一种海洋来源卵磷脂及其制备方法

技术领域

本发明具体涉及一种海洋来源卵磷脂的制备方法，还涉及该方法制备的卵磷脂。

背景技术

卵磷脂(Lecithin)是以甘油为核心的复酯，在所有生物细胞中都有存在，它是由磷脂酰胆碱，肌磷脂酰肌醇，磷脂酰乙醇胺，磷脂酸，磷脂酰丝氨酸以及神经磷脂等多种磷脂形成的磷脂类混合物，其原料的来源主要是从植物或动物细胞。一般情况下，人们所认为的卵磷脂，指的是胆碱磷酸甘油酯，也叫做磷脂酰胆碱。研究表明，卵磷脂具有乳化、保湿、抗氧化等功效，不过其结构随来源的不同在脂肪酸的构成上有些区别，其功效也因此不同。有资料显示，海洋卵磷脂相较于目前广泛应用的大豆卵磷脂，其脂肪酸的不饱和程度较低，并且富含DHA和EPA，因此海洋卵磷脂的提取引起了广泛关注，目前已有学者成功从鱼类中提取得到了卵磷脂，但从海洋植物中提取卵磷脂还尚未有文献报道。

目前，市场上含有卵磷脂的护肤品品类众多，主要使用其保湿、抗氧化等功效，另外也有一些产品使用卵磷脂脂质体包裹一些活性成分进行添加。中国专利CN201380018132.0公布了一种包含植物卵磷脂的发用化妆品组合物，该发明涉及包含至少一种植物卵磷脂、至少一种阴离子表面活性剂和至少一种脂肪醇的发用化妆品组合物。中国专利CN200810235726.8公布了一种生产化妆品用的人胚胎卵磷脂脂质体包封茄红素的方法，形成化妆品用的脂溶性活性成分脂质体，解决了茄红素对人体皮肤细胞间隙毛孔的染色，并且加入带电荷脂类物质以提高包封率。中国专利CN93106692.1公布了一种包埋维生素的卵磷脂脂质体的化妆品及其制法，该产品借助于脂质体和皮肤细胞的亲合性以及对皮肤的促进渗透作用，可使包埋的维生素对皮肤的渗透率显著提高。

综合来看，目前市面上的卵磷脂以大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂为主，鲜有海洋来源卵磷脂的产品公布。本发明提供一种海洋来源卵磷脂的制备方法，以海带为原料，提取其中的卵磷脂，并对提取工艺进行了优化。

发明内容

本发明目的在于提供一种海洋来源卵磷脂的制备方法，解决的技术问题是现有卵磷脂较少来源于海洋的不足。

本发明目的还在于提供一种海洋来源卵磷脂。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种海洋来源卵磷脂的制备方法，包括以下步骤：

(1)取海带粉末与乙醇水溶液混合后进行超声处理，得处理液A；

(2)对所得的处理液A进行抽滤，得滤液，蒸干，得海带乙醇提取物；

(3)取海带乙醇提取物，用乙酸乙酯溶解，加入硅胶层析柱中，添加乙酸乙酯洗脱，再添加乙醇水溶液洗脱卵磷脂，收集，得纯化液B；

(4)将所得纯化液B进行减压浓缩，干燥即为海带卵磷脂提取物。

步骤(1)中，海带粉与乙醇溶液的料液比为1:10～40(g/mL)。

步骤(1)中，乙醇水溶液的质量百分比浓度为70％～100％。

步骤(2)中，超声处理的超声波功率设置为200W～400W，超声处理时间为45min～65min。

进一步地，超声波处理温度为45-50℃。由于超声处理过程中会有部分产热，结合超声处理对卵磷脂提取的影响，此处控制温度为45-50℃。

步骤(2)中，蒸干的温度设置为40～50℃。

步骤(3)中，海带乙醇提取物与乙酸乙酯的质量体积比为1：30～60(g/mL)；海带乙醇提取物与乙醇水溶液的质量体积比为1：150～200(g/mL)。

进一步地，乙醇水溶液的质量百分比浓度为70％～100％。

步骤(4)中，干燥采用冷冻干燥。

一种海洋来源卵磷脂，通过上述制备方法制得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明海洋来源卵磷脂的制备方法，利用超声辅助乙醇提取法，将卵磷脂从海带中提取出来，使用乙酸乙酯对其进行纯化，去除海带提取物中的脂肪酸等成分，再使用乙醇溶液将卵磷脂洗脱出来，得到了海带卵磷脂。

(2)本发明方法从海带中提取卵磷脂，不仅拓宽了卵磷脂的原料来源，并且对海洋植物的开发应用提供了一定的参考。

(3)本发明制备方法工艺简单，无危害性。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。

实施例1

一种海洋来源卵磷脂的制备方法，包括以下步骤：

(1)海带粉制备：取市售海带，使用高速破碎机粉碎，过40目筛，得到海带粉末；

(2)海带卵磷脂提取：取海带粉末，按1:30g/mL的料液比加入质量百分比浓度为90％乙醇水溶液，置于超声波清洗机中，于266W功率下、45℃下超声处理65min，得到处理液A，过滤，滤液烘干，得到海带乙醇提取物；

(3)纯化：将2.6g硅胶和少量乙酸乙酯，加入20mm直径层析管，高度2～5cm，静置、沉降，去除乙酸乙酯。准确称取1g海带乙醇提取物，使用少量乙酸乙酯溶解后，加入硅胶柱中，使用40ml乙酸乙酯洗脱提取物中脂肪酸等杂质，而后采用160ml质量百分比浓度为90％乙醇水溶液洗脱卵磷脂，得到纯化液B，再进行减压浓缩，冻干，得到海带卵磷脂提取物。

实施例2-10，与实施例1制备方法不同之处，在于超声辅助乙醇提取工艺参数不同，纯化工艺相同，具体工艺参数见表3。

检测实施例1-10制备的海带卵磷脂提取物中卵磷脂含量，同时检测其抗氧化能力，包括清除ABTS自由基的IC50和清除DPPH自由基的IC50，具体检测数据见表3。

一、卵磷脂含量测试方法

1、实验原理

磷脂易溶于正己烷等非极性溶剂中，不溶于丙酮，而其他脂类化合物都溶于丙酮。本方法采用丙酮去除其他脂类化合物，再用正己烷溶解卵磷脂，实现分离。卵磷脂中的磷脂酰胆碱与碘混合生成的络合物在波长292mm处有特征吸收，故采用紫外分光光度法对卵磷脂中的磷脂酰胆碱含量进行测定。

2、实验方法

2.1标准溶液配制准确称取磷脂酰胆碱标准品10.81mg(纯度为92.5％)，用正己烷定容于10mL容量瓶中，配成磷脂酰胆碱含量为1mg/mL的标准液，待用。

2.2显色剂配制取碘适量，加正己烷溶解成0.5％碘-正己烷溶液。

2.3标准曲线的绘制分别取上述标准溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5mL至25mL容量瓶中，添加1mL碘-正己烷显色剂，静置10min，添加正己烷定容，使用分光光度计测定其在292nm下的吸光度，以磷脂酰胆碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷脂酰胆碱标准曲线。

2.4样品液的测定取适量待测粉末，使用丙酮溶解，置于4℃下静置10min，5000r/min下离心20min，去除上清液，添加正己烷溶解沉淀，室温下静置30min，5000r/min下离心20min，取上清液，与显色剂按体积比为9:1混合，在292nm波长下测定吸光度。根据测定的吸光度结合绘制磷脂酰胆碱标准曲线计算卵磷脂含量。

二、清除ABTS自由基的IC50测定方法

1、实验原理

ABTS法是一种体外模型实验，ABTS[2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]二铵盐在K

2、配制试剂

(1)2.45mmol/L过硫酸钾：称取0.066g过硫酸钾，用水定容至100mL；

(2)7mmol/L的ABTS储备液：精确称取0.0386g ABTS，用上述2.45mmol/L的过硫酸钾定容至10mL，避光保存12～16h后使用，可稳定3～4天；

(3)0.2mol/L磷酸二氢钠：精确称取2.399g磷酸二氢钠(无水)，用水定容至100ml；

0.2mol/L磷酸氢二钠：精确称取2.839g磷酸氢二钠(无水)，用水定容至100ml；

(4)0.2mol/L的PBS(pH＝7.4)：19mL0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液与81mL0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液混合，即得；

(4)10mmol/L的PBS(pH＝7.4)：取50mL的0.2mol/L的PBS(pH＝7.4)，用水稀释至1000mL，即得。亦可采用市售10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)。

(5)阳性对照1mg/mL维生素C：称取0.025g维生素C，用水/PBS(10mmol/L，pH＝7.4)定容至25.0mL；取0.8mL稀释至4.0mL得20μg/mL，然后将浓度稀释为200、150、125、100、75、50、25μg/mL。

(6)供试样品溶液：非水溶的用无水乙醇溶解，水溶的用水溶解。

3、测试程序

(1)取ABTS储备液，用10mmol/L的PBS(pH＝7.4)稀释40～60倍(稀释前，充分摇匀ABTS储备液)，使其在734nm处吸光值为0.7-0.8之间，得到ABTS工作液。

(2)样品测定时，96孔板加样顺序可参照下表1

表1 96孔板加样顺序表

4、数据计算

4.1抑制率的计算

清除率(％)＝(1-(A

式中：

A

A

A

4.2计算IC50值

以受试样品的浓度为横坐标，其对应的自由基清除率为纵坐标，绘制曲线图，拟合得到回归方程(R

三、清除DPPH自由基的IC50测定方法

1、实验原理

DPPH·又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。DPPH·在无水乙醇或甲醇溶液中呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH·，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。

2、试剂和仪器设备

2.1试剂

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，CAS:1898-66-4)，含量＞97.0％；

无水乙醇，AR；

维生素C，含量≥99％；

待测液：适用于溶于水，乙醇或者甲醇等有机溶剂的待测物。

2.2仪器设备

TECAN SPARK 10M酶标仪

96孔紫外酶标板(透明)

10-200μL单通道移液枪

50-300μL 8/12通道移液枪

3、配制试剂

(1)0.2mmol/L DPPH溶液：称取0.0079g DPPH，用无水乙醇定容至100.0mL；

(2)阳性对照1mg/mL维生素C：称取0.025g维生素C，用水定容至25.0ml。取1.0mL稀释至5.0mL得20μg/mL，然后将浓度稀释为15、12.5、10、7.5、5、2.5、1.25μg/mL。

4、测试程序

(1)样品测定时，96孔板加样顺序可参照下表2

表2 96孔板加样顺序表

5、数据计算

5.1抑制率的计算

清除率(％)＝(1-(A

式中：

A

A

A

5.2计算IC50值

以受试样品的浓度为横坐标，其对应的自由基清除率为纵坐标，绘制曲线图，拟合得到回归方程(R

表3实施例1-10制备的海带卵磷脂提取物卵磷脂含量及抗氧化性情况

以上实施实例对本发明不同的实施过程进行了详细的阐述，但是本发明的实施方式并不仅限于此，所属技术领域的普通技术人员依据本发明中公开的内容，均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。