多囊卵巢综合征肠道菌群生物标志物筛选及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肠道菌群标志物，及其在多囊卵巢综合征肠道菌群检测、多囊卵巢综合征患病风险预测、多囊卵巢综合征预后监测中的应用。

背景技术

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是育龄妇女最常见的内分泌疾病之一，以月经周期不规律、雄激素过多、无排卵和多囊卵巢形态为主要特征。许多研究表明，如果未对PCOS患者进行有效治疗，可导致心脑血管和代谢相关疾病、II型糖尿病甚至子宫内膜癌的发生，严重影响患者的生活质量。国内最近的流行病学调查显示，19-45岁妇女的PCOS发病率为5～10％，而国外PCOS的发病率可高达10～22％。

人体肠道中的微生物群落与宿主之间的关系极为密切，据研究，肠道菌群失调与多种临床疾病密切相关。近年来，越来越多的研究表明肠道菌群失调与PCOS的发生发展密切相关。目前，PCOS的诊断为排除性诊断，主要依赖临床症状及超声检测。而患者临床表现异质性大，容易与其他疾病混淆，超声医生的经验缺乏等诸多因素，不利于临床准确诊断和指导相关治疗。因此，寻找较为稳定的PCOS肠道菌群生物标志物具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于从肠道菌群角度提供一种PCOS的检测方法，为PCOS的辅助诊断与疗效监测提供参考。

本发明采用以下技术方案来实现：

一种基于肠道菌群的PCOS生物标志物组合，该生物标志物组合用于提供相对丰度信息，其包含以下的多种：

生物标志物1：Ruminococcus_bromii；

生物标志物2：Gordonibacter_pamelaeae；

生物标志物3：Eesulfovibrio_piger；

生物标志物4：Eubacterium_ventriosum；

生物标志物5：Prevotella_stercorea。

所述的生物标志物组合提供的相对丰度信息用于和参考值进行比较。

所述的生物标志物1～5的相对丰度信息是基于能够对其进行丰度计算的基因序列来提供的。

所述的基于肠道菌群的PCOS生物标志物组合作为检测靶点或检测目标在制备检测试剂盒中的应用。

所述的基于肠道菌群的PCOS生物标志物的筛选方法，步骤如下：

1)样本收集：收集PCOS病人和健康人的粪便样品迅速转移到-80℃保存，提取DNA；

2)宏基因组测序

3)数据分析计算出物种的相对丰度；

4)使用R包随机森林模型筛选特征变量，进行1000次的交叉验证得到候选菌，利用RF模型筛选的物种相对丰度对每一个体计算其PCOS患病风险，绘制ROC曲线，并计算出AUC作为判别模型效能评价参数，选取标志物组合数＜30，且判别效能最佳的组合，在模型中输出每个物种的重要性指数，重要性指数越高，代表该标志物用来判别PCOS和非PCOS的重要性越高。

所述样本集中，样本受试者包括23个PCOS病人和23个健康人。

上述标志物的使用方法即诊断对象是否患有PCOS或者预测对象是否患有PCOS的风险的方法为：

1)从对象中采集样本；

2)确定步骤1)中获得的所述样本中的生物标志物的相对丰度信息；

3)将步骤2)中所述的相对丰度信息与参考数据集或参考值进行比较。所述方法不仅仅可以用于多囊卵巢综合征的疾病诊断，同时可以用作科学研究或者其他个人遗传信息的丰富以及遗传信息库的丰富等非疾病诊断。利用检测对象中的各生物标志物的相对丰度信息与参考数据集或参考值进行比较，来确定对象是否患有PCOS，或者预测其患有PCOS的风险。

所述参考数据集包括来自多个PCOS患者和多个健康对照的样本中的生物标志物的相对丰度信息。

本发明中所述参考值指的是健康对照的参考值或正常值。本领域技术人员已知，当样本容量足够大时，可利用本领域公知的检测和计算方法获得样品中每个生物标志物的正常值(绝对值)的范围。当采用测定方法检测生物标志物的水平时，可将样品中的生物标志物水平的绝对值直接与参考值进行比较，以评估患病风险以及诊断或早期诊断PCOS，任选地，可以包括统计方法。

步骤2)中所述的相对丰度信息与参考数据集进行比较的步骤中，还包括执行多元统计模型以获得患病概率。利用多元统计模型可以实现快速高效检测。具体的，所述多元统计模型为随机森林模型。

所述患病概率大于阈值表明所述对象患有PCOS或相关疾病或者有患有PCOS的风险。具体的，所述阈值为0.32。

步骤2)中所述生物标志物的相对丰度信息是利用测序方法得到的，进一步包括：从所述对象的所述样本中分离得到核酸样本，基于所获得的所述核酸样本，构建DNA文库，对所述DNA文库进行测序，以便获得测序结果；以及基于所述测序结果，将测序结果与参考基因集进行比对，以确定所述生物标志物的相对丰度信息。

根据本发明的一种实施例，可以利用SOAP2和MAQ的至少一种将测序结果与参考基因集进行比对，由此，可以提高比对的效率，进而可以提高PCOS检测的效率。根据本发明的实施例，可以同时对多种(至少两种)生物标志物进行检测，可以提高PCOS检测的效率。

所述参考基因集包括从多个PCOS患者和多个健康对照的样本中进行宏基因组测序，获得非冗余基因集，然后将所述非冗余基因集与肠道微生物基因集合并，得到所述参考基因集。本发明中的参考基因集可以是已有的基因集，如现有的已经公开的肠道微生物参考基因集；也可以是将多个PCOS和多个健康对照的样品进行宏基因组测序，获得非冗余基因集，然后将所述非冗余基因集与肠道微生物基因集合并，得到所述参考基因集，由此获得的参考基因集信息更全面，检测结果更可靠。

所述非冗余基因集作本领域技术人员通常的理解来解释，简单来说是去除冗余基因后的剩余基因的集合。冗余基因通常指的是一条染色体上出现的一个基因的多个复份。

具体的，所述样本为粪便样本。所述测序方法是通过第二代测序方法进行的。

所述测序方法是通过选自Hiseq2000测序装置进行的。由此，能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，从而有利于对后续测序数据进行分析，尤其是进行统计学检验时的精确性和准确度。

本发明提出了所述的基于肠道菌群的PCOS生物标志物组合作为检测靶点或检测目标在制备检测试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断对象是否患有PCOS或者预测对象是否患有PCOS的风险。

即，本发明提出了一种包括用于检测生物标志物的试剂的试剂盒，利用该试剂盒，可以确定这些标志物在肠道菌群中的相对丰度，由此，可以通过所得到的相对丰度值，从而确定对象是否患有或者易感PCOS，以及用于监控PCOS患者的治疗效果的效率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明基于以下事实和问题的发现和认识作出的：

粪便是人体的代谢产物，其内不仅包含人体的代谢产物，还包括对我们的机体代谢和免疫以及代谢功能的变化密切相关的肠道微生物。对粪便进行研究，发现在PCOS患者和健康人群的肠道菌群的组成上存在明显的差异，可以准确地对PCOS进行患病风险评估、早期诊断。本发明基于对PCOS患者和健康人群肠道菌群的比较和分析，得到多种相关的肠道微生物，结合高质量的PCOS人群和健康人群物种相对丰度数据作为训练集，能够准确地对PCOS患者进行患病风险评估、早期诊断。该方法与目前常用的诊断方法相比，具有方便、快捷的特点。

本发明提出的PCOS相关的生物标记物对早期诊断是有价值的。第一，本发明的标记物具有较高的特异性和灵敏性。第二，粪便的分析保证准确性、安全性、可负担性和患者依从性。并且粪便的样本是可运输的。基于聚合酶链反应(PCR)的试验舒适且无创，所以人们会更容易参与给定的筛选程序。第三，本发明的标记物还可以用作于对PCOS患者进行治疗监测的工具以检测对治疗的响应。由于丰度度量的原因，本发明5种标记物的组合特别适用于基于标记基因比对方法度量丰度的情况。

附图说明

图1根据本发明一个实施例种水平上PCOS患者和健康对照LEfSe分析。

图2根据本发明的一个实施例基于随机森林模型(5个肠道标志物)，由PCOS患者和健康对照组成的受试者操作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线和曲线下面积(Area under Curve，AUC)。

具体实施方式

实施例1

1.1样本收集

选取了2018年3月-2019年5月在广东省中医院妇科门诊就诊的多囊卵巢综合征患者23例和健康女性对照23例，收集粪便样品后迅速转移到-80℃保存，提取DNA。

1.2宏基因组测序与组装

利用所提取的DNA样本构建测序文库，在Illumina HiSeq2000测序平台上进行双向(Paired-end)宏基因组测序(插入片段350bp，读长100bp)。对测序产生的数据进行过滤(quality-controlled)，去除adapter污染序列、低质量序列和宿主基因组污染序列，得到高质量的测序片段(reads)。

1.3组间标志菌种分析

通过LEfSe分析软件作图，在Kruskal-Wallis秩和检验的基础上做线性判别分析，如图一所示：当LDA＞2时，对PCOS和健康对照分组起最大影响的菌种有四种。其中普通拟杆菌和大肠埃希氏菌在PCOS中的丰度显著高于健康对照组，而肠杆菌和未分类菌的相对丰度显著低于健康对照组。

1.4利用随机森林(ROC/AUC)筛选PCOS发生发展的潜在生物标志物

使用R包随机森林模型筛选特征变量，进行1000次的交叉验证得到5个菌，利用RF模型筛选的物种相对丰度对每一个体计算其PCOS患病风险，绘制ROC曲线，并计算出AUC作为判别模型效能评价参数。而当5个菌种作为诊断时，如图二所示：AUC即有83.29％，该组合具有较好的诊断效能。