基于广义理查德森-露西算法的荧光分子空间和角度分布重建方法

技术领域

本发明属于偏振荧光显微成像技术领域，具体涉及一种基于广义理查德森-露西算法的荧光分子空间和角度分布重建方法。

背景技术

绝大多数荧光分子可以看做偶极子，具有不同的朝向，同一位置数个任意朝向的荧光分子可以看做一个荧光团，对于荧光团来说，它具有空间位置、不同朝向强度等特性，即空间和角度分布。偏振荧光显微镜(Polarized fluorescence microscopy，PFM)是在生物领域中强有力的成像技术，使用荧光蛋白标记或者生物样本内部特定蛋白，生物样本可以在不同偏振光激发下发出不同强度的荧光，该强度与蛋白分子的空间和角度分布紧密相关，从而可以反映生物样本的特定属性，它的应用范围从单细胞成像延伸至大组织成像。偏振荧光显微镜具有亚微米空间分辨率、高对比度和分子方向敏感性，我们可以采集不同偏振激发模式下的显微图像进行间接观察，但为了直接探索生物样本的结构和功能，需要从这些图像中恢复荧光分子的三维空间和角度分布；此外，固有的模糊和噪声会降低荧光数据，这些都会影响研究者对真实生物样本的认知，但是只要该成像系统的前向投影过程能够被描述，那么可以通过线性逆问题求解算法对样品信息进行恢复，重建出样本的空间和角度分布。

目前，应用在偏振荧光显微镜中的荧光分子三维空间和角度分布重建算法主要是基于奇异值分解(SVD)的最小二乘法算法[Richard W.Hendler,RichardI.Shrager.Deconvolutions based on singular value decomposition and thepseudoinverse:a guide for beginners.Journal of Biochemical and BiophysicalMethods,Volume 28,Issue 1,1994]，尽管该方法在统计上被证明是对不相关高斯噪声破坏的数据的最大似然估计量，但是奇异值分解得到的小特征值会在运算中将噪声放大到不可接受的水平，一般需要通过在优化问题中添加吉洪诺夫(Tikhonov)正则化项来抑制[Fuhry,M.,Reichel,L.A new Tikhonov regularization method.Numer Algor 59,433–445(2012)]；这带来的问题是，会给最终的重建结果整体引入一个偏差，表现为在角度分布上朝某一方向偏移，在空间分布上分辨率降低，此外需要大量的尝试去手动挑选一个合理的正则化参数。

因此，如何在抑制噪声的情况下，提高重建结果在空间和角度分布的分辨率与准确性，并尽可能减少手动调整参数的次数，同时保持能够接受的运算成本，是本领域研究的热点。

发明内容

鉴于上述，本发明提供了一种基于广义理查德森-露西算法的荧光分子空间和角度分布重建方法，能够在抑制噪声的情况下，提高重建结果在空间的分辨率和角度分布的准确性，并且只需要预先粗略地设置一个迭代次数，无需另外多次手动调参，同时将角度分布原本在球面域的复杂运算转到简单的球谐域来实施，保证了合理的运算成本。

一种基于广义理查德森-露西算法的荧光分子空间和角度分布重建方法，包括如下步骤：

(1)在偏振荧光显微镜系统中，对于每个视角，利用数个不同偏振态的激发光对荧光标记的生物样本进行荧光激发，并通过探测物镜进行数据采集，得到每个视角下每个偏振激发模式对应的生物样本图像数据；

(2)通过模拟得到每个视角下每个偏振激发模式对应的偶极子点扩散函数，然后对偶极子点扩散函数进行整体归一化处理，并计算带有物空间敏感常数的反投影算子；

(3)对采集得到的生物样本图像数据进行预处理；

(4)使表征激发模式的偏振态域与表征角度分布的球面域引入理查德森-露西算法，并将原本应在空域和球面域进行的运算转换到频域和球谐域来实施，从而迭代估计出生物样本的空间角度分布。

进一步地，所述视角数量以及偏振激发模式数量为单个或多个。

进一步地，所述步骤(1)中采集得到的生物样本图像数据为体积图像，其由二维切片图像堆叠得到；每个视角及偏振激发模式对应的偶极子点扩展函数具有三个空间维度加上一个球面维度，共四维矩阵结构。

进一步地，所述偏振荧光显微镜系统的成像方程如下：

其中：g

进一步地，所述步骤(2)中反投影算子的计算表达式如下：

其中：

进一步地，所述步骤(4)中对于某一视角v，则通过以下表达式迭代估计生物样本的空间角度分布；

其中：e

进一步地，前投影运算

其中：

进一步地，为了减小计算代价，将所述步骤(4)迭代过程中涉及的四种运算包括前投影、反投影、球面域乘法、球面域除法分别改写为：

其中：

进一步地，所述Gaunt系数

其中：

进一步地，对于生物样本的空间角度分布估计初值e

本发明通过在传统理查德森-露西算法引入激发模式和角度分布两个维度，使得通过偏振荧光显微镜能够对荧光分子空间和角度分布进行更好的重建，无需为了抑制噪声而引入会带来估计偏差的正则化项。此外，改进后的查德森-露西算法本身的运算都是基于球面域，本发明设计了基于球谐域的运算过程，大大减少了前后投影和球面域乘除法的计算量。

总的来说，本发明设计了从偏振荧光显微数据中重建荧光分子空间和角度分布的广义理查德森-露西算法，以合理的计算代价，更好地抑制了噪声，提高了重建结果的空间分辨率和角度分布准确性，并且解决了现有方法中多次手动调整参数繁琐的问题。

附图说明

图1为本发明基于广义理查德森-露西算法的荧光分子空间和角度分布重建方法的流程示意图。

图2(a)为对仿真数据添加不同水平的泊松噪声后使用本发明重建时每次迭代结果的空间分布与真实值的结构相似度变化曲线图，同时与使用了最优正则化项参数的基于SVD的最小二乘法进行对比。

图2(b)为对仿真数据添加不同水平的泊松噪声后使用本发明重建时每次迭代结果的角度分布峰值方向与真实值的角度之差的平均余弦值变化曲线图，同时与使用了最优正则化项参数的基于SVD的最小二乘法进行对比。

图3(a)为对巨型单层囊泡(GUV)样品偏振荧光显微数据部分区域三维重建结果的角分布峰值方向图，第1行和第2行分别是本发明进行10次迭代的重建结果和使用基于SVD的最小二乘法重建结果在不同视角的观察图，第1～4列对应4个观察视角。

图3(b)为对巨型单层囊泡样品偏振荧光显微数据部分区域三维重建结果的空间分布图，第1行和第2行分别是本发明进行10次迭代的重建结果和使用基于SVD的最小二乘法重建结果在z轴位置的切片图，第3行为两种方法重建结果沿着上图划线位置的轮廓图，第1～2列对应为两组切片。

具体实施方式

为了更为具体地描述本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。

偏振荧光显微镜的激发光路发出某一偏振态的激光，照射被荧光蛋白标记或者自身具有荧光蛋白的生物样本使其发出荧光，显微镜的信号采集光路进行荧光数据的采集，不断移动采集光路的焦平面，使整个生物样本的信号被遍历，将每次采集到的图像堆叠，形成三维的体积图像。对于多视角、多偏振激发模式的数据，调整荧光显微镜激发方向或者旋转样本以及激发光的偏振模式，采集多组体积数据，得到多视角、多偏振激发模式的生物样本数据。

如图1所示，本发明基于广义理查德森-露西算法的荧光分子空间和角度分布重建方法，包括如下步骤：

S1.计算系统矩阵，包括偶极子点扩散函数和反投影算子。通过模拟为每个视角v、偏振激发模式p生成偶极子点扩展函数h

将它们以多维矩阵形式保存，以备后续数据处理。

S2.由于采集得到的图像所参考的坐标系不一致，首先要进行预处理，选择一个视角、偏振激发模式作为参考，对其他视角、激发模式获得的数据进行线性插值并进行一定角度的旋转，使它们具有相应的坐标系。此时得到的是粗配准的图像，为了更准确的图像融合，采用基于强度的配准方法生成配准矩阵，将每个视角、激发模式的数据乘以相应的配准矩阵，得到配准好的多视角、多偏振激发模式图像数据。

S3.使用引入表征激发模式的偏振态域与表征角度分布的球面域的广义理查德森-露西算法进行迭代计算，在每次迭代中的得到相应的荧光分子空间角度分布重建估计结果：

将原本定义在空域和球面域进行的运算，转换到频域和球谐域来实施计算，将前投影、后投影、球面域乘法、球面域除法变为：

迭代估计出生物样本的空间和角度分布。

S4.判断是否满足迭代停止条件，即是否达到了预计的迭代次数，不满足该条件则执行步骤S3，满足则迭代停止，将最后一次迭代得到的空间角度分布估计结果作为最后的重建结果。

我们以单视角、多个偏振激发模式下获得的数据重建为例，对引入表征激发模式的偏振态域与表征角度分布的球面域的广义理查德森-露西算法进行具体介绍。传统的单视角理查德森-露西算法具有以下迭代结构：

e

for k＝0，1，2，...，N

end

本发明将表征激发模式的偏振态域与表征角度分布的球面域引入上式中，提出了以下新的迭代公式：

e

for k＝0，1，2，...，N

end

前、后向投影操作定义为：

关于反投影算子，传统理查德森-露西算法中是将点扩散函数进行翻转生成的，但是这里引入了更多的维度，前、后向投影过程中两侧的域空间是不一致的，这将导致迭代的迅速发散，因此在反投影算子中引入了物空间敏感常数，最终的反投影算子

由于在计算过程中，球面域维度

因此，本发明将迭代结构中各运算符的定义改写成：

类似的，对于多视角、每个视角下有数个偏振激发模式获得的数据，反投影算子为：

加法迭代重建公式为：

e

for k＝0，1，2，...，N

……

end

乘法迭代重建公式为：

for k＝0，1，2，...，N

……

end

以下我们采用模拟数据来验证本发明的有效性，随机生成了一个具有一定空间和角度分布的体模，使用偶极子点扩散函数进行前向投影来模拟偏振荧光显微镜的激发和采集过程，获得了一组仿真数据。对仿真数据添加不同水平(SNR＝30dB和5dB)的泊松噪声后，使用本发明进行重建，记录每次迭代后的结果，并且均与使用了最优正则化项参数的基于SVD的最小二乘法进行对比；图2(a)绘制的是重建结果空间分布与真值的差距，用结构相似度指标表征，图2(b)绘制的是重建结果角度分布峰值方向与真值之间的差距，用角度之差的平均余弦值表征；它们共同说明了本发明的重建结果远远好于使用手动对基于SVD的最小二乘法调参能获得的最佳结果，尤其是重建结果角度分布峰值方向，有着非常大的准确性提升，并且对噪声是不敏感的。

此外，我们使用巨型单层囊泡样品实验数据来进一步验证本发明的有效性，巨型单层囊泡是生物偏振荧光成像中常用的生物样本，根据目前的生物学认知，其囊泡膜上的荧光分子角分布峰值方向为垂直于膜表面切向，数据通过偏振双视角倒置光片荧光显微镜(pol-diSPIM)采集得到。

将使用本发明基于广义理查德森-露西算法的荧光分子空间角度分布重建方法与传统的基于SVD的最小二乘算法重建结果做比较，前者的迭代次数设为10次，后者的正则化项参数经过多次尝试后设定为1，二者对相同数据进行处理，并展示处理结果的角度分布峰值方向在不同视角下的观察图，以及处理结果的空间分布在不同深度处的切片图。

从图3(a)可以直观地看出，在荧光分子角度分布方面，基于本发明基于广义理查德森-露西算法的重建算法与传统基于SVD的最小二乘算法的结果相比，我们的改进方法可以得到更加准确、符合生物学认知的样本荧光分子角度分布，具体的提升在于，角度分布峰值方向都近乎垂直于囊泡膜，整体变化更加连续，并且在感兴趣区域有着更高的信噪和更好的区分度。

从图3(b)可以直观地看出，在荧光分子空间分布方面，基于本发明基于广义理查德森-露西算法的重建算法与传统基于SVD的最小二乘算法的结果相比，我们的改进方法可以获得更高分辨率和噪声的荧光分子空间分布，具体的提升在于，降低了空间分布的模糊程度，使得样本一些固有结构能够清晰可辨，整体提高了分辨率和信噪比。

上述对实施例的描述是为便于本技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对上述实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。