一种盐离子辅助水酶法提取花生油体和蛋白的方法

技术领域

本发明涉及食品或保健食品技术领域，尤其涉及一种盐离子辅助水酶法提取花生油体和蛋白的方法。

背景技术

花生作为我国重要的经济作物、实用作物和油料作物，富含油脂、蛋白质以及多糖等营养素，是人类饮食生活中重要的植物油脂和蛋白质来源。花生中含有45-55％左右的油脂以及22-30％的蛋白，其中花生油脂在细胞中以油体的形式存在。花生油体主要由三酰基甘油、磷脂和蛋白质组成，三酰基甘油构成油体的疏水性内核，外层由磷脂单分子层和界面蛋白形成的磷脂-蛋白质单层膜包裹。独特的结构赋予油体良好的物理和化学稳定性。作为天然预乳化的油，花生油体应用于食品体系中不需要乳化剂和均质过程，并且从植物种获得油体由于其更健康、经济等优点逐渐开始以天然乳液的形式应用于食品等领域。

常用的油体提取方法有水剂法和水酶法。水剂法首先是在水中浸泡油料种子，然后通过粉碎以破坏细胞壁来释放细胞内物质，离心后得到油体；该技术可能产生含有细胞壁碎片和外源性储存蛋白等成分，这些会影响所提取的油体的理化特性。水酶法在水剂法的基础上通过添加酶制剂对油料细胞壁进行降解，加速油体和蛋白的释放。构成细胞壁的成分中，90％为多糖(主要为纤维素、半纤维素和果胶)，10％为蛋白质，因此常用的酶有蛋白酶和细胞壁降解酶(如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶以及复合植物水解酶等)。在使用蛋白酶时，细胞中释放的蛋白质在反应过程中部分被分解为小分子的肽段或者蛋白质碎片，导致其应用受限。而细胞壁降解酶只对细胞壁的多糖进行酶解，不破坏蛋白质，更适用于水酶法提取。水酶法提取花生油体的方法在先前的专利(CN106929147A)中已有研究，使用细胞壁降解酶提取花生油体的同时还能得到优质的未被水解的蛋白，此方法大大提高了花生资源的综合利用率。

但在水酶法提取花生油过程中，水相中会出现微乳形式的油体，水相花生蛋白的溶解度也有待提高，这会影响油体和花生蛋白的得率；且单一采用酶制剂，其并没有发挥最优酶活，其会影响细胞壁的降解效率从而影响花生油体和蛋白质的释放，因此寻找一种试剂来辅助水酶法进行高效分离花生油体和蛋白是一种行之有效的方法。

发明内容

为了克服现有技术中水酶法提取花生油所存在的问题，本发明提供一种高效提取花生油体和蛋白的方法，其采用无机盐(盐离子)辅助水酶法提取花生油体和蛋白。本发明在对花生湿法粉碎的基础上，通过添加酶制剂，同时在酶解过程中添加盐离子，最大程度提取花生油体和蛋白质，从而扩宽花生的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种盐离子辅助水酶法提取花生油体和蛋白的方法，其包括以下步骤：

步骤1)将样品花生采用去离子水进行浸泡、洗涤，洗涤后的花生与去离子水混合进行湿法粉碎，获得花生浆；

步骤2)在步骤1)获得的花生浆中同时添加酶制剂和无机盐进行酶解反应；

步骤3)对步骤2)所述酶解反应后的花生浆进行离心，分层收集获得花生油体和蛋白。

为了进一步优化上述方法，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，步骤2)中，所述酶制剂为蛋白酶或细胞壁降解酶，所述细胞壁降解酶选自纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和复合植物水解酶中的一种。

进一步地，所述酶制剂为复合植物水解酶Viscozyme L。其中，Viscozyme L主要成分为木聚糖酶、阿拉伯糖酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶和纤维素酶。

进一步地，步骤2)中，基于所述花生浆的用量，所述酶制剂的添加量为1.5～3％v/w；优选，酶制剂的添加量为1.8～2.4％v/w；更优选，酶制剂的添加量为2％v/w。

进一步地，步骤2)中，所述无机盐选自氯化钙、氯化钾和氯化钠中的至少一种；优选，所述无机盐为氯化钙、氯化钾或氯化钠。

进一步地，步骤2)中，基于所述花生浆的用量，所述无机盐的添加量为0.3～1.2M；优选0.6～1.2M，更优选0.9～1.2M。更进一步地，所述无机盐为氯化钾，添加量为0.9M。

进一步地，步骤2)中，所述酶解反应的操作条件为：pH 6～8，温度40～60℃，酶活为4000～6000U/mL，反应时间为1.5～3h；优选，酶解反应的操作条件为：pH 6.5～7.5，温度45～55℃，酶活为4500～5500U/mL，反应时间为1.5～2.5h；更优选，酶解反应的操作条件为：pH 7，温度50℃，酶活为5000U/mL，反应时间为2h。

进一步地，所述样品花生为脱红衣花生。

进一步地，步骤1)中，所述浸泡操作中，所述样品花生与去离子水的w/v配比为1:3～7，操作条件为2～6℃浸泡6～10h；优选，样品花生与去离子水的w/v配比为1:4～6，操作条件为3～5℃浸泡7～9h；更优选，样品花生与去离子水的w/v配比为1:5，操作条件为4℃浸泡8h。

进一步地，步骤1)中，浸泡后的花生洗涤2-3次后进行湿法粉碎操作。

进一步地，步骤1)中，所述湿法粉碎操作中，所述洗涤后的花生与去离子水的w/v配比为1:3～7，粉碎后的花生浆的平均粒径为2.5～4μm；优选，洗涤后的花生与去离子水的w/v配比为1:4～6，粉碎后的花生浆的平均粒径为3～3.5μm；更优选，洗涤后的花生与去离子水的w/v配比为1:5，粉碎后的花生浆的平均粒径为3.2μm，粉碎时间可根据所需的平均粒径和所用设备进行调整，例如采用九阳多功能研磨机粉碎2min。

进一步地，步骤3)中，所述离心和分层收集的操作具体为：对酶解反应后的花生浆在4000～6000转/分钟下离心5～15min，分层收集上层油体、中层水相蛋白和下层纤维素沉淀；其中，收集的所述上层油体后重复离心2～4次(离心条件与上相同)，获得花生油体；收集的所述中层水相蛋白通过碱溶酸沉、冻干后获得花生分离蛋白。优选，4500～5500转/分钟下离心8～12min；更优选，5000转/分钟下离心10min。

进一步地，所述中层水相蛋白的具体处理操作为：用氢氧化钠溶液调节pH至8.5～9.5，45～55℃搅拌80～120分钟后，于3000～5000转/分钟离心15～30分钟，取上清液并加入盐酸溶液调节pH至花生蛋白等电点，搅拌20～40分钟后，于3000～5000转/分钟离心15～30分钟，下层沉淀水洗至中性，冷冻干燥后得到所述花生分离蛋白。优选，用1M氢氧化钠溶液调节pH至9，50℃搅拌100分钟后，于4000转/分钟离心20分钟，取上清液并加入1M的盐酸溶液调节pH至花生蛋白等电点，搅拌30分钟后，于4000转/分钟离心20分钟，下层沉淀水洗至中性，冷冻干燥后得到所述花生分离蛋白。

进一步地，所述花生油体的得率为80～97％(例如83～97％，具体可为86.77％、91.11％、93.88％、92.35％、96.42％等)，所述水相蛋白的得率为30～70％(例如40～70％，具体可为66.20％、59.31％、41.88％、69.06％等)。

本发明的第二个方面是提供一种由任一上述的方法制得的花生油体和蛋白以及由所述花生油体和/或蛋白制备的产品，所述产品包括但不限于：乳制品、保健品、食用油等。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

本发明在水酶法的基础上，在酶解过程中同时加入无机盐(盐离子)，盐离子的添加可使酶制剂(例如复合植物水解酶Viscozyme L)的酶活升高从而提高细胞壁的降解效率加速油体和蛋白质的释放；再者，盐离子的添加能够有效的减少水相中以微乳化形式存在的油体，并且能够有效的促进花生蛋白溶解于水相增加蛋白得率。本发明所述的方法选用盐离子辅助水酶法提取花生油体和蛋白，在水酶法的基础上，对破碎后的花生浆添加盐离子和破壁酶来尽可能地提高油体和蛋白得率，从而得到一种安全、高效、环保的花生油体提取技术，且使用的盐离子和酶制剂在后续处理中可以经过洗涤脱除，满足了食品行业绿色安全的要求。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明一实施例中盐离子辅助水酶法提取花生油体和蛋白的方法的工艺流程图；

图2为本发明一实施例中氯化钙添加量对花生油体和蛋白得率的影响示意图；

图3为本发明一实施例中氯化钠添加量对花生油体和蛋白得率的影响示意图；

图4为本发明一实施例中氯化钾添加量对花生油体和蛋白得率的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

下述实施例中，所使用的原料及试剂如下：

花生(豫花-23)购买于河南农业科学院Viscozyme L购买于诺维信公司；

氯化钙、氯化钠和氯化钾购买于天津市天力化学试剂有限公司；

酶制剂：Viscozyme L(主要成分为木聚糖酶、阿拉伯糖酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶和纤维素酶)，上述酶制剂对细胞壁进行酶解或者破坏。

在一较佳实施方式中，上述盐离子辅助水酶法提取花生油体和蛋白的方法包括如下步骤：将样品花生采用去离子水进行浸泡、洗涤，洗涤后的花生与去离子水混合进行湿法粉碎，获得花生浆；在获得的花生浆中同时添加酶制剂和无机盐进行酶解反应；对所述酶解反应后的花生浆进行离心，分层收集获得花生油体和蛋白；

其中，在上述方法中，对未添加无机盐的水酶法的操作条件进行预先优化，根据其酶解效果及油体蛋白得率优选条件如下：酶制剂为蛋白酶或细胞壁降解酶，细胞壁降解酶选自纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和复合植物水解酶中的一种；基于花生浆的用量，酶制剂的添加量为1.5～3％v/w，酶解反应的操作条件为：pH 6～8，温度40～60℃，酶活为4000～6000U/mL，反应时间为1.5～3h；浸泡操作中，样品花生与去离子水的w/v配比为1:3～7，操作条件为2～6℃浸泡6～10h；湿法粉碎操作中，洗涤后的花生与去离子水的w/v配比为1:3～7，粉碎后的花生浆的平均粒径为2.5～4μm；离心和分层收集的操作具体为：对酶解反应后的花生浆在4000～6000转/分钟下离心5～15min，分层收集上层油体、中层水相蛋白和下层纤维素沉淀；其中，收集的上层油体后重复离心2～4次(离心条件与上相同)，获得花生油体；收集的中层水相蛋白通过碱溶酸沉、冻干后获得花生分离蛋白

在一最佳实施方式中，关于未添加无机盐的水酶法的操作条件为：酶制剂为复合植物水解酶Viscozyme L，基于花生浆的用量，酶制剂的添加量为2％v/w，酶解反应的操作条件为：pH 7，温度50℃，酶活为5000U/mL，反应时间为2h；浸泡操作中，样品花生与去离子水的w/v配比为1:5，操作条件为4℃浸泡8h，浸泡后的花生洗涤2-3次后进行湿法粉碎操作；湿法粉碎操作中，洗涤后的花生与去离子水的w/v配比为1:5，采用九阳多功能研磨机C022E粉碎2min，粉碎后的花生浆的平均粒径为3.2μm；离心和分层收集的操作具体为：对酶解反应后的花生浆在5000转/分钟下离心10min，分层收集上层油体、中层水相蛋白和下层纤维素沉淀；其中，收集的上层油体后重复离心3次(离心条件与上相同)，获得花生油体；用1M氢氧化钠溶液调节中层水相蛋白的pH至9，50℃搅拌100分钟后，于4000转/分钟离心20分钟，取上清液并加入1M的盐酸溶液调节pH至花生蛋白等电点，搅拌30分钟后，于4000转/分钟离心20分钟，下层沉淀水洗至中性，冷冻干燥后得到花生分离蛋白。

实施例1

本实施例为采用水酶法的最佳工艺操作条件后，在水酶法的酶解过程同时添加无机盐，并对无机盐及其添加量作进一步优化研究，其中无机盐以氯化钙、氯化钾或氯化钠为例进行说明，其涉及的盐离子辅助水酶法提取花生油体和蛋白的方法包括以下步骤：

(1)将15.00±1.00g去皮花生与去离子水按照1:5(w/v)混合，放在4℃下浸泡8h，之后取出并用去离子水洗涤2-3次；

(2)将浸泡所得的花生重新与去离子水按照1:5(w/v)混合，对其进行湿法粉碎，粉碎时间为2min，最终粉碎后的花生浆的平均粒径为3.20μm；

(3)向花生浆中添加Viscozyme L进行酶解，酶的添加量为2％(v/w)；

(4)在添加酶的同时，分别添加0、0.3M、0.6M、0.9M和1.2M的氯化钙、氯化钾或氯化钠；

(5)反应在50℃、pH 7下进行2h，对酶解后的花生浆在5000转/分钟下离心10min，取出上层油体后按相同条件重复离心3次，收集3次所得油体即为全部油体；取出中层水相蛋白通过碱溶酸沉、冻干后获得花生分离蛋白；取出下层渣相进行冻干，根据凯式定氮法测定蛋白质含量。

(6)将油体放置在真空干燥箱中，45-50℃温度下干燥10h后，根据公式1计算油体得率。对于水相蛋白得率根据公式2计算：

上述实验结果如图1～3和下表1～2所示：

表1盐离子添加量对花生油体得率的影响

表2不同盐离子添加量对花生蛋白得率的影响

注：a、b、c、d代表不同的显著性

由上述实验结果可知，随着无机盐(盐离子)的使用，花生油体及蛋白的得率基本上均有所提高，在仅添加酶制剂且未添加无机盐时，油体得率和蛋白质得率分别为79.92％和40.23％。与未添加无机盐相比，当氯化钙的添加量为1.2M时，油体得率达到最大值91.11％，蛋白质得率为59.31％；当氯化钠的添加量为0.6M时，油体得率达到最大值93.88％，蛋白质得率为46.35％；当氯化钾的添加量为0.9M时，油体得率达到最大值96.42％，蛋白质得率为69.06％。由上对比可知，在酶解过程中添加盐离子，可显著提高花生油体和蛋白的得率。

由上述实施例可知，在对水酶法提取花生油体和蛋白的工艺条件进行优化后，本发明在同时添加酶制剂和无机盐的情况下，其花生油体和蛋白的得率优异，且显著高于单独添加酶制剂的方法，且已有研究证明只添加盐离子时花生油体和蛋白得率远低于单独使用酶制剂，因此本发明所述的方法中花生油体和蛋白的得率显然远高于单独添加无机盐的方法。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。