具有广谱抗菌活性的和厚朴酚类抗菌肽模拟物及其制备方法

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，涉及一类和厚朴酚结构的抗菌肽模拟物的制备方法及其在抗菌中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

细菌耐药性的不断产生和蔓延严重威胁全球公共健康，由其引发的死亡率也逐年攀升。尤其以“ESKAPE”病原菌(屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、绿假单胞菌和肠杆菌属细菌)为代表的多重耐药菌的出现使得这种趋势更加显著。目前全球每年死于细菌感染的人数大概有70万左右。寻找和开发新结构、新靶点的新型抗菌药物是目前解决日益严峻的细菌耐药性问题最有效的方法之一。

革兰氏阴性菌的外膜由脂多糖、磷脂、蛋白质和脂蛋白等复合构成，由于外膜的存在构成了不对称的膜结构，因此形成了对亲水性和疏水性物质的渗透屏障。抗菌肽是多细胞生物体内广泛存在的带正电荷的亲水亲脂性天然肽，是免疫系统抵御微生物感染的第一道防线。抗菌肽具有共同的结构特征-亲水性正电荷和亲脂性侧链，其在空间上形成同一个分子中一面是亲水部分，另外一面是亲脂部分的空间构象。这种空间结构被认为是抗菌肽具有抗菌活性的基础。一般认为，带正电荷的抗菌肽通过静电吸引作用聚集到带负电荷的微生物膜表面。当聚集的抗菌肽达到临界浓度以上，其疏水部分会插入细菌脂质膜的疏水部分，引发细菌膜破裂，导致细胞内部物质渗漏、膜去极化和细胞死亡。与传统的抗菌剂相比，抗菌肽具有作用机制新颖、抗菌性能强、杀菌速度快、抗菌谱广和不易产生耐药性等特点。因此，抗菌肽作为一类新型的高效抗菌剂极具潜力，已经得到全球科研人员的广泛关注。抗菌肽虽然对革兰氏阳性菌和阴性菌均表现出优异的抗菌活性，但是其也存在一些缺陷，从而制约了其在临床方面的应用。首先，抗菌肽潜在的毒性。抗菌肽的作用靶点是细菌的细胞膜，在发挥抗菌性能的同时也会对正常的哺乳动物产生溶血毒副作用。其次，抗菌肽在生理条件下稳定性差。由于人体内广泛存在蛋白水解酶，进入人体的抗菌肽非常容易被这些酶降解而失去抗菌活性。

除此之外，较髙的合成成本也是限制抗菌肽临床应用的一个因素。针对抗菌肽存在的上述缺陷，科研人员根据抗菌肽独特的分子结构设计并合成了一系列低分子抗菌肽模拟物，在化学结构、理化性质和生物功能上模拟抗菌肽。迄今为止，只有万古霉素、达托霉素和多粘菌素获批临床应用，而向临床研究阶段推进的模拟物有3个，分别是PMX-30063、LTX-109 和CA-13。针对抗菌肽类药物存在的问题，药物化学家尝试通过抗菌肽模拟物的研究来实现高活性、低细胞毒性、高蛋白酶稳定性、合成费用较低的目标。经过十多年的研究，已经发现一系列具有抗菌肽结构特征的小分子也具有与抗菌肽类似的性质。具有亲水侧链和亲脂骨架的抗菌肽小分子模拟物可以形成与抗菌肽类似的空间结构，实现与抗菌肽类似的抗菌效力。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一系列抗菌性能强、杀菌速度快、抗菌谱广的新型和厚朴酚类抗菌肽模拟物，并提供其制备方法。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种具有抗菌活性的和厚朴酚类抗菌肽模拟物或其在药学上可接受的盐，化合物结构如下：

其中，X选自CH

本发明利用和厚朴酚的结构骨架，构建抗菌肽的两亲性结构特性，设计合成一系列和厚朴酚类抗菌肽模拟物，并通过体外活性实验验证其抗菌活性，得到了抗菌性能强、杀菌速度快、抗菌谱广和不易产生耐药性的新型抗菌药物。

本发明的第二个方面，提供了一种具有抗菌活性的和厚朴酚类抗菌肽模拟物或其在药学上可接受的盐的制备方法，具体路线如下：

路线1. 4a-4b,7a-7c的制备路线：

路线2. 10a-10f,12a-12e的制备路线

路线3. 16a-16h的制备路线

本发明的第三个方面，提供了上述具有抗菌活性的和厚朴酚类抗菌肽模拟物或其在药学上可接受的盐在制备治疗细菌感染的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明所述的和厚朴酚类抗菌肽模拟物对革兰氏阳性菌和阴性菌均表现出很好的抗菌活性，尤其是化合物10a-10c,12c,16d对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌，其最小抑菌浓度值为0.5-16μg/mL之间，部分化合物的抗菌活性明显优于阳性对照药物万古霉素和粘菌素。

(2)本发明选取活性最好的化合物10b进一步研究发现，其具有快速杀菌，无毒和不易产生耐药性的特点，有望为解决细菌耐药性问题提供一条新的思路。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：化合物10b对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的时间杀菌曲线；

图2：化合物10b对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的诱导耐药评价；

图3：化合物10b的细胞毒性评价。

图4：化合物10b的氢谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

该化合物有如下结构通式I-III：

其中，X选自CH

其中，X选自CH

其中，R选自正丙基、正戊基、正庚基、正壬基、正十一烷基、金刚烷基、叔丁苯基、联苯基；

更优选的是，所述化合物I、II、III是下列之一：

制备本发明和厚朴酚类抗菌肽模拟物方法的路线如下：

反应条件：(a)碳酸钾，乙腈,75℃；(b)盐酸,二氯甲烷，室温；(c)溴乙酸乙酯，碳酸钾，乙腈，60℃；(d)氢氧化钠，甲醇/水，60℃；(e)N,N-二异丙基乙胺，HATU,氨基取代物；乙腈，室温；(f)三氟乙酸，二氯甲烷，0℃。

路线1. 4a-4b,7a-7c的制备路线

具体通过如下步骤实现：

和厚朴酚1与不同链长的溴取代氨基物在乙腈溶液中碱性条件下发生取代反应得到化合物 3a-3b，其在酸性条件下脱去相应的保护基达到化合物4a-4b；和厚朴酚在碱性条件下与溴乙酸乙酯反应得到化合物5，化合物5在强碱下水解得到化合物6，随后化合物6与不同链长的氨基取代物在碱性条件下发生缩合反应得到化合物7a-7c，最后其脱去Boc保护基得到目标产物8a-8c。

反应条件：(a)1,3-二溴丙烷，碳酸钾，丙酮；(b)N,N-二甲基烷烃，乙腈，回流；

(c)N,N-二甲基丙二胺,N,N-二异丙基乙胺，HATU，乙腈，室温；(d)溴代烷，乙腈，回流。

路线2. 10a-10f,12a-12e的制备路线

具体通过如下步骤实现：

和厚朴酚与1,3-二溴丙烷在碱性条件下反应得到化合物9，化合物9和N,N-二甲基烷烃在乙腈中，80℃反应釜中反应，得到目标物10a-10f；化合物6在缩合剂HATU的催化下与N,N- 二甲基丙二胺缩合得到化合物11，化合物11与不同链长的溴代物反应得到12a-12e。

反应条件：(a)H-Lys(Boc)-OMe，N,N-二异丙基乙胺，HATU，乙腈，室温；(b)氢氧化锂，甲醇/水，60℃；(c)胺，N,N-二异丙基乙胺，HATU，乙腈，室温；(d)三氟乙酸，二氯甲烷，0℃。

路线3. 16a-16h的制备路线

具体通过如下步骤实现：

化合物6与H-Lys(Boc)-OMe缩合得到化合物13，化合物13在氢氧化锂碱性条件下水解得到化合物14，随后化合物14与不同的氨基化合物反应得到化合物15a-15h，最后在三氟乙酸条件下脱去保护基得到化合物16a-16h。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1.

化合物3a,3b的制备

将和厚朴酚(2.00g,7.51mmol)、化合物2(5.05g,22.53mmol)和碳酸钾((3.11g,22.53mmol)) 在乙腈(30mL)中在75℃下搅拌过夜。冷却后，混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。粗产物通过硅胶色谱法纯化得到油状物3a(3.20g， 77％)和3b(2.96g，68％)。

实施例2.

化合物4a,4b的制备

将化合物3a或3b溶解在二氯甲烷(6mL)溶液中，并缓慢加入三氟乙酸(6mL)。将反应液在室温下搅拌5小时。反应完全后，真空浓缩残余溶剂，将残余物进行C-18反相柱层析，冻干后得到4a和4b，为白色固体。

4a：

4b:

实施例3.

化合物5的制备

将和厚朴酚(2.00g，7.51mmol)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，然后加入溴乙酸乙酯(3.14g，18.77mmol)和碳酸钾(3.11g，22.53mmol)。将混合物在60℃搅拌6小时。

反应完全后，真空除去溶剂，并通过快速柱色谱法纯化得到黄色固体2.70g，产率82％。

实施例4.

化合物6的制备

化合物5(2.50g,5.70mmol)溶解在甲醇/水(80mL)混合溶液中，加入氢氧化钠(2.28g, 57.00mmol)，并将反应液在60℃下搅拌过夜。反应完全后，除去过量甲醇并加入浓盐酸将 pH调节至3。将产生的沉淀过滤，干燥得到白色固体1.85g，产率88％。

实施例5.

化合物7a-7c的制备

将中间体6(1.50g,3.92mmol)溶于无水乙腈(30mL)溶液中，加入HATU(3.58g,9.41mmol) 和N,N-二异丙基乙胺(1.52g,11.76mmol)，将反应液在0℃搅拌30分钟，然后加入相应的氨基取代物(9.41mmol)，在室温下继续搅拌另外2小时。反应完全后，减压除去溶剂，残余物用2M盐酸稀溶液中和并用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥并减压浓缩，粗产物通过硅胶柱色谱进一步纯化，得到7a-7c。

实施例6.

化合物8a-8c的制备

所用原料为中间体7a-7c和三氟乙酸，制备方法同实施例2。

8a:

8b:

8c:

实施例7.

化合物9的制备

将和厚朴酚1(2.00g,7.51mmol)溶于丙酮(50mL)中，加入碳酸钾(2.49,18.00mmol)和1,3-二溴丙烷(12.13g,60.08mmol)。将混合液在55℃搅拌8小时，然后用水(100mL)稀释并用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，干燥，并通过硅胶快速色谱法纯化，得到化合物无色油状物2.60g，产率68％。

实施例8.

化合物10a-10f的制备

将化合物12(2.54g,5.00mmol)溶解于乙腈溶液中，加入相应的具有不同链长的N,N-二甲基烷基胺(150mmol)，并将混合物在80℃下剧烈搅拌12h。反应完全后，减压除去溶剂。然后将粗产物在无水乙醚中搅拌除去过量杂质，过滤所得沉淀，得到目标化合物13a-13f。

10a:

10b:

10c:

10d:

10e:

10f:

实施例9.

化合物11的制备

所用原料为化合物6和N,N-二甲基丙二胺，制备方法同实施例5。

实施例10.

化合物12a-12e的制备

所用原料为中间体11和不同链长的卤代物，制备方法同实施例8。

12a:

12b:

12c:

12d:

12e:

实施例11.

化合物13的制备

所用原料为中间体6和H-Lys(Boc)-OMe，制备方法同实施例5。

实施例12.

化合物14的制备

在0℃条件下，向化合物15(2.50g，2.88mmol)的甲醇(20mL)溶液中加入氢氧化锂(8mL， 2M水溶液)。搅拌6小时后，反应混合物用稀盐酸酸化，过滤收集白色固体，滤饼用冷甲醇洗涤。将产物干燥，得到白色固体1.96g，产率81％。

实施例13.

化合物16a-16h的制备

将中间体14(0.84g,1.00mmol)溶于无水乙腈(30mL)溶液中，加入HATU(0.91g,2.40mmol) 和N,N-二异丙基乙胺(0.39g,3.00mmol)。将混合物在0℃搅拌30分钟，然后加入相应的胺 (2.40mmol)，并将混合物在室温下继续搅拌另外10小时。原料耗尽后，除去溶剂，将残余物用2N稀盐酸中和并用饱和氯化钠洗涤。将有机萃取物干燥并减压浓缩，将残余物进行快速柱层析，得到粗产物15a-15h，将其溶解在二氯甲烷(10mL)中并缓慢加入三氟乙酸(8mL)。反应完成后，减压浓缩溶剂，残余物经C-18柱纯化，冻干后得到目标产物。

16a:

16b:

16c:

16d:

16e:

16f:

16g:

16h:

应用例1.

体外抗菌活性测试

微量肉汤稀释法：在96孔板内加入新鲜的营养肉汤培养基，将一定量待测化合物和对照药物的无菌水或DMSO溶液(2560μg/mL,m/V)依次加入至96孔板A–H各行的1号孔中并采用二倍稀释法稀释，然后接种适量具有一定浊度菌液，经37℃恒温孵育24h后，观察各孔细菌生长情况，读取药物的最小抑菌浓度(MIC)。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌株的MIC。

实验结果：

表1.和厚朴酚类抗菌肽模拟物的抗菌活性

表1中给出了对应化合物对六株临床常见细菌的MIC值(2株革兰氏阴性菌，4株革兰氏阳性菌)。总的来说，目标化合物具有广谱的抗菌活性，但是根据MIC数据发现这些化合物对革兰氏阳性菌的抗菌活性比对革兰氏阴性菌好。化合物10a-10c,12c,16d都显示出广谱的杀菌活性，尤其是对革兰阳性菌的MIC值可达到0.5-2μg/mL。同时它们对革兰氏阴性菌也显示出较好的活性，尤其是化合物10b对大肠杆菌ATCC25922的最低抑制活性可达到4μg/mL，所有化合物对铜绿假单胞菌ATCC27853显示出较差或中等的抑菌活性。

应用例2.

杀菌动力学测试

将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌过夜培养，稀释到一定倍数，取一定量菌液，摇床中培养

使细菌生长到对数期，加入不同浓度待测化合物或对照药。加药后0h、1h、3h、5h、7h、9h，在不同化合物和不同浓度的组中各取100μL到96孔板中，离心3min，弃上清，100 μL的1×PBS重悬细菌，并十倍梯度稀释，取10μL滴到MHA琼脂板上，每个浓度三个平行，琼脂板在培养箱中培养24h，根据稀释倍数，计算菌落数。

选择初步抗菌活性较好的化合物10b作为研究对象，研究其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在不同浓度下随着时间的杀菌效力，如图1所示。结果表明化合物13b具有快速的杀菌效果，在8μg/mL和32μg/mL浓度下在3小时内即可把金黄色葡萄球菌和大肠杆菌全部杀死。

应用例3.

耐药诱导性测试

先测定化合物和阳性对照药(诺氟沙星和多黏菌素)对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的各自MIC值。在琼脂溶液中加入化合物和对照药，使其终浓度为1/2MIC。然后把金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别培养在含不同药物的琼脂板上，存活的细菌接种到下一个新板中，持续数日，然后测定化合物和阳性药对琼脂板上细菌的MIC值。

同样选择化合物10b研究其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌耐药性诱导方面的评价。结果表明化合物10b在抑制细菌诱导耐药方面表现优异，通过细菌在药物MIC/2浓度下诱导耐药传代15代，发现化合物10b对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC基本保持稳定，而对照药物诺氟沙星和黏菌素对细菌的MIC增长分别为256倍和64倍，如图2所示，说明该化合物具有抗菌肽不易有待细菌耐药的特性。

应用例4.

细胞毒性测试

磺酰罗丹明B测定法：贴壁细胞的细胞增殖通过磺酰罗丹明B测定(SRB)测定。将细胞接种在96孔板中，然后用不同浓度的药物处理。孵育72小时后，用10％三氯乙酸在4℃下固定细胞1小时，用无菌水水洗涤5次并风干。存活的细胞在室温下用0.4％(w/v)磺酰罗丹明B染色20分钟，并用1％乙酸洗涤5次。用10mM Tris溶解结合的磺酰罗丹明B，并在 540nm处测量吸光度。

选择化合物13b，测定其在不同浓度药物对哺乳动物细胞HepG2的毒性。如图3所示该化合物在低浓度下对该细胞没有抑制作用，只有在高浓度下产生抑制作用，表明该化合物具有较低的细胞毒性。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。