产PEFA的沼泽红酵母XY11菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及一株沼泽红酵母菌株(Rhodotorula paludigena)XY11及使用方法。

背景技术

脂肪酸多元醇酯(Polyol esters of fatty acids，PEFA)是一种双亲性分子，由亲水的多元醇头部和疏水的脂肪酸尾部组成。PEFA由乙酰化(R)-3-羟基脂肪酸通过羧基端酯化五碳或六碳多元醇(通常为D-甘露醇或D-阿拉伯糖醇)得到，通常具有不同程度的乙酰化，碳链长度多为C16和C18。基于亲水性的多元醇头部和疏水的脂肪酸尾部组成的双亲性结构，PEFA能够明显的降低表面张力、提高乳化性能，同时具备高效的抗真菌活性，且临界胶束浓度低，因此其作为优良的新型生物表面活性剂，在工业和家用表面活性剂领域具有极大的商业开发潜力。Kitamoto等人研究发现，PEFA的两亲性也可能使其在制备自组装功能胶束中具有潜在应用。此外，由于其低毒性、可降解性和可再生性等特点，PEFA还可以应用于医药、食品、化妆品、洗涤剂、纸浆和造纸等领域。

多数关于PEFA的研究集中在红酵母属酵母(Rhodotorula)中。其中，Garay等人关于不同酵母种类系统发育树的研究表明，PEFA的生产主要在R.glutinis、R.graminis、R.babjevae和R.diobovata，以及R.paludigena分支中，产量在2-12.4g/L，其他酵母分支中PEFA产量可忽略或未检测到。此外，现有技术中，通过红酵母胞外分泌制备的PEFA，其多元醇头部往往不是单一的多元醇。Jeon等人的研究发现，单一多元醇头部可以赋予制备的纳米胶束在药物传递过程中独特的生理或靶向功能。因此，在后续的应用中往往需要对前述方法得到的PEFA做进一步的纯化，步骤较为复杂。

目前，尚未见可以生产单一多元醇头部的PEFA菌株以及相关应用的报道。

发明内容

基于现有技术中微生物发酵制备PEFA的现状，本申请提供了一株沼泽红酵母(Rhodotorula paludigena)XY11菌株。所述的沼泽红酵母菌株XY11采用合适碳源时，能够特异性在胞外积累具备单一多元醇头部的PEFA，而且10L发酵罐发酵培养条件下显著提高PEFA的产量至43.8g/L，对后续的应用具有重要的意义。此外，本申请还提供了采用沼泽红酵母菌株XY11制备PEFA的方法以及采用PEFA一步自组装制备纳米胶束的方法。

本发明的技术方案：

一株产PEFA的沼泽红酵母(Rhodotorula paludigena)，所述沼泽红酵母菌株命名为沼泽红酵母XY11菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021518，保藏日期为2021年5月12日。

发明人研究发现，采用所述沼泽红酵母菌株XY11合成PEFA，能够在添加不同碳源的培养基中大量合成并分泌单一糖醇头部的PEFA到胞外，实现了产量的显著提升。其中，以葡萄糖为碳源条件下，XY11菌株摇瓶发酵PEFA产量达23.5g/L，10L发酵罐发酵培养下PEFA产量高达43.8g/L，远高于目前已知的其他酵母种类，具有巨大商业前景。此外，所述的沼泽红酵母菌株XY11对不同碳源条件具有底物特异性，通过调整碳源可以生产单一多元醇头的PEFA。其中，以果糖为碳源发酵培养XY11菌株，可单一生产甘露醇头部的PEFA；而以木糖或D-阿拉伯糖为碳源，则可单一生产阿拉伯糖醇头部的PEFA。这说明，XY11菌株可以作为生产特定糖醇头部PEFA的新型细胞工厂，具有重要的实际应用价值。

所述的沼泽红酵母XY11菌株的活化方法，具体为：将菌株接种到YPD固体培养基中，在28-30℃的温度条件下培养1-2天。其中，所述YPD固体培养基的配方为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，琼脂20g/L。

一种包含如前所述的沼泽红酵母XY11菌株的菌剂。

如前所述的沼泽红酵母菌株在发酵生产PEFA中的应用，具体包括以下步骤：(1)将所述的沼泽红酵母XY11菌株接入种子培养基中进行种子培养，培养后分离得到菌体细胞；(2)将菌体细胞接入到发酵培养基，在25-30℃的温度条件下发酵，发酵完成后从发酵液中分离得到PEFA。所述的发酵培养基为：碳源120-140g/L，蛋白胨1.0g/L，酵母提取物1.0g/L，磷酸二氢钾7.0g/L，磷酸氢二钠0.25g/L，七水硫酸镁0.15g/L。

其中，所述的碳源为葡萄糖、木糖、果糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖或者葡萄糖-木糖的混合物；所述混合物中木糖的含量不高于25wt％。本领域技术人员公知，木质纤维素生物质是一种丰富、广泛和难降解的基质，而葡萄糖和木糖是木质纤维素的主要成分；而本申请所述的XY11菌株能够有效利用葡萄糖-木糖混合糖液，从而可以利用富含葡萄糖和木糖的木质纤维素水解物生产PEFA，成为生产高附加值产品的理想菌株。

此外，发明人研究发现，根据碳源组分的不同，XY11菌株发酵生产的PEFA含有不同种类的糖醇头部。其中，采用果糖为碳源时，得到具备甘露醇头部的PEFA，采用木糖或者D-阿拉伯糖为碳源时，得到具备阿拉伯糖醇头部的PEFA，而采用葡萄糖或者L-阿拉伯糖为碳源时，具备两种糖醇头部的PEFA均可以得到。这说明，本申请所述的XY11菌株通过调整碳源，可以实现单一多元醇头部PEFA在胞外的大量积累，不但操作简单，而且产率高。

如前所述制备得到的PEFA在制备纳米胶束中的应用，具体步骤为：取适量PEFA放入水中搅拌至完全分散，所述PEFA在水中的分散浓度不小于7.82mg/L；然后脉冲超声处理15-20min，即得到PEFA纳米胶束。采用不同糖作为碳源培养XY11发酵产生的PEFA自组装制备的纳米胶束，均显示出相似的粒径、PDI和zeta电位。此外，从各种糖发酵培养得到的PEFA的CMC值相对一致，均处于7.64-7.82mg/L间，与现有技术报道的鼠李糖脂(50-200mg/L)和槐脂(9.5mg/L)的CMC值相比，明显降低。这说明，采用XY11菌株生产的PEFA性能稳定，且可以用于制备具有均匀粒度分布的纳米胶束。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了一株沼泽红酵母XY11菌株，所述的XY11菌株结合优化的发酵培养基在10L发酵罐中发酵生产PEFA，粗产物产量高达43.8g/L，且底物转化率高，具有优良的产业应用前景。

(2)本申请所述的XY11菌株利用不同的碳源，实现了单一多元醇头部PEFA的发酵生产，可以作为生产特定糖醇头部PEFA的新型细胞工厂，具有重要的实际应用价值。

(3)采用本申请所述的沼泽红酵母菌株生产的PEFA临界胶束浓度低，可以制备得到粒径均一的纳米胶束，从而使不溶于水的PEFA变成溶于水的PEFA纳米胶束，且具有良好的稳定性。

附图说明

附图1为本发明所述的沼泽红酵母XY11菌株的菌落形态图(附图1A)、细胞形态图(附图1B)和摇瓶发酵图(附图1C)；

附图2为本发明所述的沼泽红酵母XY11菌株的系统发育进化树图；

附图3为实施例3所述的不同碳源的浓度对XY11菌株产量的影响；其中，图3A为葡萄糖碳源、图3B为果糖碳源、图3C为木糖碳源、图3D为L-阿拉伯糖碳源、图3E为D-阿拉伯糖碳源；

附图4为实施例4所述的不同比例的葡萄糖-木糖混合糖液培养对XY11菌株产量的影响；

附图5为实施例5所述的XY11菌株的10升发酵罐培养图；

附图6为实施例6中对XY11菌株发酵得到PEFA的液相分析图；其中，图6A采用葡萄糖为碳源、图6B采用果糖为碳源、图6C采用木糖为碳源、图6D采用L-阿拉伯糖为碳源、图6E采用D-阿拉伯糖为碳源；

附图7为实施例6中对XY11菌株发酵得到PEFA和胞内油GC/MS气相色谱/质谱分析分析图；

附图8为本发明XY11菌株的利用多种碳源合成不同多元醇头部途径图；

附图9为实施例8采用XY11菌株发酵生产的PEFA纳米胶束的丁达尔效应图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：菌株的分离与筛选

将来自南太平洋深海泥样品，接种到50mL液体YPD培养基中(添加25μg/ml氯霉素)，在28℃，180rpm条件富集培养3天。将获得的上述培养液稀释涂布YPD培养基平板，然后置于28℃培养箱中倒置培养3d。将平板上出现的红色单菌落，进行分离纯化，并使用PEFA筛选培养基(葡萄糖100g/L，酵母浸粉1g/L，硫酸铵0.5g/L，磷酸二氢钾7g/L，十二水合磷酸氢二钠2.5g/L，氯化钙0.15g/L，六水氯化铁0.15g/L，七水硫酸锌0.02g/L，一水硫酸锰0.02g/L)进行产PEFA筛选。发酵在28℃和180rpm条件下振荡培养7天，发酵液用乙酸乙酯萃取测定PEFA产量，最终确定XY11菌株为最优菌株。该菌株的菌落、菌体和发酵培养液如图1所示。

实施例2：XY11菌株的鉴定

使用PCR扩增的方法扩增XY11菌株基因组ITS rDNA序列，引物如表1所示。

表1通用PCR引物

PCR产物经测序后，在NCBI网站上进行ITS序列比对，并选取标准菌株构建ITS序列进化树。如图2所示，XY11菌株种属确定为沼泽红酵母菌株(Rhodotorula paludigena)，命名为沼泽红酵母XY11菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021518，保藏日期为2021年5月12日。

实施例3：XY11菌株在不同碳源培养条件下发酵生产PEFA

将产脂肪酸多元醇脂培养基组成进行优化，得到最佳培养基组成为碳源120-140g/L(葡萄糖140g/L、果糖140g/L、木糖120g/L、L-阿拉伯糖140g/L、D-阿拉伯糖140g/L)，蛋白胨1.0g/L，酵母提取物1.0g/L，磷酸二氢钾7.0g/L，磷酸氢二钠0.25g/L，七水硫酸镁0.15g/L。XY11菌株在优化后的产PEFA培养基中摇瓶培养7天，测定PEFA产量、细胞内油脂含量、细胞干重，结果如图3所示。由图3可知，在葡萄糖、果糖、木糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖五种碳源培养条件下，胞外多元醇脂肪酸脂(PEFA)的浓度分别达到23.5g/L、24.8g/L、15.4g/L、3.9g/L、14.8g/L；此外，胞内油含量分别为37.4％、45.2％、26.0％、14.9％、27.6％；细胞干重(生物量)分别为35.6g/L、39.2g/L、16.8g/L、21.8g/L、19.7g/L。这说明，XY11菌株可以用以上五种碳源生产高附加值的PEFA和胞内油脂，而木质纤维素生物质除主要成分葡萄糖、木糖外，还含有少量的阿拉伯糖、果糖等。因此，XY11菌株可以充分利用木质纤维素水解物中的主要单糖，实现低成本木质纤维原料的高附加值利用，具有广阔的应用前景和巨大的商业价值。

实施例4：XY11菌株在不同比例的葡萄糖-木糖混合碳源培养条件下发酵生产PEFA

与实施例3不同的是，将发酵培养基采用的碳源更换为葡萄糖-木糖混合碳源(总糖浓度为140g/L)，利用XY11菌株进行发酵。将葡萄糖与木糖比例分别设置为100％:0、75％:25％、50％:50％、25％:75％、0:100％，并测定得到的PEFA的产量、细胞内油脂含量、细胞干重，结果如图4所示。由图4可知，采用前述葡萄糖-木糖混合碳源的发酵体系，PEFA产量分别为24.5g/L、23.5g/L、20.3g/L、18.0g/L、15.0g/L；胞内油含量分别为39.1％、37.4％、33.4％、29.0％、24.2％；细胞干重分别为34.1g/L、31.6g/L、26.0g/L、20.3g/L、17.3g/L。这说明，采用不同比例的葡萄糖-木糖混合体系作为碳源，XY11菌株均可正常产生PEFA和胞内油脂，但随着木糖含量的增加，XY11总脂质产量呈下降趋势。但是，值得注意的是，当体系中木糖含量不高于25％时，PEFA和胞内油脂的产量与纯葡萄糖作为碳源的体系相比没有明显变化；说明在此条件下XY11菌种具有葡萄糖和木糖高效共代谢的能力(图4)。根据研究报道，不同来源的木质纤维素水解物中，葡萄糖和木糖比例通常高于75％:25％，该比例处于XY11菌株高效共代谢葡萄糖和木糖的比例范围内。综上可知，本申请所述的XY11菌株具有鲁棒性的利用木质纤维素水解液生产高附加值PEFA和胞内油的能力。

实施例5：XY11菌株在10升发酵罐条件下发酵生产PEFA

利用XY11菌株，在10-L发酵罐(BIOQ-6005-6010B，汇和堂生物工程设备(上海)有限公司)中进行PEFA发酵生产。将在固体YPD平板上活化的XY11单菌落接种到两支含有5mL液体YPD培养基的试管中，28℃、180rpm振荡培养16h，将菌液分别转接到两瓶含350mL液体YPD培养基的锥形瓶中，28℃、180rpm振荡培养24h，将种子液接种到发酵罐中，发酵培养基配方为葡萄糖140g/L，蛋白胨1.0g/L，酵母提取物1.0g/L，磷酸二氢钾7.0g/L，磷酸氢二钠0.25g/L，七水硫酸镁0.15g/L，总体积7升。控制发酵温度28℃，通气量600L/h，搅拌速率350rpm，在整个发酵过程中，每隔12h采集50.0mL培养液，测定PEFA产量、细胞内油脂含量、细胞干重、残余糖量，结果如图5所示。由图5可知，在7天时，添加的葡萄糖基本消耗完，PEFA产量达到最高值43.8g/L，生物量为41.9g/L，胞内油脂含量为38.8％。

与实施例3的摇瓶培养相比，10L发酵罐培养的产量更高。这是由于发酵罐具备更优的通气和搅拌效果。由此可知，本申请所述的沼泽红酵母XY11菌株，PEFA产量远高于现有技术中的产PEFA菌株，应用前景广阔。

实施例6：PEFA结构的表征与分析

(1)PEFA亲水多元醇头部的HPLC分析

将实施例3制备得到的PEFA纯化后，在80℃下用2mol/L KOH水解，用氯仿萃取去除生成的脂肪酸，水相样品利用Thermo UltiMate 3000系统和Asahipak NH2P-50 4E色谱柱进行HPLC分析，从Sigma-Aldrich购买的木糖醇、甘露醇和阿拉伯糖醇作为标准品，结果如图6所示。由图6可知，通过样品出峰时间与标准品比对，确定葡萄糖或L-阿拉伯糖上生长的XY11菌株产生了阿拉伯醇和甘露醇头部的PEFA混合物，其中占主要成分的为阿拉伯醇头部的PEFA。同时，该结果表明，XY11还能够生产单一多元醇头部的纯PEFA，具体为：以木糖或D-阿拉伯糖为碳源，XY11只产生阿拉伯糖醇头部的PEFA，而果糖下生长的XY11只产生甘露醇型PEFA。这说明，仅通过调整碳源，XY11菌株可以用于单一多元醇头部纯的PEFA生产，省略了纯化PEFA的复杂步骤，这对于后续的应用具有重要的意义。

(2)PEFA脂肪酸的气相色谱/质谱分析

将纯化后的PEFA和胞内油进行甲酯化，然后对其脂肪酸组成进行气相色谱/质谱(GC/MS)测定，结果如图7所示。由图7可知，(1)超过80％的细胞内脂肪酸为C16:0、C18:0、C18-1和C18:2；而C16-18正是生物柴油的主要组分，因此采用XY11菌株生产的胞内油，克服了第一代生物柴油以植物油为原料的关键瓶颈，有望成为高质量生物柴油生产潜在原料，具有重要的实际应用价值。(2)分泌到细胞外的PEFA主要由羟基脂肪酸组成，即3-OH-C14:0、3-OH-C16:0和3-OH-C18:0。这说明，本申请采用沼泽红酵母XY11菌株发酵生产得到的产物是多元醇脂肪酸脂(PEFA)。PEFA的主要组分——羟基脂肪酸，因其可聚合性和多种生物活性，如抗菌、抗炎和抗癌，在化学、食品、化妆品和医疗领域有着广泛的应用。因此，利用XY11菌株生产羟基脂肪酸有工业化前景。

综合HPLC结果和GC/MS结果可知，本申请所述的XY11菌株利用不同碳源生产的PEFA，其多元醇头部具有特异性，而脂肪酸分布相似。

实施例7：PEFA利用多种碳源合成多元醇头部途径的确定

XY11菌株中主要有4条途径参与了甘露醇与阿拉伯糖醇头部的生物合成，即糖酵解、果糖和甘露糖代谢、戊糖磷酸途径、戊糖相互转换途径。为了探究实施例3得到的PEFA不同糖醇头部的合成途径，发明人根据XY11的基因组数据，通过荧光定量PCR分析了关键基因的转录水平，引物如表2所示，不同碳源底物利用途径中基因的表达水平如表3所示。由表3可知，以葡萄糖和L-阿拉伯糖为碳源，用于甘露醇合成的M1PASE和MPDH基因以及用于阿拉伯糖醇合成的戊糖磷酸途径和戊糖互变途径的基因均具有较高表达量，因此在如上所述两种碳源条件下生产的PEFA中同时存在阿拉伯糖醇和甘露醇。相比之下，当木糖或D-阿拉伯糖用作碳源时，未观察到M1PASE和MPDH的表达，因而仅产生阿拉伯糖醇。以果糖为碳源，合成甘露醇的关键基因MtDH表现出较高的表达水平，而参与阿拉伯糖醇合成的ARDH和ARD1基因未检测到表达量，因此果糖培养条件下生产的PEFA中只存在甘露醇头部。这也与实施例6中HPLC分析的检测结果一致。XY11利用五种单糖合成阿拉伯糖醇和甘露醇的代谢途径结果如图8所示。这些结果表明，XY11菌株可以利用不同碳源，通过转录水平上的调控，来影响PEFA的多元醇头部类型。

综上可知，本申请所述的沼泽红酵母菌株发酵培养PEFA，为代谢途径改造提供理论指导，同时为仅含一种糖醇头部的纯PEFA的生物合成提供新的策略，这对于理论研究和产业应用都具有重要的意义。

表2.XY11中多元醇合成关键基因的荧光定量PCR引物

/>

表3.不同碳源底物利用途径中基因的表达水平

/>

实施例8：PEFA纳米胶束的制备与表征

将溶于去离子水中的1mg/ml PEFA超声波处理15分钟，并稀释至0.5-100mg/L的一系列浓度。然后使用基于芘荧光分析的荧光探针技术，测定PEFA的临界胶束浓度(CMC)。采用葡萄糖、果糖、木糖、D-阿拉伯糖和L-阿拉伯糖碳源培养，得到的产物PEFA的临界胶束浓度分别为7.69mg/mL、7.82mg/mL、7.74mg/mL、7.71mg/mL和7.64mg/mL；低于现有技术中的鼠李糖脂(50至200mg/L)和槐脂4(9.5mg/L)的CMC值。这表明，采用XY11菌株发酵生产得到的PEFA具有较低的临界胶束浓度，可以在较低的浓度下形成胶束。然后，用Zetasizer NanoZS 90测量前述胶束的粒径、多分散度指数(PDI)和zeta电位(ζ)，结果如表4所示。

根据表4可知，采用葡萄糖、木糖、果糖、D-阿拉伯糖和L-阿拉伯糖为碳源得到的PEFA自组装的胶束，(1)粒径分别为128.93±0.65nm，151.23±2.79nm，143.17±1.63nm，128.00±4.31nm和137.73±2.63nm，说明PEFA胶束一步自组装制备的胶束为纳米尺度；(2)聚合物分散指数PDI分别为0.37±0.01，0.23±0.00，0.23±0.01，0,21±0.01，0,21±0.01，说明胶束的粒径较均一；(3)zeta电位分别为-28.07±0.47mV，-23.73±0.40mV，-28.73±0.70mV，-26.13±0.51mV和-22.70±0.46mV，说明胶束表面带负电荷，稳定性较好。

表4.不同碳源条件下培养XY11产生的不同PEFA制备纳米胶束的临界胶束浓度(CMC)、粒径、聚合物分散性指数(PDI)和zeta电位

此外，前述纳米胶束均能形成丁达尔效应，如图9所示，再次验证了其纳米胶束的形成。这说明，PEFA不仅可以作为高效的生物表面活性剂，其两亲性也可能使其在制备自组装功能胶束和医学领域具有潜在应用。因此，XY11菌株特异性生产单一多元醇头部PEFA的能力，且基于PEFA纳米胶束的形成，将进一步扩大该菌株在医学领域的应用。

综上可知，本申请所述的沼泽红酵母XY11菌株，与现有技术相比，不但大大提高了发酵生产PEFA的产量，而且在一定条件下能够实现单一多元醇头部PEFA的发酵生产，具有重要的应用前景。此外，采用本申请所述的沼泽红酵母菌株生产的PEFA还具备相对一致、较低的CMC值，且形成的PEFA纳米胶束的粒径较均一，胶束表面带负电荷，稳定性较好，进一步扩大了XY11菌株的应用领域。