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雄性不育基因ZmTKPR1及其在创制玉米雄性不育系中的应用

文献发布时间：2023-06-19 11:16:08

技术领域

本发明属于植物生物技术育种领域，具体涉及雄性不育基因

背景技术

玉米是我国第一大粮食作物，常年播种面积在5.5亿亩以上，玉米种业健康发展对保障国家粮食安全有着重大的战略意义。同时，玉米种业也是全球市值最大、商业化程度最高、科技含量最高的种业领域，是全球种业竞争的战略要地。我国玉米种业与国际领先水平相比，在科技创新和产业模式等方面，仍然存在巨大差距。一是受限于玉米雄性不育基础研究尚未取得根本性突破等因素，导致玉米自交系知识产权保护困难，造成近年来我国玉米种业长期存在跟随性、模仿性育种现象，重大新品种选育效率缓慢。二是玉米制种产业仍然处于依靠人工去雄为主的劳动密集型阶段，成本高，资源消耗巨大，种子质量难以保障。

玉米是杂种优势利用最成功的作物之一，雄性不育系是作物杂种优势利用和杂交制种的重要材料，主要包括细胞质雄性不育（CMS）和细胞核雄性不育（GMS）。CMS 是由线粒体基因和核基因共同控制的，虽然已应用于玉米育种和杂交种生产中，但存在资源利用率低、不育系胞质单一、易感病等问题。 GMS 由核基因单独控制，可以克服 CMS缺陷，但很难通过常规育种方法大量繁殖纯合不育系。近年来，随着生物技术的进步，通过基因工程和分子设计育种相结合创制的玉米多控不育技术以及植物通用型显性不育技术，可以有效地解决玉米隐性核雄性不育系的保持和繁殖问题。实现上述技术应用的重要前提是获得大量功能明确的控制玉米雄性发育的GMS基因和对应的雄性不育材料。

与模式植物拟南芥和模式作物水稻相比，玉米中已克隆和鉴定的GMS基因和创制的雄性不育材料均相对较少。CRISPR/Cas9（Clustered, Regularly Interspaced, ShortPalindromicRepeats-associated Endonuclease 9）基因编辑技术由于具有成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点，被越来越广泛地应用于植物基因功能研究，作物遗传改良和育种等多个方面，应用前景十分广阔。利用CRISPR/Cas9技术挖掘鉴定玉米雄性不育候选基因和创制雄性不育材料，可以快速丰富玉米GMS基因和不育材料资源，从而促进玉米不育化育种和制种的推广和应用，最终可以有效解决我国玉米种业行业长期面临缺乏稳定的玉米不育系和突破性大品种的瓶颈问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供雄性不育基因

为实现上述目的，本发明提供了

在另一方面，本发明还提供了

在另一方面，本发明还提供了一种创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，抑制玉米中

在一些实施方案中，上述抑制基因表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中任一种。

在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9方法包括：在

在另一方面，本发明还提供一种获得

材料获得

本发明还包括通过上述任一方法获得的

更进一步地，本发明还提供了两种针对玉米雄性不育系

本发明的优点及有益效果如下：

附图说明

图1为

S5，造孢细胞时期；S6, 小孢子母细胞时期；S7，减数分裂开始时期；S8a，减数分裂Ⅰ，二分体时期；S8b，减数分裂Ⅱ，四分体时期；S8b-9，四分体-单核小孢子时期；S9，单核小孢子时期；S9-10，单核小孢子-小孢子空泡化时期；S10，小孢子空泡化时期；S11，小孢子第一次不均等有丝分裂，二核小孢子时期；S12，小孢子第二次有丝分裂，三核小孢子时期。

图2为

图3为野生型

野生型

图4为野生型与

上排为玉米野生型（WT）与

图5为野生型与

从左至右依次为：野生型（WT）花药整体；

图6为利用共分离标记对

共分离标记ZmTKPR1-1-F/R对5株

图7为利用共分离标记对

共分离标记ZmTKPR1-2-F/R对6株

具体实施方式

下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一玉米

在maizeGDB 库（https://www.maizegdb.org/）中，查询到玉米

由于

、玉米花药的取样与发育时期鉴定

从玉米自交系B73处于不同发育阶段的雄穗中，按照花药的长度，收集不同长度的花药样品；每份样品采集20个长度相近的新鲜花药，其中3个固定在FAA溶液中（Coolaber，中国）通过树脂半薄切片实验确定具体的发育阶段，其余17个花药立即冷冻在液氮中，用于RNA的提取。

利用梯度乙醇（50%、70%、90%、100%）对用于树脂切片的固定花药进行脱水，每步15-30分钟。脱水过程中花药可置于70%乙醇中长期保存；为便于后期包埋，可在90%乙醇中加入0.1%的伊红对材料进行染色；为保证脱水彻底，材料须在无水乙醇中脱水2-3次。随后进行树脂替换，将花药依次置于乙醇与Spurr树脂体积比为3:1、1:1、1:3液体中2-4小时，最后置于纯树脂中过夜。树脂置换完成后，将花药置于模具中，加入200 µL Spurr树脂，置于烘箱中，70℃聚合过夜。随后进行修块，然后可利用德国莱卡切片机进行切片，切片厚度为2µm；用镊子夹取切好的片子，置于载玻片中央的无菌水中，42℃条件下展片过夜。将固定有样品的载玻片浸入0.1%的甲苯胺蓝染液中，染色1分钟，然后用去离子水冲洗，再置于展片台上，烘干后即可用于显微观察；也可以封片后长期保存。分析树脂切片的结果，根据玉米14个不同发育时期（Stage1-Stage14：S1-S14）的细胞学特点，确定每份样品的具体发育时期。

、qRT-PCR分析

用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取上述鉴定的处于不同发育时期（S5-S12）的玉米花药总RNA；然后使用5X All-in-One RT Master Mix （ABM，加拿大）合成cDNA；采用TBGreen™PreMix Ex Taq™（TaKaRa，日本）在QuantStudio5 QuantStudio 5 Real-Time PCRSystem （ABI，美国）上进行定量逆转录聚合酶链反应检测，

实施例二玉米

为了明确玉米

、

本发明的基因编辑载体为

（1）靶标gRNA的设计。将

（2）通过在引物上设计靶点然后PCR扩增获得MT-sgRNA。引物ZmTKPR1-MT1-F和引物ZmTKPR1-MT2-R扩增中间载体

ZmTKPR1-MT1-F:5’-ATATATGGTCTCTGGCGAAGCCGCTTGACGAGCCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA -3’；

ZmTKPR1-MT2-R:5’-ATTATTGGTCTCTAAACCTTGGCTTATCAAACGGCTTGCTTCTTGGTGCCGC-3’。

（3）通过酶切连接构建到骨架载体。将

图2所示为目的基因

、农杆菌介导的玉米遗传转化

将上述构建的

、 T

为确定T

本发明首先采用CTAB法提取玉米叶片DNA，具体方法如下：剪取2厘米左右长度的幼苗叶片，放入装有钢珠的2 mL离心管；将装有叶片的离心管放入液氮浸没5分钟，然后利用研磨仪打碎叶片样品；向离心管中加入700 μL CTAB提取缓冲液（其中含有1%的β-巯基乙醇），并用力震荡混匀， 65 ℃恒温水浴中预热20-30 min，（期间取出颠倒1-2次，并注意实验样品编号的对应）；离心管冷却至室温后加入700 μL氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，用力摇晃30s之后在室温条件下静置片刻；在4 ℃条件下，以12000 rpm速度离心5 min，取离心完成后的500 μl上清液于新的1.5 mL离心管中；将等体积的异丙醇加入到盛有上清液的离心管中轻轻震荡混匀，室温条件下静置10 min左右；随后将盛有样品的离心管放入4 ℃离心机中，以12000 rpm速度离心10 min之后，轻轻吸取上清液，弃上清，保留沉淀；加入800 μL75 %乙醇，洗涤沉淀两次，以10000 rpm速度离心5 min，弃掉上清；将样品放置在室温下自然干燥2-4小时，得到DNA沉淀，加入适量无菌水溶解，轻微震荡，充分溶解DNA。DNA样品存于-20 ℃保存。用Nanodrop检测DNA浓度，稀释至10 ng/L用作PCR模板。

然后根据

（1）检测靶标： MT1；产物大小：454 bp；引物序列如下：

ZmTKPR1-1-T-F: 5’- AGAATGGCTAACACTGCTAAG-3’；

ZmTKPR1-1-T-R: 5’- GAAGCTGCAAATATGAGAAAC-3’。

然后根据

（2）检测靶标： MT2；产物大小：203 bp；引物序列如下：

ZmTKPR1-2-T-F: 5’- AGAATGTTCCTGCCGATGCTT-3’；

ZmTKPR1-2-T-R: 5’- GCAAATACCTGGGTCCCTGAC-3’。

提取基因组DNA，按照以下PCR参数扩增：

反应体系：15 μL MIX常规PCR体系，0.5 μL forward primer，0.5 μL reverseprimer，1 μL DNA，5.5 μL 灭菌ddH

反应程序：常规PCR：58 ℃退火、延伸30s、32轮循环。

接着将PCR产物回收并连接T载体测序，通过测序多个T

对

、 F

由于在温室生长的玉米T

按照上述的CTAB法提取叶片DNA后，首先利用

进一步针对

实施例三

上述实施例二鉴定的不含有

、雄穗、花药和花粉活力的观察

在营养生长和雌穗的发育方面，

、花药的扫描电镜（SEM）观察

为了深入解析

实施例四

1、共分离分子标记的开发

在本发明中，针对获得的

共分离分子标记ZmTKPR1-1-F/R包括第一引物ZmTKPR1-1-F和第二引物ZmTKPR1-1-R；该标记能够特异性检测玉米

ZmTKPR1-1-F：5’-GAATGGCTAACACTGCTAA-3’；

ZmTKPR1-1-R：5’-CATGGTACCCAGACTCAAG-3’。

共分离分子标记ZmTKPR1-2-F/R包括第一引物ZmTKPR1-2-F和第二引物ZmTKPR1-2-R；该标记能够特异性检测玉米

ZmTKPR1-2-F：5’-GGCAAGGTATGTGTAACCG-3’；

ZmTKPR1-2-R：5’-CCTACCACATGATATCCAG-3’。

、共分离分子标记的应用

为了验证上述标记的有效性，以实施例三中获得的F

理论上，ZmTKPR1-1-F/R和ZmTKPR1-2-F/R分别在

这些分子标记有助于在开花和授粉前确定突变基因型，以便在不同遗传背景下进行杂交和回交选育雄性不育系，具有重要的应用价值。

序列表

<110> 北京科技大学

北京中智生物农业国际研究院

北京首佳利华科技有限公司

<120> 雄性不育基因ZmTKPR1及其在创制玉米雄性不育系中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1322

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

atggctaaca ctgctaaggg taaggtctgt gtcactgggg cgtctggttt catcgcctcc 60

tggctcgtca agcggcttct tgagtctggg taccatgtcc tgggtacagt cagagaccca 120

ggtcagtttc atcttattct gatgatgatc tgaattaaaa tactagtaat acctgttgac 180

ggtttatgtc cattttcatt acctgtcaaa taaatcactc ctgaaagcaa agatgtcttg 240

gtagggaatg gcaagaaagt agggcacctc tggggcctgg aaggcgcaaa ggaaaggctg 300

cagctcgtga gagctgatct cttggaggaa gggagcttcg acgacgctgt gatggcttgc 360

gagggcgtct tccacaccgc atcgcccgtc gtcaccggat ctaattccaa ggcatgctaa 420

acaccaattc tgtttctcat atttgcagct tcaggaaagg cctggacata tagcgacctg 480

aaacatgttg gtgccacttg gcaggaggag atgcttgatt cagcaataaa cggcacgatg 540

aacgtgctac gctcgtgcaa gaagaaccca tcgctcaaga gggttgtcct gacatcctcg 600

tcgtcgacag tgaggatcaa ggacgaagcc gacctgcccc ctaacgtgct gctggacgaa 660

tcgtcgtgga gctccatcga gttctgcgaa agtctccagg tgagcgtacg gtcgtcagaa 720

gagtgatttg gaccgtacct gcgtgacaat gtgctgttcc cgtgctccct tagatatggt 780

acgccgtcgc aaagatcctc gccgagaagg cagcctggga gttcgccgga gagcacagga 840

tcgacctcgt caccgttctt ccgaccttcg ttgtcggacc tactctgtct cctgagctcg 900

gccccaccgc ttctgatgtc ctcggcctgt tccaaggtac gtccgcaaaa gtttgtgcaa 960

gaccagagcc ctctcgtcag tctcatagac ctttgtcttt gttgcaggag agacggggaa 1020

gttcacgacg tacgggagga tggggtacgt ccacatcgac gacgtggcga ggtgccacat 1080

gctggcgtac gaggccgcgg gcgcccgagg gaggtacatc tgcagcgcgg cggtgctgga 1140

ctgcggcgac ctcgccgccc tgctcgcgcg gcggttccca gcgtaccccg tcccgaggag 1200

cctgccccgc gcctacggcg agcagtcgta cggcttcgac acgtccaagg cccgcgcgct 1260

ggggctggcg gaattcaagg gcgtcgagga gatgttcgac gacgccgtcg cctcgttcat 1320

ag 1322

<210> 2

<211> 1514

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

atggtgacct caagcaaggg caaggtatgt gtaaccgggg cctcaggctt tgttgcctct 60

tggcttatca aacggctcct cgagtctgga tatcatgtgg tagggactgt cagggaccca 120

ggtatttgcg aaatatcatt actttcgtat cagtcctctt tattacatta ataattcttg 180

attaccaatt ttttttcttt ttttttgtaa ccccacaagg aaatcaccaa aaaacagccc 240

acctttggaa attacctggc gctaaagaga ggctgcaaat cgtgcgagct gatctgttgg 300

aagaagggag cttcgacagc gccgtgatgg cctgtgaggg tgtattccac actgcatccc 360

ccgtcctcgc taaaccagac tctactagca aggcatgcca tcgccgcata tatatgcata 420

tctggaccat ccatcctact gcagcctttt ctacggaagc gcgttgcatc tactagctaa 480

ttaagctgtt tttcatgcat gcatggtgca ggaggaaacg ctcgttcctg cggtgaacgg 540

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agtgtctact ctctgtcatc gtcgatctct caaaccgtga tctgaaaaca cgcatgcaca 780

cgtcgttgcg gtgtcgtccc ttgctttgtt gttcacccga agctatggta tgccctagcc 840

aaggtatttg cagagaaagc ggcgtgggag ttcgccaagg agaacggcat cgaccttgtg 900

actgtcctcc cgtcgttcgt gatcgggccc agtttgtccc acgagctatg cgttaccgct 960

tcagacgtcc taggcctatt ccaaggtact cattcgtacg tgttctggtt ttcgtatgtt 1020

aaatagatga ctggaaacaa gaggtatata tatatatata tatatatata ttctctgttc 1080

ccaggcgaca cggcaaggtt cagctcgtac ggaagaatgg gatacgtcca catcgacgac 1140

gttgcgagca gccacatcct ggtgtacgag gccccccagg ccgccgggag gtacctgtgc 1200

agctcagtgg tgctggacaa cgacgagctg gtctcctcgc tcgcgaaacg ctacccgata 1260

ttccccatac cccggaggtc agtcgtcgtc gcgtcgtctg gatgtgcgtg ccattttaag 1320

atctctgaac ggagagccgt gtgcatggtc cgttctgctg caggctgaac agcccctacg 1380

gcaagcagtc gtaccagctg aacacgtcga agctgcaggg gctgggcttc aagttcagag 1440

gggtgcagga gatgttcgac gactgcgtac agtcgctcaa agaccaggga cacctgctgg 1500

agtgccccct gtga 1514

<210> 3

<211> 343

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 3

Met Ala Asn Thr Ala Lys Gly Lys Val Cys Val Thr Gly Ala Ser Gly

1 5 10 15

Phe Ile Ala Ser Trp Leu Val Lys Arg Leu Leu Glu Ser Gly Tyr His

20 25 30

Val Leu Gly Thr Val Arg Asp Pro Gly Asn Gly Lys Lys Val Gly His

35 40 45

Leu Trp Gly Leu Glu Gly Ala Lys Glu Arg Leu Gln Leu Val Arg Ala

50 55 60

Asp Leu Leu Glu Glu Gly Ser Phe Asp Asp Ala Val Met Ala Cys Glu

65 70 75 80

Gly Val Phe His Thr Ala Ser Pro Val Val Thr Gly Ser Asn Ser Lys

85 90 95

Glu Glu Met Leu Asp Ser Ala Ile Asn Gly Thr Met Asn Val Leu Arg

100 105 110

Ser Cys Lys Lys Asn Pro Ser Leu Lys Arg Val Val Leu Thr Ser Ser

115 120 125

Ser Ser Thr Val Arg Ile Lys Asp Glu Ala Asp Leu Pro Pro Asn Val

130 135 140

Leu Leu Asp Glu Ser Ser Trp Ser Ser Ile Glu Phe Cys Glu Ser Leu

145 150 155 160

Gln Ile Trp Tyr Ala Val Ala Lys Ile Leu Ala Glu Lys Ala Ala Trp

165 170 175

Glu Phe Ala Gly Glu His Arg Ile Asp Leu Val Thr Val Leu Pro Thr

180 185 190

Phe Val Val Gly Pro Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Ala Ser

195 200 205

Asp Val Leu Gly Leu Phe Gln Gly Thr Ser Ala Lys Val Cys Ala Arg

210 215 220

Pro Glu Pro Ser Arg Gln Ser His Arg Pro Leu Ser Leu Leu Gln Glu

225 230 235 240

Arg Arg Gly Ser Ser Arg Arg Thr Gly Gly Trp Gly Thr Ser Thr Ser

245 250 255

Thr Thr Trp Arg Gly Ala Thr Cys Trp Arg Thr Arg Pro Arg Ala Pro

260 265 270

Glu Gly Gly Thr Ser Ala Ala Arg Arg Cys Trp Thr Ala Ala Thr Ser

275 280 285

Pro Pro Cys Ser Arg Gly Gly Ser Gln Arg Thr Pro Ser Arg Gly Ala

290 295 300

Cys Pro Ala Pro Thr Ala Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Arg Pro Arg

305 310 315 320

Pro Ala Arg Trp Gly Trp Arg Asn Ser Arg Ala Ser Arg Arg Cys Ser

325 330 335

Thr Thr Pro Ser Pro Arg Ser

340

<210> 4

<211> 331

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 4

Met Val Thr Ser Ser Lys Gly Lys Val Cys Val Thr Gly Ala Ser Gly

1 5 10 15

Phe Val Ala Ser Trp Leu Ile Lys Arg Leu Leu Glu Ser Gly Tyr His

20 25 30

Val Val Gly Thr Val Arg Asp Pro Gly Asn His Gln Lys Thr Ala His

35 40 45

Leu Trp Lys Leu Pro Gly Ala Lys Glu Arg Leu Gln Ile Val Arg Ala

50 55 60

Asp Leu Leu Glu Glu Gly Ser Phe Asp Ser Ala Val Met Ala Cys Glu

65 70 75 80

Gly Val Phe His Thr Ala Ser Pro Val Leu Ala Lys Pro Asp Ser Thr

85 90 95

Ser Lys Glu Glu Thr Leu Val Pro Ala Val Asn Gly Thr Leu Asn Val

100 105 110

Leu Arg Ser Cys Lys Lys Asn Pro Phe Leu Lys Arg Val Val Leu Thr

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Ala Val Arg Ile Arg Asp Asp Gly Gln Ser Ser Ser

130 135 140

Asn Ile Ser Leu Asp Glu Thr Ala Trp Ser Ser Val Pro Leu Cys Glu

145 150 155 160

Lys Met His Leu Trp Tyr Ala Leu Ala Lys Val Phe Ala Glu Lys Ala

165 170 175

Ala Trp Glu Phe Ala Lys Glu Asn Gly Ile Asp Leu Val Thr Val Leu

180 185 190

Pro Ser Phe Val Ile Gly Pro Ser Leu Ser His Glu Leu Cys Val Thr

195 200 205

Ala Ser Asp Val Leu Gly Leu Phe Gln Gly Asp Thr Ala Arg Phe Ser

210 215 220

Ser Tyr Gly Arg Met Gly Tyr Val His Ile Asp Asp Val Ala Ser Ser

225 230 235 240

His Ile Leu Val Tyr Glu Ala Pro Gln Ala Ala Gly Arg Tyr Leu Cys

245 250 255

Ser Ser Val Val Leu Asp Asn Asp Glu Leu Val Ser Ser Leu Ala Lys

260 265 270

Arg Tyr Pro Ile Phe Pro Ile Pro Arg Arg Leu Asn Ser Pro Tyr Gly

275 280 285

Lys Gln Ser Tyr Gln Leu Asn Thr Ser Lys Leu Gln Gly Leu Gly Phe

290 295 300

Lys Phe Arg Gly Val Gln Glu Met Phe Asp Asp Cys Val Gln Ser Leu

305 310 315 320

Lys Asp Gln Gly His Leu Leu Glu Cys Pro Leu

325 330

<210> 5

<211> 19

<212> DNA