一种新的支原体鉴定方法

技术领域

本发明属于支原体鉴定技术领域，具体涉及一种新的支原体鉴定方法。

背景技术

支原体(mycoplasma)是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物，大小为0.1～0.3微米。在细胞培养试验中支原体污染广泛存在，但是由于支原体体积小，生长缓慢，故很难被察觉出来。目前个实验室中鉴定支原体污染的方法主要有染色法、颜色反应法、以及荧光定量PCR法。染色法与颜色反应法灵敏度较低，荧光定量PCR较为昂贵因此，对于广大中小实验室并不普及。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的支原体鉴定方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新的支原体鉴定方法，具体包括以下步骤：

步骤1、取细胞培养液上清2毫升,室温下500g离心5分钟；

步骤2、另取一只新的离心管，将步骤1离心后所得上清转移到新的离心管中；

步骤3、室温下12000g离心10分钟，弃去上清；

步骤4、将上述离心管在100℃温度下煮沸15分钟；

步骤5、取离心管中的液体2μl放入到新的试管中作为模板；

步骤6、在模版中加入上游引物和下游引物各0.5μl、2X PCR mix10μl和ddH2O 10μl，形成PCR体系；

步骤7、将PCR体系在94℃的温度下培养10min；

步骤8、依次在94℃的温度下培养10min，在55℃的温度下培养30s，在72℃的温度下培养30s；

步骤9、按照步骤8培养34个循环后，在72℃的温度下培养60s；

步骤10、取1ul培养后的PCR体系样本液体使用Qubit4.0检测扩增结果。

优选的，所述上游引物为5'-TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC-3'。

优选的，所述下游引物为5'-GGGAGCAAA CAG GAT TAGATA CCCT-3'。

优选的，所述步骤1-步骤10须在II级生物安全柜内操作，并严格遵守无菌操作。

本发明的技术效果和优点：本发明避开了使用荧光定量PCR，使普通分子生物学实验室也能进行支原体的高灵敏性检测，具有更广泛的普及性。

具体实施方式

实施例1

一种新的支原体鉴定方法，具体包括以下步骤：

步骤1、取细胞培养液上清2毫升,室温下500g离心5分钟；

步骤2、另取一只新的离心管，将步骤1离心后所得上清转移到新的离心管中；

步骤3、室温下12000g离心10分钟，弃去上清；

步骤4、将上述离心管在100℃温度下煮沸15分钟；

步骤5、取离心管中的液体2μl放入到新的试管中作为模板；

步骤6、在模版中加入上游引物和下游引物各0.5μl、2X PCR mix10μl和ddH2O 10μl，形成PCR体系；

步骤7、将PCR体系在94℃的温度下培养10min；

步骤8、依次在94℃的温度下培养10min，在55℃的温度下培养30s，在72℃的温度下培养30s；

步骤9、按照步骤8培养34个循环后，在72℃的温度下培养60s；

步骤10、取1ul培养后的PCR体系样本液体使用Qubit4.0检测扩增结果。

实施例2

一种新的支原体鉴定方法，具体包括以下步骤：

步骤1、取细胞培养液上清2毫升,室温下500g离心5分钟；

步骤2、另取一只新的离心管，将步骤1离心后所得上清转移到新的离心管中；

步骤3、室温下12000g离心10分钟，弃去上清；

步骤4、将上述离心管在100℃温度下煮沸15分钟；

步骤5、取离心管中的液体2μl放入到新的试管中作为模板；

步骤6、在模版中加入上游引物和下游引物各0.5μl、2X PCR mix10μl和ddH2O 10μl，形成PCR体系；

步骤7、将PCR体系在94℃的温度下培养10min；

步骤8、依次在94℃的温度下培养10min，在55℃的温度下培养30s，在72℃的温度下培养30s；

步骤9、按照步骤8培养34个循环后，在72℃的温度下培养60s；

步骤10、取1ul培养后的PCR体系样本液体使用Qubit4.0检测扩增结果。

优选的，所述上游引物为5'-TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC-3'。

优选的，所述下游引物为5'-GGGAGCAAA CAG GAT TAGATA CCCT-3'。

优选的，所述步骤1-步骤10须在II级生物安全柜内操作，并严格遵守无菌操作。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。