炎症问题。视网膜的中央部分被称为黄斑，其负责中央视觉、精细的可视化和颜色区分。除其他病理外，黄斑功能可能受到老化相关的黄斑变性(湿性或干性)、糖尿病性黄斑水肿、特发性脉络膜新生血管形成、高度近视黄斑变性或晚期色素性视网膜炎的不利影响。

老化相关的黄斑变性通常会由于视网膜受损而导致视野中央(黄斑)视力丧失。这是老年人(>50岁)视力障碍的主要原因。黄斑变性以“湿性”和“干性”形式出现。

在干性形式下，细胞碎片(玻璃膜疣)会积聚在RPE细胞层和脉络膜之间，这会对RPE细胞产生不利影响，从而导致其功能障碍、变性以及最终死亡。依靠有活力的(viable)RPE细胞执行重要的支持功能的视网膜光感受器细胞功能失调，并且继发于RPE细胞病理而死亡。

在更严重的湿性形式中，脉络膜中新形成的血管浸润黄斑后的空间；新形成的血管很脆弱，并且经常漏血，从而导致光感受器及其支持细胞的死亡。

尽管引起对特定细胞或组织破坏的疾病是细胞疗法的明确候选者，但是本领域仍然需要改进的细胞疗法方法，其包括改善细胞疗法功效的方法、基质和工具，以及允许长期储存要用于此类疗法中的有功能的且有活力的细胞的方法和组合物。

发明内容

在各种实施方式中，本发明总体上涉及用于在基质上生长的细胞的冷冻保存的方法和组合物。特别是，用于在聚合物基质上接种的和/或生长的细胞的冷冻保存的方法和组合物。在某些应用中，细胞是视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器细胞、干细胞、分化前细胞、此类细胞的分化、或其组合，而与细胞的分化、起源或培养历史无关。

为了满足对用于细胞疗法的含细胞组合物的改善的长期保存的需要，在一些实施方式中提供了一种冷冻保存基质上的细胞的方法，所述方法包括将接种有细胞组合物的基质暴露于具有期望的降温速率的温度缓降阶段，将接种有细胞的基质转移到期望的中间温度范围持续第一时间段，并将接种有细胞的基质保持在期望的储存温度范围持续第二时间段，从而产生了冷冻保存的在基质上的细胞，其适合长期储存以及在解冻后随后用于细胞疗法中。

在各种实施方式中，本发明提供了特定的冷冻保存方法和程序步骤的变型以适应各种细胞特性。另外，在冷冻保存过程的各个阶段选择特定的细胞特性和基质特性，以改善细胞活力(viability)和接种有细胞的基质的植入成功率用于有效治疗。

本发明介绍了提供许多优点的新方法和设备，这些优点包括冷冻保存基质的有益结果，包括更高的细胞存活，对基质的最小损害，以及用于生成适于细胞生长和直接植入的接种有细胞的基质的整体简化方法。

在另一方面，本发明介绍了有意抑制黑色素生成的方法。试剂盒中包含的特定物品可以实现此类方法。

本发明还介绍了形成细胞特异性培养介质以改善细胞生长、细胞生长速率、活力和分化的新方法。在某些实施方式中，可以提取这样的细胞特异性培养介质，并且进一步使其适于直接注射，例如玻璃体内(IVT)递送至特定细胞的区域或已经植入的接种有细胞的基质。

一个或多个计算机的系统可被配置成通过将软件、固件、硬件或其组合安装在所述系统上来执行特定操作或动作，所述软件、固件、硬件或其组合在操作时使所述系统执行所述动作。一个或多个计算机程序可被配置成通过包括指令来执行特定操作或动作，所述指令在被数据处理装置执行时使所述装置执行所述动作。一个总的方面包括冷冻保存基质上的细胞的方法，所述方法包括：提供生物相容性聚合物基质，所述聚合物基质接种有单层未成熟视网膜色素上皮(rpe)细胞，所述聚合物基质提供细胞接种表面。冷冻保存细胞的方法还包括鉴定何时i)单层未成熟rpe细胞在基质上达到90％到99％的汇合，以及ii)大部分未成熟rpe细胞未完全色素沉着(pigmented)。冷冻保存细胞的方法还包括，根据所述鉴定，将接种有细胞的基质暴露于约-1c/分钟至约-30c/分钟的受控降温速率，直至达到低于-20c的第一温度；这个方面的其他实施方式包括相应的计算机系统、装置和计算机程序，所述计算机程序记录在一个或多个计算机存储设备上，所述计算机系统、装置和计算机程序各自被配置成执行所述方法的动作。

实施方案可包括以下特征中的一项或多项。方法，其中接种有细胞的基质达到低于描述接种的细胞的潜热释放的温度。方法，其中表面基本上平行于接种在基质上的单层未成熟rpe细胞，足以响应于接种的细胞的潜热释放而诱导成核和有效的温度补偿。所述方法还包括：在受控降温速率之后，将所述接种有细胞的基质在所述第一温度下保持第一时间段，所述第一温度在-20c至约-100c之间，以获得温度均匀性。所述方法还可包括将细胞在低于第一温度50c以内的储存温度下保持第二时间段，从而获得冷冻保存的细胞。所述方法还包括：在受控降温速率之后，将所述接种有细胞的基质在所述第一温度下保持第一时间段，所述第一温度在-20c至约-100c之间。所述方法还可包括进行第二受控降温速率，以最终将细胞在低于-196c的储存温度下保持第二时间段，从而获得冷冻保存的细胞。方法，其中所述第二时间段是24小时至60个月。方法，其中所述第二受控降温速率是约-1c/分钟至约-30c/分钟。方法，其中单层细胞的细胞接种密度是200,000到700,000个细胞/毫升细胞悬浮液，或100,000至350,000个细胞/平方厘米基质表面。方法，其中超过50％的rpe细胞具有鹅卵石形态。方法，其中rpe细胞无色素沉着或具有部分色素沉着。方法，其中所述细胞是表现出选自以下的冷冻保存活力特性的rpe细胞：(i)未色素沉着或部分色素沉着的rpe细胞，(ii)粘附但未极化的、部分极化的或完全极化的rpe细胞，(iii)具有或不具有成熟鹅卵石形态的rpe细胞，(iv)具有低于成熟细胞的基因表达水平或缺乏特定基因表达的rpe细胞；以及(v)处于汇合或亚汇合超过90％的单层构型的rpe细胞。方法，其中所述基质具有一种或多种选自以下的特性：(i)基质的热膨胀系数，(ii)基质弹性参数，(iii)基质厚度，(iv)表面修饰，(v)抗剪切力，所述特性有助于在冷冻保存和解冻过程中增强所述接种的细胞的活力和所述基质的功能。方法，其中所述生物相容性聚合物包括聚对二甲苯。方法，其中所述鉴定包括确定何时未成熟rpe细胞的至少一种或多种顶端分泌物、基底端分泌物或非极性特定分泌物的水平低于成熟rpe细胞的所述水平。方法，其中所述顶端分泌物包括αb结晶蛋白、透明质酸、基质金属肽酶(mmp)-9、色素上皮衍生因子(pedf)、转化生长因子(tgf)-β、金属蛋白酶组织抑制剂(timp)-i或机械生长因子(mgf)-e8。方法，其中所述基底端分泌物包括胱抑素c、内皮素i、成纤维细胞生长因子(fgf)5或血管内皮生长因子(vegf)。方法，其中所述非极性特定分泌物包括脑源性神经营养因子(bdnf)、补体因子h(cfh)、睫状神经营养因子(cntf)、腓骨蛋白3/5、成纤维细胞生长因子(fgf)2、肝素结合表皮生长因子(hb-egf)、肝细胞生长因子(hgf)、胰岛素样生长因子(igf)-i、白血病抑制因子(lif)、基质金属蛋白酶(mmp)-9、神经生长因子(ngf)、弹性蛋白原。方法，其中所述鉴定包括确定未成熟rpe细胞的rpe65、rex1、eif2b2、serf2、ube2r2中至少一种或多种的基因表达低于成熟rpe细胞的所述基因表达。方法，其中所述基质包括薄区域，所述薄区域构造成允许细胞通过其扩散营养物。所描述的技术的实施方案可包括硬件、方法或过程，或计算机可访问介质上的计算机软件。

一个总的方面包括生成可植入的接种有细胞的基质的方法，所述方法包括：提供生物相容性聚合物基质，所述聚合物基质接种有单层未成熟视网膜色素上皮(rpe)细胞，所述聚合物基质提供细胞接种表面。所述方法还包括通过将接种有细胞的基质暴露于约-1c/分钟至约-30c/分钟的受控降温速率，冷冻保存所述基质上的细胞。所述方法还包括将接种有细胞的基质转移至低于4c的温度，从而获得冷冻保存的或休眠的细胞。所述方法还包括通过使用温度缓升加热速率将接种有细胞的基质加温至目标温度来解冻所述基质上的冷冻保存的细胞，从而获得在基质上接种的解冻的细胞，其中在解冻后解冻的细胞保持活力和/或功能。所述方法还包括在植入之前将接种的细胞培养另外的时间段以达到成熟状态。这个方面的其他实施方式包括相应的计算机系统、装置和计算机程序，所述计算机程序记录在一个或多个计算机存储设备上，所述计算机系统、装置和计算机程序各自被配置成执行所述方法的动作。

实施方案可包括以下特征中的一项或多项。所述方法还包括：在第一介质中培养解冻后的基质接种的细胞，所述第一介质包括基础介质，所述基础介质补充有包括牛血清白蛋白(bsa)、激活素a、肝细胞生长因子(fgf)、胰岛素样生长因子(igf)1、dickkopf相关蛋白1(dkk1)和头蛋白中的至少一种或多种的组合。所述方法还包括：在第一介质中培养解冻后的基质接种的细胞，所述第一介质包括补充有源自预先培养的rpe细胞的上清液的基础介质，并且随后在第二介质中培养所述细胞，所述第二介质包括补充有胰岛素样生长因子(ifg)1、dickkopf相关蛋白1(dkk1)和头蛋白的基础介质。方法，其中所述第一介质中的上清液源自未成熟rpe细胞的培养，所述未成熟rpe细胞包括表现出选自以下的最佳冷冻保存活力特性的rpe细胞：(i)未色素沉着或部分色素沉着的rpe细胞，(ii)未极化或部分极化的rpe细胞，(iii)具有或不具有至少50％t成熟鹅卵石形态的rpe细胞，(iv)基因表达水平低于成熟细胞的基因表达水平或缺乏特定基因表达的rpe细胞，以及(v)处于亚汇合或汇合单层构型的rpe细胞。方法，其中所述第一介质中的上清液源自表现出选自以下的成熟特性的rpe细胞的培养：(i)色素沉着的rpe细胞，(ii)极化的rpe细胞，(iii)具有成熟鹅卵石形态的rpe细胞，(iv)具有与成熟rpe细胞相当的基因表达水平的rpe细胞，以及(v)处于汇合单层构型的rpe细胞。所描述的技术的实施方案可包括硬件、方法或过程，或计算机可访问介质上的计算机软件。

一个总的方面包括产生细胞系特异性培养介质或无细胞疗法的方法，所述方法包括：在生长支持结构上培养未成熟rpe细胞；所述rpe细胞表现出选自以下的最佳冷冻保存活力特性：(i)无色素沉着的rpe细胞，(ii)未极化或部分极化的rpe细胞，(iii)不具有成熟鹅卵石形态的rpe细胞，(iv)基因表达水平低于成熟细胞的基因表达水平或缺乏特定基因表达的rpe细胞，以及(v)处于亚汇合单层构型的rpe细胞。所述方法还包括收集含有分泌因子的介质。所述方法还包括纯化介质以产生培养介质或无细胞疗法。这个方面的其他实施方式包括相应的计算机系统、装置和计算机程序，所述计算机程序记录在一个或多个计算机存储设备上，所述计算机系统、装置和计算机程序各自被配置成执行所述方法的动作。

实施方案可包括以下特征中的一项或多项。所述方法还包括：培养所述rpe细胞，直至所述细胞表现出选自以下的成熟特性：(i)色素沉着的rpe细胞，(ii)极化的rpe细胞，(iii)具有成熟鹅卵石形态的rpe细胞，(iv)具有与成熟细胞相似的基因表达水平的rpe细胞，以及(v)处于汇合单层构型的rpe细胞，之后纯化所述介质。方法，其中通过离心过滤、分级分离、尺寸排阻色谱、亲和色谱、尺寸排阻过滤或沉淀来完成纯化。所述方法还包括：将所述上清液介质包装在注射器中。方法，其中上清液补充有药物载剂或稀释剂。所述方法还包括：培养光感受器细胞或光感受器祖细胞。方法，其中生长支持结构包括基质、网格结构、琼脂或水凝胶。方法，其中细胞生长在生物相容性基质或容器上、生物相容性基质或容器中或包封在生物相容性基质或容器中。所描述的技术的实施方案可包括硬件、方法或过程，或计算机可访问介质上的计算机软件。

一个总的方面包括用于治疗疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用有效量的通过以下方法获得的rpe细胞特异性培养介质或无细胞疗法。所述方法还包括在生长支持结构上培养rpe细胞，所述rpe细胞表现出以rpe65水平检测为特征的成熟特性。所述方法还包括收集含有分泌因子的介质。所述方法还包括纯化介质以产生培养介质或无细胞疗法。这个方面的其他实施方式包括相应的计算机系统、装置和计算机程序，所述计算机程序记录在一个或多个计算机存储设备上，所述计算机系统、装置和计算机程序各自被配置成执行所述方法的动作。

实施方案可包括以下特征中的一项或多项。所述方法还包括：移植所述rpe细胞。所述方法还包括：将接种的rpe细胞移植到基质上。所述方法还包括：移植光感受器细胞。所述方法还包括：将所述rpe细胞和光感受器细胞移植到基质上。方法，其中通过离心过滤、分级分离、尺寸排阻色谱、亲和色谱、尺寸排阻过滤或沉淀来完成纯化。方法，其中生长支持结构可以是基质、网格结构、琼脂或水凝胶。方法，其中细胞生长在生物相容性基质或容器上、生物相容性基质或容器中或包封在生物相容性基质或容器中。所描述的技术的实施方案可包括硬件、方法或过程，或计算机可访问介质上的计算机软件。

一个总的方面包括用于细胞疗法以生成视网膜解剖学的外界膜的基质，所述基质包括：基质，其具有正常状态或柔性状态曲率和与患者的功能性外界膜的患病部分基本相似的尺寸。基质还包括作为独立的单独层而被接种在基质上的rpe细胞和光感受器细胞，其在植入后成熟，从而生成外界膜。这个方面的其他实施方式包括相应的计算机系统、装置和计算机程序，所述计算机程序记录在一个或多个计算机存储设备上，所述计算机系统、装置和计算机程序各自被配置成执行所述方法的动作。

实施方案可包括以下特征中的一项或多项。基质，其中所述基质涂覆有介质，以在植入后吸引患者的前体细胞以生成外界膜。基质还包括通过以下制备的上清液介质：在生长支持结构上培养rpe细胞。基质还可包括表现以rpe65水平检测为特征的成熟特性的rpe细胞。基质还可包括收集含有分泌因子的介质。基质还可包括纯化介质以产生培养介质或无细胞疗法。所描述的技术的实施方案可包括硬件、方法或过程，或计算机可访问介质上的计算机软件。

一个总的方面包括产生细胞特异性培养介质的方法，所述方法包括：在选择性可渗透基质上在第一培养介质中培养第一细胞系，其中所述第一细胞系加工第一培养介质并产生细胞分泌物。所述方法还包括收集细胞分泌物。所述方法还包括将细胞分泌物添加到第二培养介质中以形成细胞特异性培养介质。这个方面的其他实施方式包括相应的计算机系统、装置和计算机程序，所述计算机程序记录在一个或多个计算机存储设备上，所述计算机系统、装置和计算机程序各自被配置成执行所述方法的动作。

实施方案可包括以下特征中的一项或多项。方法，其中细胞分泌物包括蛋白质、激素、酶、副产物和废物的组合。方法，其中细胞分泌物包括来自rpe细胞的顶端分泌物，所述顶端分泌物包括以下中的至少一种：αb结晶蛋白、透明质酸、基质金属蛋白酶(mmp)-9、色素上皮衍生因子(pedf)、转化生长因子(tgf)-β、金属蛋白酶组织抑制剂(timp)-i。方法，其中细胞分泌物包括来自rpe细胞的基底端分泌物，所述基底端分泌物包括以下中的至少一种：胱抑素c、内皮素i、成纤维细胞生长因子(fgf)5、血管内皮生长因子(vegf)。方法，其中细胞分泌物包括来自rpe细胞的非极性特定分泌物，所述非极性特定分泌物包括以下中的至少一种：bdnf、cfh、cntf、腓骨蛋白3/5、fgf 2、hb-egf、hgf、igf-i、lif、mmp-9、ngf、弹性蛋白原。基质诱导接种的细胞的极性，以允许顶端、基底端和非极性特定分泌物被分泌。形成的细胞特异性培养介质用于非成熟rpe细胞的受控生长。形成的细胞特异性培养介质用于非成熟rpe细胞受控成熟为成熟rpe细胞。形成的细胞特异性培养介质被配制用于玻璃体内(ivt)注射。所描述的技术的实施方案可包括硬件、方法或过程，或计算机可访问介质上的计算机软件。

一个总的方面包括形成治疗组合物的方法，所述方法包括：在选择性可渗透基质上在第一培养介质中培养第一细胞系，其中所述第一细胞系加工第一培养介质并产生细胞分泌物。所述方法还包括收集细胞分泌物。所述方法还包括通过选择特定的细胞分泌物来纯化细胞分泌物。这个方面的其他实施方式包括相应的计算机系统、装置和计算机程序，所述计算机程序记录在一个或多个计算机存储设备上，所述计算机系统、装置和计算机程序各自被配置成执行所述方法的动作。

实施方案可包括以下特征中的一项或多项。所述方法还包括：离心一次或以不同的速度离心多次，并且重构以产生一种沉淀物(pellet)或具有不同组成的多种沉淀物。所述方法进一步包括分级分离、尺寸排阻色谱、亲和色谱、尺寸排阻过滤或沉淀。所述方法还包括：重构为不同的浓度。方法，其中形成的治疗组合物不包含细胞。所描述的技术的实施方案可包括硬件、方法或过程，或计算机可访问介质上的计算机软件。

一个总的方面包括将聚合物膜可逆地粘附到另一聚合物表面上的方法，所述方法包括：放置所述膜使其基本上被所述另一聚合物表面上的一定体积的介质包围。所述方法还包括递增地抽取一定体积的介质，直到所述膜的平坦表面与另一聚合物表面的平坦表面接触。所述方法还包括干燥以将所述膜的平坦表面可逆地粘附到另一聚合物表面的接触平坦表面上。这个方面的其他实施方式包括相应的计算机系统、装置和计算机程序，所述计算机程序记录在一个或多个计算机存储设备上，所述计算机系统、装置和计算机程序各自被配置成执行所述方法的动作。

实施方案可包括以下特征中的一项或多项。方法，其中聚合物表面是细胞培养板或孔的底表面。方法，其中介质是杜尔贝科(Dulbecco’s)磷酸盐缓冲盐水(dpbs)。方法，其中通过干燥器、温度/湿度控制室、在干燥炉中烘烤或置于受控室(例如洁净室)中来进行干燥。方法，其中聚合物膜是聚对二甲苯。所述方法还包括引入一定体积的介质，以使膜的平坦表面与另一聚合物表面的接触平坦表面分离。所描述的技术的实施方案可包括硬件、方法或过程，或计算机可访问介质上的计算机软件。

附图说明

从以下对本发明的详细描述中，特别是结合附图，可以更容易地理解上述内容，其中：

图1是示出根据一种实施方式的从基质准备的冷冻保存过程到植入的流程图。

图2是这样的图，其显示了根据一种实施方式的在冷冻保存的受控温度缓降步骤过程中接种在基质上的细胞的潜热释放。

图3是根据一种实施方式的用于细胞接种的示例性基质，其强调了用于营养物扩散的模式化(patterned)薄表面和允许细胞生长的支持结构。

图4是流程图，其示出了根据一种实施方式的RPE细胞色素沉着的步骤，具体地，(A)未成熟的无色素沉着的RPE细胞，(B)前黑素体(出现条纹(striations))，(C)黑素体(色素沉积在条纹上，观察到条纹和色素两者)，(D)成熟的RPE细胞(充满色素遮蔽的条纹)。

图5是示例性立方形鹅卵石形态的图片。

图6是杂乱形态的图片，其包含鹅卵石形态和成纤维细胞形态的混合。

图7是根据一种实施方式的具有均匀细胞生长并且接近汇合(90％-99％汇合)或100％汇合的基质的图片。通过视觉观察无法区分，需要成像技术来获得实际的汇合百分比。

图8是根据一种实施方式的具有不均匀细胞生长并且仅约70％汇合的基质的图片。

图9是这样的图，其示出了根据一种实施方式的未成熟RPE细胞相比于成熟RPE细胞的PEDF分泌的差异。

图10是这样的图，其示出了根据一种实施方式的通过RT-qPCR测量的基因表达的各种值。具体而言，RPE65ΔCt≥-3.0，REX1ΔCt≤-8.0，这是成熟RPE细胞的范围。参考基因(EIF2B2、SERF2、UBE2R2)的几何平均值Ct≤32.0。测试了几个其他基因，包括MAP2、S100A4、TYRP1和LIN28A，仅用于获取信息。

图11是流程图，其示出了根据一种实施方式的目标上清液的制备步骤，所述目标上清液含有特定的细胞分泌因子，可作为IVT注射或用作后续培养的补充介质。

图12是一种实施方式的简化图，其强调了一种或多种基质上的RPE细胞和光感受器之间的相互作用。

图13是流程图，其示出了根据一种实施方式的将膜可逆地粘附至细胞培养孔的过程。这样的方法对于以下是有利的：固定基质用于依赖于稳当的X和Y轴方向的自动基质涂覆或细胞接种过程。通过向膜中引入一定量的介质，粘附是可逆的。

图14示出了根据一种实施方式的各种对比图像，其比较了冷冻保存后和植入后的总体细胞活力，连同突出显示了某些基因表达。

图15示出了多个图像，其显示了与非冷冻细胞对照相比，根据一种实施方式的由于使用的冷冻保护剂的差异，在解冻后1天的细胞形态的差异。

图16示出了多个图像，其显示了与非冷冻细胞对照相比，根据一种实施方式的由于使用的冷冻保护剂的差异，在解冻后1周的细胞形态的差异。

图17显示了根据一种实施方式的从单个样品获得的基因表达的六个图，其比较了非冷冻保存的和冷冻保存后的。

图18显示了根据一种实施方式的按照比色代谢测定法的代谢的图。

详细描述

本发明大体涉及接种有细胞的基质、细胞评估方法以及通过接种到基质上和冷冻保存方法来提高接种有细胞的膜的活力的方法。与常规的单细胞或细胞簇不同，接种有细胞的膜需要特殊考虑，以提高冷冻保存和解冻后的活力。通过具体地进行以下提到的改变，结果不仅显示了增加的细胞存活率，而且还显示了包括植入后在内的存活细胞的健康(例如，代谢活性，寿命)增加。

冷冻保存优化：基质/膜

在一些实施方式中，基质包含生物相容性聚合物以充当接种表面。在一些实施方式中，基质包含与其他材料组合的聚对二甲苯，所述其他材料是可生物降解的或不可生物降解的。在一些实施方式中，对基质进行处理，使其具有一种或多种增强接种的细胞的活力的特性。例如，在一些实施方式中，基质进一步包括涂层以增强细胞对基质的粘附。在一些实施方式中，涂层包含基质胶(Matrigel)、玻连蛋白、纤连蛋白和纤维连接蛋白或衍生的聚对二甲苯层中的一种或多种。可以替换本领域技术人员已知的其他细胞介质及其各种组合。在其他实施方式中使用其他涂层或表面修饰，以在冷冻保存过程中和之后实现改善的细胞对基质的粘附并/或改善细胞和基质的耐久性和/或活力。例如，在一些实施方式中，涂层增强了冷冻保存过程中、冷冻保存之后或冷冻保存过程中和冷冻保存之后细胞的活力。在另一个示例中，用氧气处理基质的细胞生长表面以产生亲水性细胞生长表面。其他表面处理包括氧等离子体处理、化学蚀刻和另外的聚合物沉积。当根据功能需求使用不同的聚对二甲苯类型时(例如聚对二甲苯-C的弹性(例如断裂伸长率(％)为200)，聚对二甲苯-N的高氧气渗透性(cc.mm/m

在一些实施方式中，基质的特性包括基质的热膨胀系数、基质弹性参数或基质厚度中的一个或多个。在一些实施方式中，基质包含聚对二甲苯并且是选择性可渗透的，并且特性包括基质厚度，并且选择所述厚度以允许营养物穿过基质。基质可以不具有通孔，并且仅依赖于基质的厚度来获得渗透性特性。因此，在解冻并随后在目标部位植入后，基质允许营养物适当传递到细胞和/或细胞废料适当地离开基质。在一些实施方式中，选择厚度以产生基质的热膨胀系数，使得其对接种的细胞具有减小的不利影响。在将要冷冻保存的细胞接种在两种或更多种材料(例如，夹心的、嵌入的或其他实施方式)之间的实施方式中，厚度特别重要，其中所用的细胞或冷冻保护剂的膨胀可能会在冷冻过程中扩大，从而导致剪切、扭转或其他会损坏基质和/或细胞的应力。在一些实施方式中，选择材料和厚度以具有不干扰接种的细胞释放潜热的热能释放特性。在一些实施方式中，选择材料构型以具有增加的抗剪切性，例如在冷冻保存和解冻过程中可能遇到的支持结构的六角形、蜂窝状模式。

在膜上放置两层或更多层不同细胞的一些实施方式中，可以将第二基质层放置在此类细胞层之间以促进单独的层内的分离的增殖。例如，当接种有细胞的基质由第一基质层、第一细胞层(由具有与基质相接的基底面的RPE细胞构成)、第二细胞层(由与第一层细胞的顶端表面相接的光感受器细胞构成)的特定顺序构成时，可以将第二基质层置于第一和第二细胞层之间。在一个实施方式中，两个细胞层同时在第一基质层上生长，其中RPE细胞的第一细胞层首先被接种到基质上，并且光感受器的第二细胞层在随后的时间被接种到基质上在RPE细胞之上。所述时间可以是1-10天后，从而使RPE细胞首先主要粘附到基质上。在其他实施方式中，将分化为另一种细胞类型的视网膜前体细胞、上皮细胞、其他眼细胞、干细胞或重编程细胞可以由所述层中的一种或多种构成。进一步的实施方式可包括通过基因编辑以特定地产生某些因子(例如蛋白质、生长因子、抗体)以促进特异性细胞信号传导以重新编程相邻层的某些工程改造的细胞。在各种实施方式中，可以修饰RPE干细胞以分泌进一步支持光感受器细胞存活的神经营养因子(例如PEDF、CNTF、BDNF)。在其他实施方式中，表面整联蛋白的过度表达会增强RPE与Bruch膜(Bruch’s Membrane)的粘附，黑色素的增加会降低AMD的风险，并且吞噬作用所需受体的过度表达会增加liopfiscin和其他代谢废物(其可以阻碍细胞层的健康)的清除。

在其他实施方式中，每个细胞层在单独的基质上独立生长。在该实施方式中，使第二基质是可生物降解的或由呈凝胶状的生长介质构成可以是有益的，所述第二基质在堆叠和植入后将溶解或降解和/或被一个或多个相邻细胞层吸收。生长介质可以由特定的生长因子(例如牛血清白蛋白(BSA)、激活素A、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF1)、人dickkopf WNT信号传导通路抑制剂(DKK1)和头蛋白)或抗体(与嵌入聚对二甲苯基质中的官能化基团互补，如下所述)构成以改善一个层或多个层的附着。

控制成核、从液体到结晶的状态转变的开始以及在受控速率保存过程中提供的温度补偿用于潜热释放(Exhibit X)已知会改善冷冻保存和解冻后细胞活力。在许多实施方式中，由于基质的构型和接种面积，基质平行于接种的细胞定向。因此，基质与所有接种的细胞紧密接触和/或密切接近，从而允许所有细胞同时均匀成核，以及响应于接种的细胞的潜热释放的有效温度补偿。对于其中接种的细胞生长成接近汇合的(例如>98％)或汇合的单层的实施方式，这是特别有益的因素。从而，在冷冻保存过程中，基质有效诱导成核而无需本领域已知的其他方法，包括：接种冰晶或其他成核剂、机械振动、电冷冻等，这将对在基质上形成的均匀细胞层产生负面影响。当细胞处于汇合或接近汇合的定向时，以上的某些成核方法可以与仅在成核过程中辅助的基质一起使用。因此，除了接种的细胞的潜热释放过程中受控速率冷冻所提供的温度补偿外，基质构型和与细胞的空间关系由此额外地有利地促进了冷冻保存细胞的活力。潜热释放部分地取决于细胞系，但主要取决于所用冷冻保存介质的组成。换句话说，基质表面基本平行于接种在基质上的细胞的单层，有效地充当散热器，以在冷冻保存和解冻时(包括从接种的细胞释放潜热时)有效地传热。

理想的基质还可以具有有益的特性，例如在美国专利8,808,687中所述的基质中可以看到的那些。基质特性包括：细胞生长表面，以促进粘附和细胞单层的生成；周界，其阻止细胞生长(例如，基质的周界部分不由用于针对细胞生长亲和力的足够营养物和废物运输的薄膜部分构成，和/或周界由凸缘(raised lip)构成等)，并允许在目标组织附近进行机械操作和植入。

在某些实施方式中，将基质设计成具有符合所期望植入部位的最佳非平面正常状态。尽管可以在培养和冷冻保存过程中对基质进行操作以保持平面形状，以更容易处理，便于通过自动化机器进行细胞接种并改善细胞活力，但植入后呈非平面形状可以是有益的。在接种有细胞的基质包含RPE细胞并被植入以适当覆盖视网膜内的地图状萎缩区域的实施方式中，基质被最佳弯曲以匹配眼内视网膜的径向曲率。所述曲率引起外界膜(ELM)的平行生长，这表明光感受器微结构和相邻视觉功能的恢复。平行于基质形成的RPE单层和光感受器充当前体细胞的黏附剂，前体细胞在成熟后形成ELM。相比之下，RPE细胞的独立细胞注射、非区别性形状细胞凝胶和悬浮液的临床结果较差。

将基质/膜可逆地粘附到组织培养容器上的方法

在由于随后的植入而需要小的基质/膜(小于100mm

冷冻保存优化：细胞生物学评估

在接种在基质上的细胞的冷冻保存的实施方式中，最佳的冷冻保存活力特性在每个制备阶段是不同的。

首先，在细胞接种时(定义为第0天)，将细胞最佳选择为非成熟细胞，其更容易适应接种过程并在接种后保持活力。在RPE细胞的实施方式中，这些特性包括：(未极化的或部分极化的，(ii)最小至轻微色素沉着或不存在黑色素，(iii)在<100％汇合(例如，50％-90％汇合，并且更理想的是70％-80％汇合)的接种密度下接种。

在接种在基质上的RPE细胞的冷冻保存的实施方式中，当接种后表现出最佳的冷冻保存活力特性时，选择并冷冻保存RPE细胞。在接种后2至10天之间观察到此类特性，并且在大部分实施方式中，在接种后6至8天之间观察到此类特性。在即将冷冻保存时观察到的最佳冷冻保存活力特性包括：(i)无色素沉着或色素沉着最少的RPE细胞(包括脱色素的RPE细胞，具有由色素沉着通路中自然或诱导的遗传突变导致的色素沉着改变或化学诱导的色素沉着改变或其组合的RPE细胞)，(ii)未极化或部分极化的RPE细胞，(iii)具有超过50％的成熟鹅卵石形态的RPE细胞，尽管一些成纤维细胞形态是可以接受的，(iv)基因表达水平低于成熟细胞的基因表达水平或缺乏特定基因表达的RPE细胞，和(v)处于亚汇合(小于100％或亚汇合(大于90％汇合)单层构型的RPE细胞，例示了在基质上的积极(positive)附着和生长以及紧密连接的形成，这是上皮细胞层的特性。

最佳冷冻保存活力RPE细胞的一个特性是无色素沉着或最少/部分色素沉着。RPE细胞含有许多黑素体，即从细胞的顶端区域延伸到中部的色素颗粒。某些RPE细胞(例如与黄斑区域相接的那些)的色素沉着更紧密。无色素沉着或有限色素沉着的RPE细胞可以是未完全分化的、未分离的和/或未纯化的细胞。可以实施各种方法，包括通过以下使RPE细胞脱色素：化学去除(例如黑素原生成抑制剂)、改变生长介质、与生理上邻近的细胞类型相互作用等。在一个实施方式中，黑素原生成抑制剂丙硫氧嘧啶(PTU)被用于防止酪氨酸多步转化为多巴醌和真黑色素(Eumelanin)。这种抑制黑素原生成和冷冻保存时黑色素不存在的方法促进解冻后RPE细胞存活。PTU可以被本领域已知的各种其他物质取代，以预防或限制与黑素原生成相关的通路。

最佳冷冻保存活力RPE细胞的另一个特性是非极化、部分极化或完全极化。极化的RPE细胞能够区分顶端方向(对应于RPE细胞的面向视网膜的一面)和基底端方向(对应于RPE细胞的面向脉络膜的一面)，这模仿包括以下的生理特性：顶端微绒毛、界限清楚的紧密连接、膜运输能力和黑素细胞色素沉着。极化可以在视觉上区分，也可以通过顶端、基底端和非极性依赖性细胞分泌物的测量比率来区分。

最佳冷冻保存活力RPE细胞的又另一个特性是观察到鹅卵石形态。分化的、分离的和/或纯化的细胞的RPE细胞呈现立方形鹅卵石形态的外观。

最佳冷冻保存活力RPE细胞的另一个特性是低于成熟细胞的基因表达水平或缺乏特定基因表达。可以通过RNA或其他核酸表达、蛋白质表达、脂质表达、糖基化模式、免疫组织学染色或电生理性质来检测此特性。也可以替代地或另外地实施第二测量技术，例如分泌组水平的测量。

最佳冷冻保存活力RPE细胞的另一个特性是亚汇合单层构型。当细胞充分生长进入所有可用部分并达到接触抑制时，实现汇合。达到汇合后，与亚汇合相比，包括哺乳动物细胞类型在内的许多细胞类型表现出不同的特性。基质上单层RPE细胞的理想细胞接种密度是2.0x 10E5至7.0x 10E5个细胞/毫升细胞悬浮液，或1.0x 10E3至4.0x 10E3个细胞/平方厘米基质表面，或1.0x 10E5至3.5x 10E5个细胞/标准48孔细胞培养板的孔。从培养的细胞(随着细胞的增殖，其遵循对数阶段生长)的标准特性生长模式可以看出，一旦达到汇合，细胞接种密度就会更接近1.0x 10E6。细胞密度可以通过图像分析、分光光度法、电/阻抗分析以及其他更具侵入性/破坏性方法进行测量。与多细胞层相比，单层是通过基质的平坦细胞接种表面促进的，并且与基质营养物/废物运输比率相匹配以支持单层。

在基质上接种RPE细胞后3-10天之间会获得最佳冷冻保存活力RPE细胞，其中细胞在基质上尚未达到100％汇合并且完全分化。在此时间窗口期间获得最佳冷冻保存活力RPE细胞，但可能会根据所用细胞系、生长介质、基质特性、培养条件及其组合而有所不同。因此，在对接种有细胞的基质进行冷冻保存之前，应定性和定量地检查上述最佳冷冻保存活力RPE细胞特性中的一种或多种。

应考虑上述基质和细胞系特性，以创建最佳的冷冻保存和解冻方案，以最大化细胞活力和功能以及基质完整性。

可以使用各种方法来提高冷冻保存解冻后细胞的活力，包括冷冻保护剂的各种组合及其去除。

最佳的解冻后RPE细胞应保持接近100％汇合，死细胞少于30％(最佳少于10％)，并保持鹅卵石形态。到解冻后5-10天，PEDF的分泌水平理想地是5-12ng/mm2/24hr，最佳地是约9.6ng/mm

任选的细胞培养改善：上清液

在各种实施方式中，细胞培养已显示产生许多细胞化学产物，包括用于旁分泌、自分泌、内分泌和细胞间电信号传导中的那些。这些化学产物可以在细胞培养物中找到，并且在提取和归类后，作为细胞培养添加剂具有潜在价值。细胞分泌物可包含蛋白质、激素、酶、副产物、废物或其组合。从此处开始，将获得的因子的原始组合、其经选择的组合、或纯化形式统称为“目标上清液”。

旨在补充地图状萎缩(GA)中丧失的RPE的细胞疗法的进一步发展引起了极大兴趣。目前正在I/IIa期临床试验中的一种此类疗法包括CPCB-RPE1，一种视网膜下植入物，其包含生长在超薄聚对二甲苯膜上的极化的人胚胎干细胞(hESC)衍生的RPE(PRPE)(KashaniAH,Lebkowski JS,Rahhal FM,等人A bioengineered retinal pigment epithelialmonolayer for advanced,dry AMD.Sci.Transl.Med.2018；10:435,eaao4097.)。在动物研究中，CPCB-RPE1能够恢复PRPE单层并支持光感受器(PR)保留，甚至超出了植入物的边界，这表明PRPE衍生的可溶性因子起着关键旁分泌作用。这样，除了植入物本身以外，极化的色素沉着的PRPE单层所分泌的必需营养和信号传导因子的独特集合也可以维持PR的存活和功能。

因此，使用源自PRPE细胞的可溶性营养因子来促进PR拯救、存活和修复显示出巨大的希望。一些研究者已经证明了RPE衍生的条件型(conditioned)介质或特定RPE营养因子在体外和体内模型中减少视网膜细胞丧失的能力。据报道，生长因子和条件型介质的组合能够促进视网膜外植体中的PR增殖和分化。具体地说，在视网膜片的移植中，已经使用了神经营养生长因子(例如BDNF和GDNF)作为补充。同样，LaVail等人证明，多种生长因子、细胞因子和中性粒细胞延缓光损伤皇家外科医学院(RCS)大鼠模型中受损的PR。然而，由于单一生长因子或生长因子的有限组合仅针对单一病因，因此其本身成功率有限。

基于这些研究的成功以及在CPCB-RPE1的边界之外观察到的旁分泌作用，可以推测该植入物所分泌的浓度不同的多种营养因子能够作为潜在的组合疗法，用于治疗人的干性晚期非血管性AMD(干性AMD)。用源自CPCB-RPE1修饰的植入物的PRPE可溶性因子(SF)处理的视网膜营养不良动物模型中的表征、体外和体内结果证实了这一概念的可行性。

产生细胞系特异性目标上清液的方法由以下构成：在生物相容性基质或容器上，在生物相容性基质或容器中，或包封在生物相容性基质或容器中，在特定的成熟阶段和/或不同的分化阶段之间，用生长介质的特定混合物培养目标细胞，这促进特定的生长，从而扩大某些因子的有效生成。可以通过以下的组合通过定期评估在基质上接种的细胞来监测各阶段：上述视觉形态(例如立方形、鹅卵石状、色素沉着等)，针对某些因子(例如BDNF、BMP-7、PEDF、TGF、VEGF等)及其浓度的特定测试、对测试细胞静息膜电位值(例如mV)的全细胞电流钳记录。

在RPE细胞的实施方式中，文献显示了用于区分未成熟和成熟RPE细胞的各种指标。例如，成熟的RPE细胞的静息膜电位值通常是-40mV至-50mV。但是，未成熟RPE细胞具有稍微去极化的静息膜电位(通常是-25mV至-35mV)。此外，成熟RPE细胞的全细胞电压钳记录指示电压激活的内向电流和电压门控钠通道的活性，这在未成熟RPE细胞中未观察到(Nymark等人，2013)。

在一个实施方式中，将RPE细胞接种在玻连蛋白涂覆的聚对二甲苯膜上，并在37℃在5％CO2培养箱中的XVIVO10(XVIVOTM10，Lonza)中培养。从第28天开始到第40天，每4天收集目标上清液(汇总在图X中)。第28天到第40天特别有意义，因为它体现了感兴趣的成熟的特定阶段：接近汇合(超过90％，理想情况下超过98％的膜覆盖)，鹅卵石形态，遍及膜的均匀单层分布，最小至中等的色素沉着(0％-70％色素沉着)。收集方法可以变化，但是在一个实施方式中，通过移液器从培养孔中提取介质，小心不要提取细胞。在一些实施方式中，可以使用细胞过滤器以确保仅提取上清液。

细胞的进一步活力以及因此分泌因子的质量可以通过USP无菌和USP支原体测试来确认。可以通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-qPCR)进一步检测细胞的基因表达，以鉴定特定的感兴趣基因(例如RPE细胞的RPE65、REX1、EIF2B2、SERF2、UBE2R2等)。可另外检测收集的目标上清液中如图X所示的特定因子的量和浓度。尽管分泌因子因不同细胞系和培养方法而异，但如果使用相同的细胞系和培养方法，多个样品显示上清液组成的最小批次间变化，从而证明产生上清液的可重复性。

在一个实施方式中，可以将从多天和/或多个膜收集的目标上清液合并。然后用0.2μm注射器过滤器系统过滤目标上清液。在各种实施方式中，过滤的目标上清液可以以未浓缩的1x形式原样使用，可以使用Amicon离心过滤器设备(Milipore Sigma)(具有kD截止值(例如3kD截止值))浓缩(例如3x)，或用稀释剂或药物载剂稀释。在一些实施方式中，首先将目标上清液浓缩，然后用特定的药物载剂(例如，水性、亲脂性溶液、悬浮液)稀释，所述药物载剂被选择用于期望的载剂依赖性因子吸收和特定因子的改善的货架期。目标上清液理想地是储存在-80℃下，直至进一步使用以延长货架期。然后可以将目标上清液包装在注射器中，并任选地补充生长介质或其他治疗剂。在另一个实施方式中，可以另外提取目标上清液沉淀物以进一步用作高浓度或长期扩散植入物。

在又一个实施方式中，可以在选择性可渗透基质上培养细胞，以使细胞极化并产生特定分泌物。例如，已知极化的RPE细胞产生顶端分泌物、基底端分泌物和非极性特定分泌物。RPE细胞顶端分泌物包含αB结晶蛋白、透明质酸、MMP-9、PEDF、TGF-β、TIMP-I、MGF-E8。RPE细胞基底端分泌物包含：胱抑素C、内皮素I、FGF 5、VEGF。RPE细胞非极性特定分泌物包含：BDNF、CFH、CNTF、腓骨蛋白3/5、FGF 2、HB-EGF、HGF、IGF-I、LIF、MMP-9、NGF、弹性蛋白原。鉴定的其他营养因子有：IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-6、PEDF-AA、BMP-7。

可以在植入细胞疗法介质(例如细胞溶液，接种有细胞的凝胶，接种有细胞的基质等)后，将包装的上清液作为疗法在有或没有另外的补充剂情况下定期注入目标部位，以补充生长支持、持续功能以及宿主和或植入的细胞与目标部位组织的整合。包装的上清液可以在植入之前另外涂覆在细胞疗法介质上，添加至培养介质，或者在细胞接种之前涂覆在基质上。

在其他实施方式中，在添加上清液之后，将细胞进一步培养直至它们表现出成熟特性。对于RPE细胞，这些成熟特性选自：(i)色素沉着的RPE细胞，(ii)极化RPE细胞，(iii)具有成熟鹅卵石形态，没有神经和成纤维细胞区域的RPE细胞，(iv)具有成熟细胞的基因表达水平的RPE细胞以及(v)处于汇合单层构型的RPE细胞。

在不植入接种有细胞的支持结构的实施方式中，可以使用各种其他细胞生长表面，包括基质、网格结构、琼脂、水凝胶或本领域已知的其他细胞生长表面。

上清液已在动物模型(即，免疫缺陷型皇家外科医学院(iRCS)大鼠模型，一种公认的FDA动物模型，用于地图状萎缩和老化相关的黄斑变性的药物和细胞治疗剂研发)中显示出治疗活性，包括抗炎，视觉功能响应(即，通过视网膜电图评估的b波振幅增加)以及保留的视网膜结构，包括增加的光感受器存活和功能。此外，与PEDF对照的单一因子(一种已知的神经保护和抗血管生成剂)相比，上清液显示出更高的光感受器存活，表明多于一种因子促进目标旁分泌作用。此外，尽管进行了多次注射，但未观察到致瘤性或眼内炎的证据。

优化的冷冻保存方案和注意事项

冷冻休眠方案

在一些实施方式中，替代标准的冷冻保存方案，冷冻休眠方案已显示出接种在基质上的解冻细胞的提高的活力。冷冻休眠方案如下。在初始受控温度缓降阶段之后，一旦达到低于接种的细胞的潜热释放的第一温度(0℃至-20℃)，将细胞保持在第一温度持续第一时间段。第一温度是低于潜热释放温度的任何温度，并且可以是-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃或-100℃。第一时间段是12小时、1天、7天、28天，并且有助于在不立即急剧改变温度情况下使细胞适应冷冻保存状态。这种适应还防止了温度降低(-1℃/min或更大)可能会导致的在基质中形成细微撕裂。在第一时间段之后，将冷冻保存的细胞转移并保持在储存温度下持续第二时间段。在大部分情况下，为了方便起见，储存温度是-196℃(例如液氮温度)，但是可以与休眠温度相同。在一些实施方式中，也以受控的温度缓降阶段的温度降低速率(约-1℃/分钟至约-30℃/分钟或此范围内的任何速率，直至达到第二温度)将接种有细胞的基质转移至第二温度。这种特定的温度缓降有助于各种组分(即，基质，至少一种细胞类型，冷冻保护剂溶液和冷冻保存容器)的均匀降温。

在某些实施方式中，将细胞保持在处于第一温度下的设定温度冷冻器和携带箱中直到解冻。尽管这需要使用便携式的设定温度冷冻器，但长期休眠温度会增加解冻后的细胞活力(因为解冻过程的温度差小于从-196℃(例如液氮温度)的温度差)，并且从而具有显著更小的温度变化区域，对于分批的接种有细胞的基质解冻以及在较小规模上的每个单独基质中，温度变化区域会导致可变的冰晶形成模式和不同的冷冻保护剂去除速率。

冷冻保存优化：RPE细胞系

在hESC-RPE细胞的某些实施方式中，针对特定细胞系测试并优化了冷冻保存方案的各种组合。尽管使用特定的细胞系进行了测试，但由于考虑到了上述细胞系和基质特性的主要因素，对于其他RPE细胞系也预期类似的结果。

CPCB-RPE1植入物的RPE细胞显示出细胞最佳冷冻保存活力特性，包括：(i)无色素沉着的RPE细胞(包括脱色素的RPE细胞)，(ii)未极化或部分极化的RPE细胞，(iii)大多数具有成熟鹅卵石形态的RPE细胞，(iv)基因表达水平低于成熟细胞的基因表达水平或缺乏特定基因表达的RPE细胞，(v)处于亚汇合单层构型的RPE细胞，或其组合。接种到可植入基质上后的3至12天(7天是批次之间的中位天)之间获得了这种细胞最佳冷冻保存活力特性组合。

CPCB-RPE1细胞系显示出了基质最佳冷冻保存活力特性，包括基质热膨胀系数、基质弹性参数、基质厚度和基质植入尺寸，对于基质的设计，所有这些都已考虑。

用冷冻保护剂和冷冻速率的各种组合测试了各种细胞系。最可行的组合是使用CS-10(制造商：BioLife Solutions,Bothell,华盛顿)，DMSO浓度为10％，并且以-5℃/min至-30℃/min冷冻。相比之下，DMSO浓度为2％和5％以及-1C至-3C的冷冻速率具有较低的细胞活力结果。

然后使用各种方法评估组合，包括解冻后1天和1周的细胞相差图像，细胞的基因表达，细胞的活力染色和阿尔玛蓝(alamar blue)代谢。

3x纯化的上清液中选择的营养因子的示例浓度

术语“基本(上)”或“约”表示±10％(例如，按重量或体积计)，在一些实施方式中，表示±5％。在本说明书全文中，提及“一个示例”、“示例”、“一个实施方式”或“实施方式”意味着结合示例描述的特定特征、结构或特性包括在本发明技术的至少一个示例中。因此，在本说明书全文中各处出现的短语“在一个示例中”、“在示例中”、“一个实施方式”或“实施方式”不一定都是指同一个示例。此外，在技术的一个或多个示例中，可以以任何适合的方式组合特定特征、结构、路径、步骤或特性。本文提供的标题仅是为了方便，并不旨在限制或解释所要求保护的技术的范围或含义。