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显示副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白的自组装蛋白纳米结构及其用途

文献发布时间：2023-06-19 19:28:50

交叉引用

本申请是申请号为201880023734.8的中国专利申请的分案申请，其通过引用整体并入本文。

背景技术

蛋白的分子自组装和共组装成高度有序、对称的超分子复合物是一种在原子尺度上构图物质的优雅而强大的手段。近年来，自组装生物材料(特别是由核酸组成的自组装生物材料)的开发已经取得了进展。DNA已用于创建例如纳米级形状和图案、分子容器和三维宏观晶体。设计自组装蛋白的方法进展较慢，但蛋白的功能和物理特性使其成为开发高级功能材料的组成部分而具有吸引力。

发明内容

本发明的一方面，提供了纳米结构，其包含：

(a)多个第一组件，每个第一组件包含多个相同的第一多肽；

(b)多个第二组件，每个第二组件包含多个相同的第二多肽，其中所述第二多肽不同于所述第一多肽；

其中，多个第一组件与多个第二组件非共价地相互作用以形成纳米结构；并且

其中，所述纳米结构在所述纳米结构的外部上显示一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段的多个拷贝。

在一个实施方式中，(a)所述第一多肽包含沿其全长与选自由SEQ ID NO：1-51组成的组中的多肽的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；并且

(b)所述第二多肽包含沿其全长与选自由SEQ ID NO：1-51组成的组中的多肽的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。

在另一个实施方式中，一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段包含沿其全长与选自由SEQ ID NO：53、61-68和101组成的组中的多肽的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。

在各种实施方式中：

(a)所述第一多肽包含沿其全长与氨基酸序列T33-31A(SEQ ID NO：51)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，并且所述第二多肽包含沿其全长与氨基酸序列T33-09B/T33-31B(SEQ ID NO：44)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；

(b)所述第一多肽包含沿其全长与氨基酸序列T33-15B(SEQ ID NO：46)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，并且所述第二多肽包含沿其全长与氨基酸序列T33-15A(SEQ ID NO：45)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；

(c)所述第一多肽沿其全长与选自由I53-50A(SEQ ID NO：7)、I53-50A.1(SEQ IDNO：29)、I53-50A.1NegT2(SEQ ID NO：30)和I53-50A.1PosT1(SEQ ID NO：31)组成的组中的多肽的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且所述第二多肽沿其全长与选自由I53-50B(SEQ IDNO：8)、I53-50B.1(SEQ ID NO：32)、I53-50B.1NegT2(SEQ ID NO：33)和I53-50B.4PosT1(SEQ ID NO：34)组成的组中的多肽的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；或者

(d)所述第一多肽包含沿其全长与氨基酸序列I32-28A(SEQ ID NO：21)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，并且所述第二多肽包含沿其全长与氨基酸序列I32-28B(SEQ ID NO：22)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。

在一个实施方式中，将一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段表达为与所述第一多肽的融合蛋白。在一个这样的实施方式中，多个第一组件各自包含相同的所述第一多肽；在另一个这样的实施方式中，多个第一组件总共包含两种或更多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段。在另一个实施方式中，仅所述第一多肽的子集包含具有F蛋白或其抗原片段的融合蛋白。在另一个实施方式中，每个第一组件包含所述第一多肽的同源三聚体。

在另一个实施方式中，所述融合蛋白包含位于所述第一多肽与副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段之间的氨基酸接头。在一个这样的实施方式中，所述融合蛋白包含位于所述第一多肽与副粘病毒F蛋白或其抗原片段之间的氨基酸接头。

在一个实施方式中，氨基酸接头序列包含一个或多个三聚化结构域；在另一个实施方式中，氨基酸接头序列包含Gly-Ser接头。

在各种实施方式中，所述第一多肽包含或者由沿其全长与选自由DS-Cav1-折叠子-T33-31A(SEQ ID NO：69)、DS-Cav1-T33-31A(SEQ ID NO：70)、DS-Cav1-折叠子-T33-15B(SEQ ID NO：71)、DS -Cav1-T33-15B(SEQ ID NO：72)、DS-Cav1-折叠子-I53-50A(SEQ IDNO：73)、DS-Cav1-I53-50A(SEQ ID NO：74)和DS-Cav1 -I32-28A(SEQ ID NO：75)组成的组中的多肽的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽组成。

在其它实施方式中，

(a)当每个第一多肽沿其全长与氨基酸序列DS-Cav1-折叠子-T33-31A(SEQ IDNO：69)或DS-Cav1-T33-31A(SEQ ID NO：70)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性时，每个第二多肽沿其全长与氨基酸序列T33-31B(SEQ ID NO：44)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；

(b)当每个第一多肽沿其全长与氨基酸序列DS-Cav1-折叠子-T33-15B(SEQ IDNO：71)或DS-Cav1-T33-15B(SEQ ID NO：72)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性时，每个第二多肽沿其全长与氨基酸序列T33-15A(SEQ ID NO：45)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；

(c)当每个第一多肽沿其全长与氨基酸序列DS-Cav1-折叠子-I53-50A(SEQ IDNO：73)或DS-Cav1-I53-50A(SEQ ID NO：74)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性时，每个第二多肽沿其全长与选自由I53-50B(SEQ ID NO：8)、I53-50B.1(SEQ ID NO：32)、I53-50B.1NegT2(SEQ ID NO：33)或I53-50B.4PosT1(SEQ ID NO：34)组成的组中的多肽的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；或者

(d)当每个第一多肽沿其全长与氨基酸序列DS-Cav1-I32-28A(SEQ ID NO：75)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性时，每个第二多肽沿其全长与氨基酸序列I32-28B具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

在一个实施方式中，一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段包含沿其全长与氨基酸序列DS-Cav1(SEQ ID NO：53)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一个这样的实施方式中，每个第一多肽包含通过氨基酸接头将沿其全长与氨基酸序列DS-Cav1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽与沿其全长与氨基酸序列 SEQ ID NO：7(I53-50A)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽连接的融合多肽。在另一个实施方式中，所述氨基酸接头包含Gly-Ser接头。在另一个实施方式中，每个融合蛋白包含沿其全长与选自由SEQ ID NO：69-100组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一个特定实施方式中，每个融合蛋白包含沿其全长与氨基酸序列SEQ ID NO：76(F10)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在其它实施方式中，每个第二个多肽包含沿其全长与选自由I53-50B(SEQ ID NO：8)、I53-50B.1(SEQ ID NO：32)、I53-50B.1NegT2(SEQ ID NO：33)或I53-50B.4PosT1(SEQ ID NO：34)组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一个特定实施方式中，每个第二个多肽包含沿其全长与氨基酸序列I53-50B.4PosT1(SEQ ID NO：34)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。

在其它方面，提供了表达第一多肽融合体的重组表达核酸，包含与启动子连接的重组核酸的重组表达载体以及包含重组表达载体的重组宿主细胞。

还提供了包含本文所公开的任何实施方式或实施方式组合的纳米结构和药学上可接受的载体的免疫原性组合物。在一个实施方式中，该免疫原性组合物可以进一步包含佐剂。

在其它方面，提供了用于在受试者中产生对RSV F蛋白免疫应答或用于治疗或限制受试者RSV感染的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所公开实施方式或实施方式组合的纳米结构或免疫原性组合物以产生免疫应答或治疗或预防受试者的RSV感染。

还提供了组装本文所公开的任何实施方式或实施方式组合的纳米结构的工艺，其包括在水性条件下将两种或更多种纳米结构组分混合以驱动所需纳米结构的自发组装。

附图说明

当结合附图时，通过参考下面的详细描述，随着对本发明的前述方面和许多附带优点的更好理解，它们将变得更容易地理解。

图1显示了通过体外组装产生带有抗原的纳米结构的示意图。单独地表达和纯化给定纳米结构的两个组分或组成部分，这允许通过在体外混合纯化的组分来启动纳米结构的组装，此过程称为体外组装。在一些实施方式中，可以在不同的表达宿主(例如人HEK293F细胞或细菌大肠杆菌细胞)中表达纳米结构的两组分。该图示意性地描绘了通过体外组装在HEK293F细胞中产生的抗原-纳米结构三聚体融合蛋白和在大肠杆菌中产生的纳米结构五聚体蛋白来组装带有20个三聚体抗原(60个抗原亚基)的120个亚基纳米结构。

图2显示了说明在组织培养上清液中检测到分泌的DS-Cav1、DS-Cav1-折叠子-T33-31A和DS-Cav1-T33-31A融合蛋白的图。对表达DS-Cav1(上)、DS-Cav-1-折叠子-T33-31A/T33-31B(左下)和DS-Cav-1-T33-31A/T33-31B(右下)的细胞的组织培养上清液进行ELISA测定。结合RSV F的四种不同单克隆抗体用于评估上清液中DS-Cav1或DS-Cav1融合蛋白的存在。该结果证实了包含折叠良好的RSV F抗原的蛋白的分泌。

图3显示了DS-Cav1-I53-50A的尺寸排阻色谱。将通过固定的金属亲和色谱从组织培养上清液中纯化的蛋白施加于Superose

图4显示了体外组装的DS-Cav1-I53-50纳米结构的尺寸排阻色谱。将纯化的DS-Cav1-I53-50A和I53-50B.4PT1蛋白以大约1：1的摩尔比混合，在4℃下温育过夜，然后施加于Sephacryl S-500 16/60HR尺寸排阻色谱柱。将组装的纳米结构以约65mL的单个单分散峰洗脱，而将多余的DS-Cav1-I53-50A三聚体组分以约90mL洗脱。

图5显示了在体外组装的DS-Cav1-I53-50纳米结构的负染色电子显微照片和二维类别平均值。通过尺寸排阻色谱纯化的体外组装的DS-Cav1-I53-50纳米结构通过负染色电子显微镜成像(上)。平均许多纳米结构会产生二维类别平均值(底部)，表明了该纳米结构的I53-50部分是高度有序且一致的，而所显示抗原的精确三维位置由于DS-Cav1-I53-50A融合蛋白的DS-Cav1和I53-50A结构域之间的接头的柔性性质而略有不同。

图6显示了描绘DS-Cav1-I53-50纳米结构的抗原性的一系列图。使用四种RSV F特异性单克隆抗体(包括融合前特异性抗体MPE8，D25和RSD5)通过ELISA(A)分析纯化的DS-Cav1-I53-50纳米结构，表明了当在DS-Cav1-I53-50纳米结构上多价态地显示时，DS-Cav1抗原正确折叠并保持在融合前状态。通过使用多种RSV F特异性抗体(B-C)进行表面等离振子共振测量证实了该发现，当与三聚体DS-Cav1相比时，这进一步暗示了DS-Cav1的多价态显示会导致亲和力效应，从而降低抗体的解离速率。

图7是描绘来自用DS-Cav1-I53-50纳米结构免疫的小鼠的DS-Cav1特异性血清抗体滴度的图。用缺乏额外抗原的I53-50纳米结构、三聚体DS-Cav1或带有DS-Cav1抗原的I53-50纳米结构以33％、66％或100％的价态免疫小鼠组。通过ELISA在涂覆有DS-Cav1的平板上测定DS-Cav1特异性血清抗体滴度。将每只鼠的血清抗体滴度绘制为圆圈，将每组内的几何平均值绘制为水平线。

图8是描绘通过用DS-Cav1-I53-50纳米结构免疫而引发的血清中和活性的图。用缺乏额外抗原的I53-50纳米结构、三聚体DS-Cav1或带有DS-Cav1抗原的I53-50纳米结构以33％、66％或100％的价态免疫小鼠组。将每只鼠的中和滴度绘制为圆圈，将每组内的几何平均值绘制为水平线。

图9是描绘通过用DS-Cav1-折叠子I53-50纳米结构免疫而引发的灵长类动物免疫系统的免疫原性的图。在第0周和第4周向恒河猕猴注射以100％价态DS-Cav1显示的游离DS-Cav1三聚体或DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构。在这两种情况下，DS-Cav1抗原的剂量均为50μg，并用MF59类角鲨烯基水包油乳液佐剂SWE配制免疫原。评估在第6周和第16周时从动物获得的血清的抗DS-Cav1抗体滴度(A)和RSV中和抗体滴度(B)。

图10是描绘当融合至I53-50A时和/或进一步组装成二十面体纳米结构时的DS-Cav1的物理稳定性的图。将含有等价浓度DS-Cav1的三聚体DS-Cav1、三聚体DS-Cav1-I53-50A和DS-Cav1-I53-50纳米结构的样品分为四个等分试样，并在20、50、70或80℃下温育1小时。冷却至室温后，通过表面等离子体共振(SPR)测定D25结合。

图11是描绘纳米结构的物理稳定性的图。使用通过固有的色氨酸荧光监测盐酸胍(GdnHCl)中的化学变性作为第二种独立于抗体的技术来评估三聚体DS-Cav1(A-B)、DS-Cav1-折叠子-I53-50A(C-D)、DS-Cav1-折叠子-I53-50(E-F)、I53-50(G-H)和I53-50A(I-J)的物理稳定性。当与I53-50A纳米结构组分基因融合时，该数据表明了DS-Cav1抗原具有优越的物理稳定性。

具体实施方式

引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。在本申请中，除非另有说明，否则所利用的技术可以在以下几个众所周知的参考文献中找到，例如：Molecular Cloning: ALaboratory Manual (Sambrook等人, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Gene Expression Technology (Methods in Enzymology,Vol. 185, 由D. Goeddel编辑,1991. Academic Press, San Diego, CA)，“Guide to Protein Purification” inMethods in Enzymology (M.P. Deutshcer编辑, (1990)Academic Press, Inc.)；PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications (Innis,等人1990.AcademicPress, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique,第二次编辑. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY)，Gene Transfer andExpression Protocols, pp. 109-128, 编辑E.J. Murray, The Humana Press Inc.,Clifton, N.J.)和the Ambion 1998Catalog (Ambion, Austin, TX)。

如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数指示物。除非另有明确陈述，否则本文所用的“和”可与“或”互换使用。

如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。

如本文所用，“约”是指所述参数的+/-5％。

除非上下文另有明确说明，否则可以组合使用本发明的任何方面的所有实施方式。

除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，“包括”、“包含”等词语应理解为与排他性或穷举性相反的包括性含义；也就是说，为“包括但不限于”的含义。使用单数或复数的词语也分别包括复数和单数。另外，当在本申请中使用时，词语“本文”，“上文”和“下文”以及类似含义的词语应整体上指本申请，而不是本申请的任何特定部分。

本公开实施方式的描述并非旨在穷举或将本公开限制为所公开的精确形式。尽管出于说明性目的本文描述了本公开的特定实施方式和22示例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开范围内可能进行各种等价修饰。

在第一方面，本公开提供了纳米结构，其包含：

(a)多个第一组件，每个第一组件包含多个相同的第一多肽；

(b)多个第二组件，每个第二组件包含多个相同的第二多肽，其中所述第二多肽不同于所述第一多肽；

其中，多个第一组件与多个第二组件非共价地相互作用以形成纳米结构；并且

其中，所述纳米结构在所述纳米结构的外部上显示一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段的多个拷贝。

本文公开了自组装多肽纳米结构，其在纳米结构外部上多价地显示副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白。第一多肽和第二多肽对的多个拷贝能够自组装以形成纳米结构，例如二十面体纳米结构。纳米结构包括对称重复、非天然、非共价多肽-多肽界面，该界面将第一组件和第二组件定向为纳米结构，例如具有二十面体对称性的纳米结构。

本发明的纳米结构是合成的，因为它们不是天然存在的。第一多肽和第二多肽是非天然存在的蛋白，其可以通过任何合适的手段产生，其包括重组产生或化学合成。多个第一多肽的每个成员彼此相同(尽管当第一多肽作为与一个或多个副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段的融合多肽存在时，F蛋白或其抗原片段可以因第一多肽不同而不同)，并且多个第二多肽的每个成员彼此相同。第一蛋白和第二蛋白不同。对于第一多肽和第二多肽没有特定的一级氨基酸序列要求。美国公开的专利申请20160122392和公开的PCT申请WO2014/124301描述了设计合成纳米结构的方法，其中所述纳米结构不依赖于第一多肽和第二多肽特定的一级氨基酸序列。

多个(2、3、4、5、6或更多个)第一多肽自组装以形成第一组件，并且多个(2、3、4、5、6或更多个)第二多肽自组装以形成第二组件。然后，多个第一组件和第二组件通过设计的界面非共价地自组装以产生纳米结构。

第一组件中的第一多肽的数量可以与第二组件中的第二多肽的数量相同或不同。在一个示例性的实施方式中，第一组件包含第一多肽的三聚体，且第二组件包含第二多肽的二聚体。在另一个示例性的实施方式中，第一组件包含第一多肽的三聚体，且第二组件包含第二多肽的三聚体。在另一个示例性的实施方式中，第一组件包含第一多肽的三聚体，且第二组件包含第二多肽的五聚体。

为了所得纳米结构的给定目的，第一多肽和第二多肽可以具有任何合适的长度。在一个实施方式中，所述第一多肽和第二多肽的长度通常在30-250个氨基酸之间；所述第一多肽和第二多肽的长度可以相同或不同。在各种其它实施方式中，所述第一多肽和第二多肽的长度在30-225、30-200、30-175、50-250、50-225、50-200、50-175、75-250、75-225、75-200、75-175、100-250、100- 225、100-200、100-175、125-250、125-225、125-200、125-175、150-250、150-225、150-200和150-175个氨基酸之间。

为了使其具有成对自组装以形成纳米结构(例如二十面体纳米结构)的能力而设计SEQ ID NO：1-51的分离多肽。该设计涉及为多肽对的每个成员设计合适的界面残基，该多肽对可以被组装以形成纳米结构。如此形成的纳米结构形成包括对称重复、非天然、非共价多肽-多肽界面，该界面将第一组件和第二组件定向为纳米结构，例如具有二十面体对称性的纳米结构。因此，在一个实施方式中，第一多肽和第二多肽选自由SEQ ID NO：1-51组成的组。在每种情况下，N末端甲硫氨酸残基是可选的。

表1

I53-40A属(SEQ ID NO：35)

(M)TKKVGIVDTTFARVDMASAAILTLKMESPNIKIIRKTVPGIKDLPVACKKLLEEEGCDIVMALGMPGK(A/K)EKDKVCAHEASLGLMLAQLMTNKHIIEVFVHEDEAKDDAELKILAARRAIEHALNVYYLLFKPEYLTRMAGKGLRQGFEDAGPARE

I53-40B属(SEQ ID NO：36)

(M)

(S/D)(T/D)INNQLK(A/R)LKVIPVIAIDNAEDIIPLGKVLAENGLPAAEITFRSSAAVKAIMLLRSAQPEMLIGAGTILNGVQALAAKEAGA(T/D)FVVSPGFNPNTVRACQIIGIDIVPGVNNPSTVE(A/Q)ALEMGLTTLKFFPAEASGGISMVKSLVGPYGDIRLMPTGGITP(S/D)NIDNYLAIPQVLACGGTWMVDKKLV(T/R)NGEWDEIARLTREIVEQVNP

I53-47A属(SEQ ID NO：37)

(M)PIFTLNTNIKA(T/D)DVPSDFLSLTSRLVGLILS(K/E)PGSYVAVHINTDQQLSFGGSTNPAAFGTLMSIGGIEP(S/D)KN(R/E)DHSAVLFDHLNAMLGIPKNRMYIHFV(N/D)L(N/D)GDDVGWNGTTF

I53-47B属(SEQ ID NO：38)

(M)NQHSHKD(Y/H)ETVRIAVVRARWHADIVDACVEAFEIAMAAIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVV(N/D)GGIY(R/D)HEFVASAVIDGMMNVQL(S/D)TGVPVLSAVLTPH(R/E)Y(R/E)DS(A/D)E(H/D)H(R/E)FFAAHFAVKGVEAARACIEIL(A/N)AREKIAA

I53-50A属(SEQ ID NO：39)

(M)KMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGH(T/D)ILKLFPGEVVGP(Q/E)FV(K/E)AMKGPFPNVKFVPTGGV(N/D)LD(N/D)VC(E/K)WF(K/D)AGVLAVGVG(S/K/D)ALV(K/E)G(T/D/K)PDEVRE(K/D)AK(A/E/K)FV(E/K)(K/E)IRGCTE

I53-50B属(SEQ ID NO：40)

(M)NQHSHKD(Y/H)ETVRIAVVRARWHAEIVDACVSAFEAAM(A/R)DIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVV(N/D)GGIY(R/D)HEFVASAVI(D/N)GMMNVQL(S/D/N)TGVPVLSAVLTPH(R/E/N)Y(R/D/E)(D/K)S(D/K)A(H/D)TLLFLALFAVKGMEAARACVEILAAREKIAA

T32-28A(SEQ ID NO：41)

(M)GEVPIGDPKELNGMEIAAVYLQPIEMEPRGIDLAASLADIHLEADIHALKNNPNGFPEGFWMPYLTIAYALANADTGAIKTGTLMPMVADDGPHYGANIAMEKDKKGGFGVGTYALTFLISNPEKQGFGRHVDEETGVGKWFEPFVVTYFFKYTGTPK

T32-28B(SEQ ID NO：42)

(M)SQAIGILELTSIAKGMELGDAMLKSANVDLLVSKTISPGKFLLMLGGDIGAIQQAIETGTSQAGEMLVDSLVLANIHPSVLPAISGLNSVDKRQAVGIVETWSVAACISAADLAVKGSNVTLVRVHMAFGIGGKCYMVVAGDVLDVAAAVATASLAAGAKGLLVYASIIPRPHEAMWRQMVEG

T33-09A(SEQ ID NO：43)

(M)EEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYRWQGSVVSDHELLLLVKTTTHAFPKLKERVKALHPYTVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTG

T33-09B(SEQ ID NO：44)

(M)VRGIRGAITVEEDTPAAILAATIELLLKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAEAARLIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLNEAVRLRPDLESAQ

T33-15A(SEQ ID NO：45)

(M)SKAKIGIVTVSDRASAGITADISGKAIILALNLYLTSEWEPIYQVIPDEQDVIETTLIKMADEQDCCLIVTTGGTGPAKRDVTPEATEAVCDRMMPGFGELMRAESLKEVPTAILSRQTAGLRGDSLIVNLPGDPASISDCLLAVFPAIPYCIDLMEGPYLECNEAMIKPFRPKAK

T33-15B(SEQ ID NO：46)

(M)VRGIRGAITVNSDTPTSIIIATILLLEKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAEAARQIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLSEAVRLRPDLESAQ

T33-21A(SEQ ID NO：47)

(M)RITTKVGDKGSTRLFGGEEVWKDSPIIEANGTLDELTSFIGEAKHYVDEEMKGILEEIQNDIYKIMGEIGSKGKIEGISEERIAWLLKLILRYMEMVNLKSFVLPGGTLESAKLDVCRTIARRALRKVLTVTREFGIGAEAAAYLLALSDLLFLLARVIEIEKNKLKEVRS

T33-21B(SEQ ID NO：48)

(M)PHLVIEATANLRLETSPGELLEQANKALFASGQFGEADIKSRFVTLEAYRQGTAAVERAYLHACLSILDGRDIATRTLLGASLCAVLAEAVAGGGEEGVQVSVEVREMERLSYAKRVVARQR

T33-28A(SEQ ID NO：49)

(M)ESVNTSFLSPSLVTIRDFDNGQFAVLRIGRTGFPADKGDIDLCLDKMIGVRAAQIFLGDDTEDGFKGPHIRIRCVDIDDKHTYNAMVYVDLIVGTGASEVERETAEEEAKLALRVALQVDIADEHSCVTQFEMKLREELLSSDSFHPDKDEYYKDFL

T33-28B(SEQ ID NO：50)

(M)PVIQTFVSTPLDHHKRLLLAIIYRIVTRVVLGKPEDLVMMTFHDSTPMHFFGSTDPVACVRVEALGGYGPSEPEKVTSIVTAAITAVCGIVADRIFVLYFSPLHCGWNGTNF

T33-31A(SEQ ID NO：51)

(M)EEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYREEGSVVSDHELLLLVKTTTDAFPKLKERVKELHPYEVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTG

表1提供了第一多肽和第二多肽的氨基酸序列。表1的右栏标识了每个示例性多肽中的残基编号，这些残基编号被鉴定为存在于所得组装纳米结构的界面上(即：“经鉴定的界面残基”)。可以看出，SEQ ID NO：1-34的示例性多肽的界面残基的数量范围为4-13。在各种实施方式中，第一多肽和第二多肽包含沿其长度与选自由SEQ ID NO：1-34组成的组中的多肽的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个经鉴定的界面位置(依赖于给定多肽的界面残基数量)具有同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，第一多肽和第二多肽包含沿其长度与选自由SEQ ID NO：1-51组成的组中的多肽的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且在至少20％、25％、33％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％经鉴定的界面位置具有同一性的氨基酸序列。

通常，与蛋白一样，期望多肽耐受设计序列中的某些变异，而不会破坏随后组装成纳米结构：特别是当这种变异包含保守的氨基酸取代时。在此所用的，“保守的氨基酸取代”是指：疏水性氨基酸(Ala、Cys、Gly、Pro、Met、See、Sme、Val、Ile、Leu)只能被其它疏水性氨基酸取代；具有大侧链的疏水性氨基酸(Phe、Tyr、Trp)只能被其它具有大侧链的疏水性氨基酸取代；具有侧链带正电荷的氨基酸(Arg、His、Lys)只能被其它具有侧链带正电荷的氨基酸取代；具有侧链带负电荷的氨基酸(Asp、Glu)只能被其它具有侧链带负电荷的氨基酸取代；具有极性侧链不带电荷的氨基酸(Ser、Thr、Asn、Gln)只能被其它具有极性侧链不带电荷的氨基酸取代。

表2列出了由SEQ ID NO：1-34表示的本发明的每个示例性多肽的表面氨基酸残基数。因此，在各种实施方式中，可以修饰本发明的多肽的这些表面残基中的1或多个(至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 或更多个)。括号中的残基是可选的。

表2

在本发明的纳米结构的各种实施方式中，第一多肽和第二多肽包含具有选自以下对或其修饰形式的氨基酸序列的多肽(即：包含沿其长度与以下SEQ ID No表示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性和/或在至少一个经鉴定的界面位置具有同一性的氨基酸序列的如本发明的多肽所公开的允许的修饰：分离的多肽)：

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(I53-34A和I53-34B)；

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4(I53-40A和I53-40B)；

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：24(I53-40A和I53-40B.1)；

SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：4(I53-40A.1和I53-40B)；

SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36(I53-40A属和I53-40B属)；

SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6(I53-47A和I53-47B)；

SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：27(I53-47A和I53-47B.1)；

SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28(I53-47A和I53-47B.1NegT2)；

SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：6(I53-47A.1和I53-47B)；

SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：27(I53-47A.1和I53-47B.1)；

SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：28(I53-47A.1和I53-47B.1NegT2)；

SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：6(I53-47A.1NegT2和I53-47B)；

SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27(I53-47A.1NegT2和I53-47B.1)；

SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28(I53-47A.1NegT2和I53-47B.1NegT2)；

SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38(I53-47A属和I53-47B属)；

SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8(I53-50A和I53-50B)；

SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：32(I53-50A和I53-50B.1)；

SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：33(I53-50A和I53-50B.1NegT2)；

SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：34(I53-50A和I53-50B.4PosT1)；

SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：8(I53-50A.1和I53-50B)；

SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：32(I53-50A.1和I53-50B.1)；

SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：33(I53-50A.1和I53-50B.1NegT2)；

SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：34(I53-50A.1和I53-50B.4PosT1)；

SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：8(I53-50A.1NegT2和I53-50B)；

SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32(I53-50A.1NegT2和I53-50B.1)；

SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：33(I53-50A.1NegT2和I53-50B.1NegT2)；

SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：34(I53-50A.1NegT2和I53-50B.4PosT1)；

SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：8(I53-50A.1PosT1和I53-50B)；

SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32(I53-50A.1PosT1和I53-50B.1)；

SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33(I53-50A.1PosT1和I53-50B.1NegT2)；

SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：34(I53-50A.1PosT1和I53-50B.4PosT1)；

SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40(I53-50A属和I53-50B属)；

SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10(I53-51A和I53-51B)；

SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12(I52-03A和I52-03B)；

SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14(I52-32A和I52-32B)；

SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16(I52-33A和I52-33B)

SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18(I32-06A和I32-06B)；

SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20(I32-19A和I32-19B)；

SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22(I32-28A和I32-28B)；

SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24(I53-40A.1和I53-40B.1)；

SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42(T32-28A和T32-28B)；

SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44(T33-09A和T33-09B)；

SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46(T33-15A和T33-15B)；

SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48(T33-21A和T33-21B)；

SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50(T33-28A和T32-28B)；和

SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：44(T33-31A和T33-09B(也称为T33-31B))

在一个实施方式中，将一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段表达为与所述第一多肽和/或第二多肽的融合蛋白。在这些实施方式中，只要这种构型可以促进一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段在纳米结构的外部上呈现，则优选在融合蛋白的N末端存在一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段。对于副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白在融合蛋白N末端存在的优选源自副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白的C末端位于F蛋白三聚体的一个极端(“底部”)；通过在此时定位基因融合体，大多数F蛋白结构将在纳米结构外部得以显示和可使用。在另一个实施方式中，所述纳米结构包含含有至少两个结构域-副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段和三聚体组件结构域-的融合蛋白的一个或多个拷贝(即：每个第一组件是第一多肽的三聚体)和第二低聚部分的一个或多个拷贝(即：每个第二组件是第二多肽两个或多个拷贝的寡聚体)。在另一个实施方式中，可以修饰第一多肽和/或第二多肽以允许一个或多个副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段与第一多肽和/或第二多肽共价连接。在一个非限制性示例中，可以修饰第一多肽和/或第二多肽，例如通过在限定的位置引入各种半胱氨酸残基来促进一个或多个副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段的连接。

在其它实施方式中，通过任何合适的技术将一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段连接至第一多肽或第二多肽，该技术包括但不限于共价化学交联(通过任何合适的交联技术)和包括工程化的静电相互作用的非共价连接。

三聚体组件结构域

在包含三聚体副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段的三聚体组件的一个实施方式中，将副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段遗传融合至自组装成所述三聚体组件的第一多肽。三聚体组件包含蛋白-蛋白界面，该界面诱导第一多肽的三个拷贝自缔合以形成三聚体组成部分。第一多肽的每个拷贝进一步包含与第二组件结构域上的互补表面暴露界面相互作用的表面暴露界面。如King等人(Nature 510, 103–108, 2014)、Bale等人(Science 353, 389–394, 2016)以及专利公开WO2014124301A1和US20160122392A1中所述，三聚体组件结构域和第二组件结构域之间的互补蛋白-蛋白界面驱动将三聚体组件结构域和第二组件构域的多个拷贝组装成靶标纳米结构。在一些实施方式中，纳米结构的三聚体组件结构域的每个拷贝带有作为基因融合体的副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段；这些纳米结构以完全价态显示F蛋白。在其它实施方式中，本发明的纳米结构包含带有作为基因融合体的副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段的三聚体组件结构域以及一个或多个不带有作为基因融合体的F蛋白的三聚体组件结构域的一个或多个拷贝；这些纳米结构以部分价态显示F蛋白。三聚体组件结构域可以是形成三聚体并与第二组件结构域相互作用以驱动组装成靶标纳米结构的任何多肽序列。

在一个特定实施方式中，所述第一多肽包含沿其全长与氨基酸序列T33-31A(SEQID NO：51)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，并且所述第二多肽包含沿其全长与氨基酸序列T33-09B/T33-31B(SEQ ID NO：44)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽(括号中的残基是可选的)。

T33-31A(SEQ ID NO：51)

(M)EEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYREEGSVVSDHELLLLVKT TTDAFPKLKERVKELHPYEVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTG

>T33-31B(SEQ ID NO：44)

(M)VRGIRGAITVEEDTPAAILAATIELLLKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAE AARLIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLNEAVRLRPDLESAQ

在另一个特定实施方式中，所述第一多肽包含沿其全长与氨基酸序列T33-15A(SEQ ID NO：45)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，并且所述第二多肽包含沿其全长与氨基酸序列T33-15B(SEQ ID NO：46)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。

在各种其它特定实施方式中，所述第一多肽包含沿其全长与选自由 I53-50A(SEQID NO：7)、I53-50A.1(SEQ ID NO：29)、I53-50A.1NegT2(SEQ ID NO：30)和I53-50A.1PosT1(SEQ ID NO：31)组成的组中的多肽的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，并且所述第二多肽包含沿其全长与选自由I53-50B(SEQ ID NO：8)、I53-50B.1(SEQ ID NO：32)、I53-50B.1NegT2(SEQ ID NO：33)和I53-50B.4PosT1(SEQ ID NO：34)组成的组中的多肽的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。

在另一个特定实施方式中，所述第一多肽包含沿其全长与氨基酸序列I32-28A(SEQ ID NO：21)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，并且所述第二多肽包含沿其全长与氨基酸序列I32-28B(SEQ ID NO：22)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。

本发明的纳米结构在纳米结构的外部上显示一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段的多个拷贝(即：2、3或更多个)。示例性副粘病毒和/或肺炎病毒包括但不限于呼吸道合胞病毒(RSV)和人偏肺炎病毒(hMPV)(C.L. Afonso等人, Taxonomy ofthe order Mononegavirales: update 2016. Arch. Virol.161, 2351–2360 (2016))。

如本文所用，“在纳米结构的外部上”意指一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白的抗原部分或其抗原片段必须易于与B细胞受体、抗体或抗体片段结合，并且不能掩埋在所述纳米结构内。

一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段可以包含任何合适的天然F蛋白、融合后抗原或融合前(preF)抗原或其能够诱导产生免疫应答的突变体，该免疫应答会产生与副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白结合的抗体。纳米结构可以显示一个以上的F蛋白；因此，在一些实施方式中，一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段包含1、2、3、4或更多个F蛋白或其抗原片段。在一个实施方式中，一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段可以为如专利公开号US 2016/0046675A1中所限定的。在一些实施方式中，一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段选自由如美国公开专利申请2016/0046675中所公开的SEQ ID NO：1-350、370-382、389-693、698-1026、1429-1442、1456-1468和1474-1478组成的组。在其它实施方式中，一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段可以为如专WO2012158613、US20160102123、US20140141037、WO2014079842、WO2014160463、US20140271699、EP2970393、WO2014174018、US20140271699、US20160176932、US20160122398、WO2017040387、WO2017109629、WO2017172890、WO2017207477、Krarup等人(2015) Nature Communications6:8143和WO2017207480中所限定的。

在一个特定实施方式中，一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段包含沿其全长与如下所示的氨基酸序列DS-Cav1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽(括号中的残基是可选的；注意到括号中的N末端残基是在分泌期间从蛋白上切割的-成熟的N末端开始于QNITEEF…(SEQ ID NO：52))。DS-Cav1包含融合(F)糖蛋白的融合前稳定化形式，其与融合后RSV F相比，在小鼠和猕猴中引发了针对呼吸道合胞病毒(RSV)改善的保护性应答(McLellan等人(2013) Science 342:592-8)。

DS-Cav1(SEQ ID NO：53)：

在其它实施方式中，F蛋白可以包含沿其全长与选自以下的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽：

RSV

(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATGSGSAICSGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSRTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)

sc9-10DS-Cav1A149C Y458C S46G K465Q S215P E92D(SEQ ID NO：62)(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATGSGSAICSGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSRTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)

SEQ ID NO：61-62代表第二代稳定化的DS-Cav1免疫原。注意到相对于DS-Cav1的突变，并且应该注意的是，本公开考虑了使用DS-Cav1突变体，其不同之处在于上文的SEQID NO：61或62中的单个所述氨基酸取代、或两个或多个所述氨基酸取代。在其它实施方式中，F蛋白可以包含以下中的一种或多种，其中每种都可以额外包括1、2或多个上文SEQ IDNO：61或62中所述的氨基酸取代：

RSVF

SC-TM(N67I、S215P和E487Q)(SEQ ID NO：64)

HMPV F蛋白、菌株CAN97-83(A2)(SEQ ID NO：65)

具有A113C、A120C、A339C、T160F、I177L和Q426C的HMPV F(SEQ IDNO：67)

(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTG115-BV(A185P)(SEQ ID NO：68)

(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCA DGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRRRRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIPDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNT(SGRENLYFQGGGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRHHHHHH)

在其它实施方式中，一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段可以包含沿其全长与选自由SEQ ID NO：53和61-64组成的组中的RSV F蛋白或其突变体具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，其中所述多肽包括一个或多个以下残基：67I、149C、458C、46G、465Q、215P、92D和487Q。

在其它实施方式中，一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段可以包含沿其全长与选自由SEQ ID NO：65-68和101组成的组中的MPV F蛋白或其突变体具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，其中所述多肽包括一个或多个以下残基：113C、120C、339C、160F、177L、185P和426C。

F蛋白与三聚体组件结构域之间的接头和几何要求

在本发明的纳米结构中，可以将F蛋白和三聚体组件结构域遗传融合，使得它们都存在于单个多肽中。优选地，F蛋白和三聚体组件结构域之间的连接允许F蛋白或其抗原片段被显示在本发明的纳米结构的外部上。这样，在没有任何F蛋白的情况下，与三聚体组件结构域的连接点应在由三聚体组件结构域和第二组件结构域形成的纳米结构的外部上。如本领域技术人员将理解的，多种多肽序列可以用于将副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段和三聚体组件结构域连接。将这些多肽序列称为接头。可以使用任何合适的接头；不需要氨基酸序列作为适当的接头。除了使F蛋白或其抗原片段被显示在本发明的纳米结构的外部上外，不需要接头使F蛋白或其抗原片段对三聚体组件结构域施加刚性相对定向。在一些实施方式中，所述接头包括有助于稳定F蛋白的三聚体形式的额外三聚化结构域(例如T4纤维蛋白的折叠结构域)。

T4纤维蛋白折叠结构域(可选在接头区域)(SEQ ID NO：54)

GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

在其它实施方式中，所述接头可以包含任何合适长度的Gly-Ser接头(即：由甘氨酸和丝氨酸残基组成的接头)。在各种实施方式中，Gly-Ser接头的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸。在各种实施方式中，Gly-Ser接头可以包含或者由氨基酸序列GSGGSGSGSGGSGSG(SEQ ID NO：55)、GGSGGSGS(SEQ ID NO：56)或GSGGSGSG(SEQ ID NO：57)组成。

在其它实施方式中，当表达为与一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白或其抗原片段的融合多肽时，所述接头可以包含可用来延伸第一个多肽的N末端螺旋的螺旋延伸结构域，使其位于纳米结构表面的外部。螺旋延伸可以与本文所述的其它接头组分结合存在，或者可以不存在。螺旋延伸可以具有任何合适的长度(即：7、8、9、10、11、12或更多个氨基酸)，并包含任何合适的一级氨基酸序列。在一个实施方式中，螺旋延伸可以包含或由氨基酸序列EKAAKAEEAAR(SEQ ID NO：58)组成。

因此，在各种非限制性实施方式中，其中F蛋白作为与第一多肽的融合蛋白存在并且使用了接头，其中F蛋白接头序列可以包含以下序列(在这些非限制性实施方式中，以DS-Cav1作为F蛋白示例)。括号中的残基是可选的，并且氨基酸序列MELLILKANAITTILTAVTFCFASG(SEQ ID NO：59)代表在加工期间被切割的N末端DS-Cav1信号肽：

DS-Cav1-折叠子(SEQ ID NO：60)：

在各种其它实施方式中，第一多肽包含或由与F蛋白融合的第一多肽的融合多肽组成，其中，该融合蛋白具有选自以下的序列(括号中的残基是可选的)：DS-Cav1-折叠子-T33-31A(SEQ ID NO：69)

(MELLILKANVIATILTAVTFCFASS)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGSMEEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYREEGSVVSDHELLLLVKTTTDAFPKLKERVKELHPYEVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTGDS-Cav1-T33-31A(SEQ ID NO：70)

(MELLILKANVIATILTAVTFCFASS)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGGSMEEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYREEGSVVSDHELLLLVKTTTDAFPKLKERVKELHPYEVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTGDS-Cav1-折叠子-T33-15B(SEQ ID NO：71)

(MELLILKANVIATILTAVTFCFASS)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGSMVRGIRGAITVNSDTPTSIIIATILLLEKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAEAARQIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLSEAVRLRPDLESAQDS-Cav1-T33-15B(SEQ ID NO：72)

(MELLILKANVIATILTAVTFCFASS)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGGSMVRGIRGAITVNSDTPTSIIIATILLLEKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAEAARQIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLSEAVRLRPDLESAQDS-Cav1-折叠子-I53-50A(SEQ ID NO：73)

(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTEDS-Cav1-I53-50A(SEQ ID NO：74)

(MELLILKANVIATILTAVTFCFASS)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTEDS-Cav1-I32-28A(SEQID NO：75)

(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGGSGGSGSDDARIAAIGDVDELNSQIGVLLAEPLPDDVRAALSAIQHDLFDLGGELCIPGHAAITEDHLLRLALWLVHYNGQLPPLEEFILPGGARGAALAHVCRTVCRRAERSIKALGASEPLNIAPAAYVNLLSDLLFVLARVLNRAAGGADVLWDRTRAHDS-Cav1-8GS-HelExt-I53-50A(F10)(SEQ ID NO：76)

(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTEDS-Cav1-折叠子-15GS-HelExt-I53-50A(F14)(SEQ ID NO：77)

(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGGSGSGSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTEHMPV F wt_CAN97-83菌株-I53-50A(SEQ ID NO：78)

(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSSMILVSIFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHSGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTEHMPV F A113C_A339C_T160F_I177L-I53-50A(SEQ ID NO：79)

(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTEHMPV F A113C_A339C_T160F_I177L_A120C，Q426C突变-I53-50A(SEQ IDNO：80)

(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATGSGSCIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTEtc-DS2-I53-50A(SEQ ID NO：82)

(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSCIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTEDS-Cav1-12GS-HelExt-I53-50A(F11)(SEQ ID NO：83)

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(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGSGGSGSGSGGSGSGGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTEDS-Cav1-折叠子-10GS-HelExt-I53-50A(F13)(SEQ ID NO：85)

TMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRG

IIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASI

SQVNEKINQSLAFIRGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGGSGSGSGEKAAKAEEA

ARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKE

KGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAM

KLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSA

LVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE

DS-Cav1-折叠子-20GS-HelExt-I53-50A(F15)(SEQ ID NO：86)

(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELS

NIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNN

AKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLS

NGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTT

PVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYG

VIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCD

TMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRG

IIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASI

SQVNEKINQSLAFIRGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGGSGSGSGGSGSGGSSGS

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LAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE

sc9-10DS-Cav1A149C Y458C-折叠子-I53-50A实施方式(SEQ ID NO：87)

(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELS

NIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATGSGSAICSGVAVCKVLHLE

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GCTE

sc9-10DS-Cav1A149C Y458C-I53-50A-F10实施方式(SEQ ID NO：88)(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATGSGSAICSGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSRTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)GSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTEsc9-10DS-Cav1A149C Y458C S46G K465Q S215P E92D-折叠子-I53-50A实施方式(SEQ ID NO：89)

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SC-TM(N67I、S215P和E487Q)-折叠子-I53-50A实施方式(SEQ ID NO：93)

(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTESC-TM(N67I、S215P和E487Q)-I53-50A-F10实施方式(SEQ ID NO：94)(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)GSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE

具有A113C、A339C、T160F、I177L-折叠子-I53-50A的HMPV-F实施方式(SEQ ID NO：95)

(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE

具有A113C、A339C、T160F、I177L-I53-50A F10的HMPV-F实施方式(SEQ ID NO：96)

(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGGSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE

具有A113C、A120C、A339C、T160F、I177L和Q426C-折叠子-I53-50A的HMPV-F实施方式(SEQ ID NO：97)

具有A113C、A120C、A339C、T160F、I177L和Q426C-F10的HMPV-F实施方式(SEQ IDNO：98)

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本发明的纳米结构可以包含三聚体第一组件的多个拷贝和第二组件的多个拷贝。所述第二组件包含蛋白-蛋白界面，该界面诱导第二多肽的多个拷贝自缔合以形成第二组件。第二组件的多个低聚状态可以与纳米结构形式相容，该形式包括二聚体(两个拷贝)、三聚体(三个拷贝)、四聚体(四个拷贝)，五聚体(五个拷贝)、六聚体(六个拷贝)或更高的低聚状态。第二组件的每个拷贝还包含与三聚体组件结构域上的互补表面暴露界面相互作用的表面暴露界面。如King等人、Bale等人以及专利公开WO2014124301A1和US20160122392A1中所述，三聚体组件结构域和第二组件结构域之间的互补界面驱动将三聚体组件结构域和第二组件构域的多个拷贝组装成靶标纳米结构。在各种特定实施方式中：

(a)当每个第一多肽是DS-Cav1-折叠子-T33-31A(SEQ ID NO：69)或DS-Cav1-T33-31A(SEQ ID NO：70)时，每个第二多肽是T33-31B(SEQ ID NO：44)；

(b)当每个第一多肽是DS-Cav1-折叠子-T33-15B(SEQ ID NO：71)或DS-Cav1-T33-15B(SEQ ID NO：72)时，每个第二多肽是T33-15A(SEQ ID NO：45)；

(c)当每个第一多肽是DS-Cav1-折叠子-I53-50A(SEQ ID NO：73)或DS-Cav1-I53-50A(SEQ ID NO：74)时，每个第二多肽是I53-50B(SEQ ID NO：8)、I53-50B.1(SEQ ID NO：32)、I53-50B.1NegT2(SEQ ID NO：33)或I53-50B.4PosT1(SEQ ID NO：34)；

(d)当每个第一多肽是DS-Cav1-I32-28A(SEQ ID NO：75)时，每个第二多肽是I32-28B。

通过体外组装两个组分组装完全价态纳米结构

在一些实施方式中，纳米结构的每个三聚体第一组件均带有相同的作为基因融合体的F蛋白；这些纳米结构以完全价态显示F蛋白。这样的纳米结构是在称为体外组装工艺中从纯化的第一多肽和第二多肽产生的。在水性条件下，将纯化的包含F蛋白的三聚体第一多肽与适当的第二多肽以约1：1的摩尔比混合(见图1)。第二组件与三聚体第一组件相互作用以驱动靶标纳米结构的组件。通过用于评价蛋白或蛋白组件物理尺寸的常用生化或生物物理方法分析体外组装反应，可以确认靶标纳米结构的成功组装，该方法包括但不限于尺寸排阻色谱、天然(非变性)凝胶电泳、动态光散射、多角度光散射、分析超速离心、负染色电子显微镜、冷冻电子显微镜或X射线晶体学。如有必要，可以使用通常用于通过蛋白物理尺寸分离蛋白的制备技术，从体外组装反应中存在的其它种类或分子中纯化组装的纳米结构，该技术包括但不限于尺寸排阻色谱、制备性超速离心、切向流过滤或制备性凝胶电泳。可以通过通常用于确定水溶液中蛋白分子身份的技术来评价纳米结构中F蛋白的存在，该技术包括但不限于SDS-PAGE、质谱、蛋白测序或氨基酸分析。可以通过通常用于检测抗原存在和构象的技术评估F蛋白在粒子外部上的可及性及其构象或抗原性，该技术包括但不限于与单克隆抗体的结合、构象-特异性单克隆抗体或对抗原具有特异性的抗血清。

部分价态纳米结构的体外组装

在其它实施方式中，本发明的纳米结构包含带有作为基因融合体的F蛋白的三聚体第一组件以及一个或多个不带有作为基因融合体的F蛋白的三聚体第一组件的一个或多个拷贝；这些纳米结构以部分价态显示F蛋白。这些部分价态纳米结构是通过与第一多肽的混合物进行体外组装而产生的，其中带有作为基因融合体的F蛋白的三聚体第一组件的比例等于抗原在所得纳米结构中的期望价态。体外组装反应通常含有总第一多肽与总第二多肽的摩尔比为约1：1。作为非限制性示例，与三聚体组件的混合物进行体外组装反应，其中第一多肽的一半带有F蛋白，因为基因融合体会产生具有50％F蛋白价态的组装纳米结构。即，将占据纳米结构上F蛋白显示的可能位点的50％。作为非限制性示例，如果纳米结构是具有二十面体对称性的120个亚基组件，则该纳米结构包含20个总三聚体组成部分，并且50％价态的纳米结构显示可能20个F蛋白三聚体中的10个。以此方式，在体外组装反应中，带有F蛋白的第一多肽与缺少F蛋白的第一多肽的比例可以用于精确地调节所得纳米结构的F蛋白价态。本领域技术人员将理解的是，可以以这种手段调整平均价态；混合物中单个纳米结构的价态将围绕平均值分布。可以使用用于评估完全价态纳米结构的上文所述技术来评价这种部分价态纳米结构的成功组装，并且如有必要，可以使用用于纯化完全价态纳米结构的所述方法来纯化部分价态纳米结构。可以使用用于评估完全价态纳米结构中F蛋白存在的上文所述技术，通过定量分析来评价给定样品中带有F蛋白的第一多肽的平均价态。

共显示多种F蛋白的纳米结构的体外组装

在其它实施方式中，本发明的纳米结构包含两个或多个不同的第一多肽，所述第一多肽带有不同的F蛋白作为基因融合体。这些纳米结构在相同纳米结构上共显示多个不同的F蛋白。通过与第一多肽的混合物进行体外组装来产生这些多抗原纳米结构，其中每个第一多肽带有两个或多个不同的F蛋白中的一个作为基因融合体。混合物中每个第一多肽的比例决定了所得纳米结构中每个F蛋白的平均价态。体外组装反应通常含有总三聚体第一多肽与总第二多肽的摩尔比为约1：1。可以使用用于评估完全价态纳米结构中F蛋白存在的上文所述技术，通过定量分析来评价给定样品中每个带有F蛋白的第一多肽的存在和平均价态。

在各种实施方式中，纳米结构的直径在约20纳米(nm)至约40nm之间，内部腔跨度在约15nm至约32nm之间，并且蛋白壳在其最长维度上的孔径在约1nm至约14nm之间。

在一个实施方式中，该纳米结构具有二十面体对称性。在该实施方式中，该纳米结构可以包含第一多肽的60个拷贝和第二多肽的60个拷贝。在一个这样的实施方式中，每个第一组件中相同的第一多肽的数量不同于每个第二组件中相同的第二多肽的数量。例如，在一个实施方式中，纳米结构包含十二个第一组件和二十个第二组件；在该实施方式中，每个第一组件可以例如包含相同的第一多肽的五个拷贝，并且每个第二组件可以例如包含相同的第二多肽的三个拷贝。在另一个实施方式中，纳米结构包含十二个第一组件和三十个第二组件；在该实施方式中，每个第一组件可以例如包含相同的第一多肽的五个拷贝，并且每个第二组件可以例如包含相同的第二多肽的两个拷贝。在另一个实施方式中，纳米结构包含二十个第一组件和三十个第二组件；在该实施方式中，每个第一组件可以例如包含相同的第一多肽的三个拷贝，并且每个第二组件可以例如包含相同的第二多肽的两个拷贝。所有这些实施方式均能够形成具有规则二十面体对称性的合成纳米材料。在各种其它实施方式中，第一多肽和第二多肽的寡聚状态如下：

I53-34A：三聚体+ I53-34B：五聚体；

I53-40A：五聚体+ I53-40B：三聚体；

I53-47A：三聚体+ I53-47B：五聚体；

I53-50A：三聚体+ I53-50B：五聚体；

I53-51A：三聚体+ I53-51B：五聚体；

I32-06A：二聚体+ I32-06B：三聚体；

I32-19A：三聚体+ I32-19B：二聚体；

I32-28A：三聚体+ I32-28B：二聚体；

I52-03A：五聚体+ I52-03B：二聚体；

I52-32A：二聚体+ I52-32B：五聚体；和

I52-33A：五聚体+ I52-33B：二聚体

在另一个实施方式中，本发明的任何实施方式或实施方式组合的纳米结构具有以下一个或多个特征，每个特征如在以下示例中所证明：

(a)结合融合前F特异性抗体(包括但不限于单克隆抗体25)；

(b)形成对称结构(包括但不限于二十面体结构)；

(c)在50℃下是稳定的；和/或

(d)在2.25M盐酸胍中是稳定的。

在另一方面，本发明提供了编码本发明融合蛋白的分离的核酸。分离的核酸序列可以包含RNA或DNA。如本文所用，“分离的核酸”是已经从基因组或cDNA序列的其正常周围核酸序列中除去的那些核酸。这种分离的核酸序列可以包含用于促进编码的蛋白表达和/或纯化的额外序列，包括但不限于polyA序列，修饰的Kozak序列以及编码表位标签、输出信号和分泌信号、核定位信号和质膜定位信号的序列。基于本文的教导，对于本领域技术人员而言显而易见的是，什么核酸序列将编码本发明的蛋白。

在另一方面，本发明提供了重组表达载体，其包含与合适的控制序列可操作地连接的本发明的任何实施方式或实施方式组合的分离的核酸。“重组表达载体”包括将核酸编码区或基因与能够影响基因产物表达的任何控制序列可操作地连接的载体。可操作地连接至本发明的核酸序列的“控制序列”是能够影响核酸分子表达的核酸序列。控制序列不必与核酸序列邻接，只要它们起指导其表达的作用即可。因此，例如，在启动子序列和核酸序列之间可以存在中间的未翻译但仍被转录的序列，并且仍然可以认为该启动子序列与编码序列“可操作地连接”。其它这种控制序列包括但不限于聚腺苷酸化信号、终止信号和核糖体结合位点。这些表达载体可以是本领域已知的任何类型，包括但不限于质粒和基于病毒的表达载体。用于驱动所公开的核酸序列在哺乳动物系统中表达的控制序列可以是组成型的(由多种启动子中的任意一个驱动，这些启动子包括但不限于CMV、SV40、RSV、肌动蛋白、EF)或诱导型的(由许多诱导型启动子中的任意一个驱动，这些启动子包括但不限于四环素响应性、蜕皮激素响应性、类固醇响应性的启动子)。用于转染原核细胞的表达载体的构建也是本领域众所周知的，因此可以通过标准技术来完成。(参见例如Sambrook, Fritsch和Maniatis,in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989；Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, 编辑E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.),以及the Ambion1998Catalog (Ambion, Austin,TX)。表达载体必须作为附加体或通过整合到宿主染色体DNA中才能在宿主生物体中复制。在一个优选的实施方式中，该表达载体包含质粒。然而，本发明旨在包括具有等价功能的其它表达载体，例如病毒载体。

在另一方面，本发明提供了已经用本文所公开的重组表达载体转染的宿主细胞，其中所述宿主细胞可以是原核或真核的，例如哺乳动物细胞。该细胞可以被瞬时或稳定地转染。可以通过本领域已知的任何技术将表达载体这样转染到原核和真核细胞中，该技术包括但不限于标准细菌转化、磷酸钙共沉淀、电穿孔或脂质体介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、聚阳离子介导的转染、或病毒介导的转染。(参见例如Molecular Cloning: ALaboratory Manual (Sambrook,等人, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 第二次编辑 (R.I.Freshney. 1987. Liss, Inc. New York,NY))生产根据本发明的多肽的方法是本发明的另一部分。该方法包括以下步骤：(a)在有利于多肽表达的条件下培养根据本发明该方面的宿主，和(b)可选地回收表达的多肽。

在另一方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含有效量的本发明的任何实施方式或实施方式组合的纳米结构和药学上可接受的载体。该组合物可以包含(a)冻干保护剂；(b)表面活性剂；(c)膨胀剂；(d)张力调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂和/或(g)缓冲剂。

在一些实施方式中，药物组合物中的缓冲剂是Tris缓冲剂、组氨酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂或乙酸盐缓冲剂。该组合物还可以包含冻干保护剂，例如蔗糖、山梨糖醇或海藻糖。在某些实施方式中，该组合物包括防腐剂，例如苯扎氯铵、苄索铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸及其各种混合物。在其它实施方式中，该组合物包括膨胀剂，例如甘氨酸。在其它实施方式中，该组合物包括含表面活性剂，例如聚山梨酸酯-20、聚山梨酸酯-40、聚山梨酸酯-60、聚山梨酸酯-65、聚山梨酸酯-80、聚山梨酸酯-85、泊洛沙姆-188、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇三月桂酸酯，脱水山梨醇三硬脂酸酯，脱水山梨醇三油酸酯或其组合。该组合物还可以包括张力调节剂，例如使所述制剂与人血液基本上等渗或等渗的化合物。示例性张力调节剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸，甲硫氨酸、甘露糖醇、葡萄糖、肌醇、氯化钠、精氨酸和精氨酸盐酸盐。在其它实施方式中，该组合物额外包括稳定剂，例如以冻干或液体形式基本上防止或减少纳米结构的化学和/或物理不稳定性的分子。示例性稳定剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、肌醇、氯化钠、甲硫氨酸、精氨酸和精氨酸盐酸盐。

纳米结构可以是组合物中的唯一活性剂，或组合物可以进一步包含一种或多种适于预期用途的其它试剂，包括但不限于通常刺激免疫系统并总体上改善免疫应答的佐剂。可以使用任何合适的佐剂。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。示例性佐剂包括但不限于：Adju-Phos

在另一方面，本发明提供了用于在受试者中对副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白产生免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的任何实施方式或实施方式组合的免疫原性组合物以产生免疫应答。在另一方面，本发明提供了用于在受试者中治疗或预防副粘病毒和/或肺炎病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的任何实施方式或实施方式组合的免疫原性组合物，从而治疗或预防受试者的副粘病毒和/或肺炎病毒感染。

在一个实施方式中，所述副粘病毒和/或肺炎病毒包含呼吸道合胞病毒。“呼吸道合胞病毒”和“RSV”是指导致呼吸系统疾病的负义单链RNA病毒，尤其是在儿童中。当该方法包含治疗RSV感染时，将免疫原性组合物施用于已经感染有RSV和/或患有表明该受试者可能已感染了RSV的症状(包括但不限于下呼吸道感染、上呼吸道感染、细支气管炎、肺炎、发烧、精神不振、食欲减退、反复喘息和哮喘)的受试者。如本文所用，“治疗”或“治愈”包括但不限于完成以下一项或多项：(a)降低受试者的副粘病毒和/或肺炎病毒滴度；(b)限制受试者的副粘病毒和/或肺炎病毒滴度的任何增加；(c)降低副粘病毒和/或肺炎病毒症状的严重程度；(d)限制或预防感染后副粘病毒和/或肺炎病毒症状的发展；(e)抑制副粘病毒和/或肺炎病毒症状的恶化；(f)限制或预防先前有副粘病毒和/或肺炎病毒感染症状的受试者中副粘病毒和/或肺炎病毒症状的复发；和/或促进母体的副粘病毒和/或肺炎病毒抗体传播给婴儿(母体免疫后)。

当该方法包含限制副粘病毒和/或肺炎病毒感染时，将免疫原性组合物预防性地施用于未知感染的但可能有暴露于副粘病毒和/或肺炎病毒的风险的受试者。如本文所用，“限制”意指限制有RSV感染风险的受试者的RSV感染。特别高危群体包括18岁以下的儿童(特别是3岁或3岁以下的婴儿)、65岁以上的成人以及患有任何类型的免疫缺陷的个体。

如本文所用，“有效量”是指有效治疗和/或限制RSV感染的免疫原性组合物的量。免疫原性组合物通常被配制成药物组合物，例如上文所公开的那些，并可以通过任何合适的途径(包括口服、胃肠外、通过吸入喷雾、直肠或局部)施用含有常规药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂的剂量单位制剂。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、动脉内、肌内、胸骨内、腱内、脊柱内、颅内、胸腔内、输注技术或腹膜内。也可以通过微球、脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)或其它微粒递送系统或被引入到合适组织(例如血液)中的缓释制剂来施用多肽组合物。可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如治疗性或预防性应答)。合适的剂量范围可以是例如0.1ug/kg-100mg F蛋白或其抗原片段/kg体重。可以单次推注来递送该组合物，或者可以如由主治医务人员确定的那样施用一次以上(例如2、3、4、5或更多次)。

在一个实施方式中，施用导致在受试者中产生副粘病毒和/或肺炎病毒中和抗体。在另一个实施方式中，中和抗体以至少9400的滴度(1/ID

实施例

方法：

包含F蛋白和三聚体组件结构域的三聚体组成部分的表达和筛选

从Genscript订购了包括和缺乏DS-Cav1融合体的三聚体组成部分的人密码子优化序列。将单组分纳米结构的组成部分(即I3-01)克隆到含有一个CMV启动子的pcDNA3.1载体(ThermoFisher Scientific)中，而将两组分纳米结构的组成部分(例如I53-50)克隆到含有CMV和EF-1α启动子的pBudCE4.1

通过使用线性25kDa聚乙烯亚胺(PEI； Polysciences)瞬时转染293T(ATCC)细胞来生产慢病毒。简而言之，将4×10

每隔一天将转导的细胞扩增至1×10

带有DS-Cav1的纳米结构的体外组装

通过将每种浓度为50μM的DS-Cav1-折叠子-I53-50A三聚体和I53-50B.4PT1五聚体混合并在4℃下振动温育过夜来制备100％价态粒子(每个二十面体纳米结构20个DS-Cav1三聚体)。在某些情况下，使用GE Sephacryl S-500HR 16/60色谱柱在包含25mM TrispH 8、250mM NaCl、5％甘油的缓冲液中，从体外组装反应中剩余的多余组分中纯化组装的纳米结构。在存在和不存在还原剂的情况下，通过SDS-PAGE分析样品负载和SEC级分。将峰级分合并，使用GE Vivaspin

通过将分别为50、25和75μM的DS-Cav1-折叠子-I53-50A三聚体、I53-50A三聚体和I53-50B.4PosT1五聚体混合而制备66％价态粒子(每个二十面体纳米结构约14个DS-Cav1三聚体)。通过将分别为25、50和75μM的DS-Cav1-折叠子-I53-50A三聚体、I53-50A三聚体和I53-50B.4PosT1五聚体混合而制备33％价态粒子(每个二十面体纳米结构约7个DS-Cav1三聚体)。允许体外组装反应在4℃下振动温育过夜。在某些情况下，使用GE Sephacryl

带有DS-Cav1的纳米结构的电子显微镜

通过使用25mM Tris pH 8、250mM NaCl、5％甘油稀释至0.01mg/mL制备用于阴性染色EM的样品，将3.5μL在辉光放电的铜碳涂覆的栅格上温育20秒，然后用一张Whatman1号滤纸将液体吸干。在将样品吸干后的几秒钟内，沉积3.5μL的染色剂液滴(2％w/v甲酸铀酰)并立即将其吸干，然后进行第二次染色/吸干周期。

圆二色谱(CD)分光旋光法

将来自F蛋白(0.5mg ml

酶联免疫吸附测定(ELISA)

为了测试抗体或血清的特异性结合，用连续稀释的来自细胞的组织培养上清液涂覆96孔MaxiSorp

表面等离子体共振(SPR)

在ProteON

疫苗接种和血清学分析

6-9周龄的雌性BALB/c小鼠获自ENVIGO Laboratories(意大利)。所有蛋白均按照制造商的说明书使用AddaVax

病毒中和测定和显微镜分析

使用基于微中和流式细胞仪的测定测量血清对RSV感染的中和。在37℃下将系列稀释的血清与RSV预温育1小时，然后添加到96孔平底平板中的10000个Hep-2(

非人灵长类动物(NHP)免疫

用配制在MF59样佐剂SWE中的三聚体DS-Cav1(50μg；n＝4)或DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构(96μg，其包含50μg显示的DS-Cav1；n＝5)在第0和第4周立即将恒河猕猴免疫(右股四头肌)。在第6和16周获得血清用于血清学分析。

通过相对结合D25而带有DS-Cav1的纳米结构的稳定性

在ProteON

纳米结构相关蛋白的化学变性

随着盐酸胍浓度范围从0M至6.5M不同且以0.25M的增量递增，在25mM Tris pH 8、250mM NaCl、5％甘油中将三聚体DS-Cav1、DS-Cav1-I53-50A、DS-Cav1-I53-50、I53-50、三聚体I53-50A或五聚体I53-50B.4PT1稀释至最终浓度为2.5μM。一式三份制备样品并在环境温度下温育16小时。在Cary Eclipse荧光分光光度计上，测量每种蛋白和每个重复的每种盐酸胍浓度的固有荧光。在所有实验中，将Peltier控制器用于池架以保持25℃的温度。使用10mm池(Agilent Cuvette，部件号6610021600)收集荧光光谱，在290nm处激发并以1nm的带通以60nm/分钟的速率从310nm扫描发射到510nm。

统计分析

没有使用统计方法来确定样本量。当将三个或更多个组比较时，数据通过Prism 6(GraphPad

结果

包含F蛋白和三聚体组件结构域的三聚体组成部分

由ELISA测定中的融合前特异性单克隆抗体结合判断，发现了几个三聚体组成部分(每个都包含基因融合至三聚体组件结构域的F蛋白)均分泌自具有其F蛋白处于折叠良好的融合前构象的HEK293F细胞。图2显示了ELISA数据的示例，该数据分析了表达DS-Cav1-折叠子、DS-Cav1-折叠子-T33-31A和DS-Cav1-T33-31A的HEK293F细胞的上清液。几个其它三聚体组成部分可产生折叠良好的融合前F蛋白的可检测分泌物。

DS-Cav1-折叠子-I53-50A的表达和纯化

将编码DS-Cav1-折叠子-I53-50A的慢病毒载体用于转导HEK293F细胞以进行大规模表达。通过固定的金属亲和色谱和尺寸排阻色谱从组织培养上清液中纯化分泌的蛋白。尺寸排阻色谱(图3)表明了纯化的蛋白形成单个单分散种类。I53-50B.4PT1的表达和纯化

如Bale等人和专利公开US20160122392A1中所述的表达和纯化五聚体蛋白I53-50B.4PT1，其包含与I53-50A或DS-Cav1-折叠子-I53-50A中的三聚体组件结构域相互作用以驱动基于二十面体I53-50的纳米结构组装的第二组件结构域。带有DS-Cav1的I53-50纳米结构的体外组装和表征

如Bale等人最近所述，I53-50是具有二十面体对称性的120个亚基的两组分纳米结构，其包含20个三聚体(I53-50A)和12个五聚体(I53-50B)组成部分。I53-50A的N末端暴露在I53-50纳米结构的外部上，这使抗原能够通过与I53-530AN末端的基因传融合而在纳米结构外部上显示。通过以不同的摩尔比混合两种纯化的蛋白将纯化的DS-Cav1-折叠子-I53-50A和I53-50B.4PT1体外组装以形成在纳米结构外部上显示各种量DS-Cav1的120个亚基的二十面体纳米结构。在单独的制备中，如上所述制得了以100％(20个三聚体)、66％(约14个三聚体)和33％(约7个三聚体)的价态显示DS-Cav1的纳米结构。通过几种技术评价过夜温育后体外组装反应中存在的种类，该技术包括尺寸排阻色谱-多角度光散射(SEC-MALS)、动态光散射和紫外线(UV)/可见(vis)光谱。使用尺寸排阻色谱从体外组装反应中纯化了120个亚基的纳米结构(图4中呈现了使用100％价态纳米结构获得的示例性色谱)。通过负染色电子显微镜表征纯化的纳米结构，这揭示了其中由于尖峰从核心二十面体I53-50组件向外突出而使DS-Cav1清晰可见的单分散粒子场(使用100％价态粒子获得的示例性显微照片呈现于如图5中)。使用对融合前构象具有特异性的单克隆抗体的ELISA测定证实了如此显示在纳米结构外部上的DS-Cav1折叠良好且具有抗原性完整(图6)。评估单克隆抗体结合动力学的表面等离振子共振实验揭示了抗体从100％价态的DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构上解离比从DS-Cav1-折叠子三聚体中解离的慢，这可能是由于亲和力效应源自DS-Cav1在纳米结构外部上的多价态呈现(图6)。总之，这些实验证实了DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构形成了单分散的二十面体纳米结构，在其外部上显示折叠良好的，抗原性完整的DS-Cav1三聚体。这些发现激发了实验以评估DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构作为用于诱导动物针对DS-Cav1的体液免疫应答的免疫原的实用性。

DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构的免疫原性

使用如上文所述的初免(prime-boost)策略将显示33％、66％和100％价态DS-Cav1的DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构注射到小鼠中。另外的小鼠组用三聚体DS-Cav1-折叠子作为纳米结构或I53-50纳米结构对DS-CAV1诱导的体液免疫应答的基准，所述I53-50纳米结构缺乏显示DS-CAV1作为DS-CAV1特异性应答的阴性对照。将注射后在所定义的时间点从小鼠提取的血清的ELISA测定用于测量注射动物血清中存在的DS-Cav1特异性抗体滴度(图7)。如预期的那样，注射有缺乏显示DS-Cav1的I53-50纳米结构的动物血清中不含有对DS-Cav1特异性的抗体。根据先前的结果(McClellan等人)，三聚体DS-Cav1折叠子诱导了DS-Cav1特异性抗体。价态33％、66％和100％的DS-Cav1纳米结构均比三聚体DS-Cav1折叠子诱导更高的DS-Cav1特异性抗体滴度，且抗体滴度随DS-Cav1价态的增加而增加。与DS-Cav1相比，注射有100％价态DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构的小鼠中，DS-Cav1特异性滴度平均高出约2.5倍。这些结果证明了当将其注入到动物中时，副粘病毒F蛋白在自组装蛋白纳米结构上多价态显示的免疫原可以诱导更高的体液免疫应答。

还使用标准中和测定在HEp-2细胞中评估了注射有上文所述一系列免疫原的小鼠血清的中和抗体滴度的存在(图8)。血清中和抗体滴度的趋势与DS-Cav1特异性结合抗体滴度中所观察到的趋势高度相关。注射有缺乏显示DS-Cav1的I53-50纳米结构动物血清不能中和病毒，这与这些血清中缺乏DS-Cav1特异性抗体一致。注射有三聚体DS-Cav-1-折叠子中和病毒的动物血清的平均滴度(1/ID

还将DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构注射到恒河猴中以评估它们在灵长类动物免疫系统中的免疫原性。在第0和第4周向动物肌肉内注射以100％价态DS-Cav1显示的游离DS-Cav1三聚体或DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构。在这两种情况下，DS-Cav1抗原的剂量均为50μg，并用MF59类角鲨烯基水包油乳液佐剂SWE配制免疫原。评估在第6和16周时从动物获得的血清的抗DS-Cav1抗体滴度和RSV中和抗体滴度(图9)。该结果反映了在小鼠中获得的结果。在第16周，与注射有三聚体DS-Cav1的动物相比，注射有DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构的动物的平均抗DS-Cav1抗体滴度高4倍。在第16周，与注射有三聚体DS-Cav1的动物相比，注射有DS-Cav1-折叠子-I53-50纳米结构的动物的RSV中和抗体滴度高16倍。这些结果证明了在灵长类动物免疫系统中，其中与单独的三聚体副粘病毒F蛋白相比，在自组装蛋白纳米结构上多价态地显示副粘病毒F蛋白的免疫原诱导更强烈的体液免疫应答(包括高水平的病毒中和抗体)。通过融合至I53-50A的DS-Cav1的物理稳定性

鉴于融合前F的关键抗原特性，我们使用两种正交方法来测量当融合至I53-50A时和/或当进一步组装成二十面体纳米结构时的DS-Cav1的物理稳定性。首次测定是在热应激后测量了融合前特异性单克隆抗体结合的保持力，该方法先前已用于表征融合前F的稳定性(McLellan等人2013；Joyce等人2016；Krarup等人2015)。将含有等价浓度(50nM)DS-Cav1的三聚DS-Cav1、三聚DS-Cav1-I53-50A和DS-Cav1-I53-50纳米结构的样品分为四个等分试样，并在20、50、70或80℃下温育1小时。冷却至室温后，通过表面等离子体共振(SPR)测定D25结合。我们发现所有样品在20和50℃下均等价地结合D25，但在80℃下1小时后失去与D25的大部分反应性，如先前针对DS-Cav1的报道(McLellan等人2013；Joyce等人2016)(图10)。有趣的是，尽管D25也不能结合在70℃下温育1小时的三聚体DS-Cav1，但三聚体DS-Cav1-I53-50A和DS-Cav1-I53-50纳米结构保留了各自结合信号的50％和80％(图10)。尽管DS-Cav1-I53-50纳米结构的多价态性质使与三聚体DS-Cav1的直接定量比较变得复杂，但这些结果表明了与I53-50A三聚体的基因融合进一步稳定了DS-Cav1的融合前构象，这暗示了在组装的纳米结构免疫原的情况下保持增加的稳定性。

我们使用盐酸胍(GdnHCl)中的化学变性(通过固有的色氨酸荧光监测)作为第二种独立于抗体的技术来评估物理稳定性。分析在0-6.5M GdnHCl中温育的DS-Cav1的荧光发射揭示了该蛋白质经历了两个微妙的不同跃迁，一个在0.25M和2.25M GdnHCl之间，另一个在2.25M和5.75M之间(图11)。相反，三聚体DS-Cav1-I53-50A仅出现一个单一跃迁，发生在2.25M和6.25M GdnHCl之间(图11)。目前尚不清楚三聚体DS-Cav1-I53-50A是否缺少DS-Cav1在所观察到的较低[GdnHCl]处的跃迁，还是只是转变为较高的[GdnHCl]。然而，很明显地，通过与三聚体I53-50A的基因融合来稳定DS-Cav1的天然构象，这反映了通过测量热应激后D25结合而获得的结果。比较DS-Cav1-I53-50纳米结构和单独的I53-50纳米结构(缺少融合的DS-Cav1)的数据表明了在组装成二十面体纳米结构时可以保持稳定性(图11)。这种影响的根源可能是I53-50A三聚体的极端稳定性。I53-50A源自嗜热细菌T. maritima的KDPG醛缩酶。并且仅在非常高的GdnHCl浓度(≥5.75M)下才开始显示荧光变化(图11)。

我们进行了额外的构建以评价GS重复的数量以及对稳定性结构域(例如折叠子部分)的需要。

序列信息

研究基于小规模瞬时转染中的表达产量。将能够表达相关构建体的质粒转化到NEB5α大肠杆菌细胞中，并在LB+羧苄青霉素琼脂平板上选择。通过用细菌菌落接种TB培养基并再用50ug/mL羧苄青霉素选择来制备1mL培养物。按照其方案将Qiagen Mini Prep试剂盒用于纯化来自大肠杆菌培养物的质粒。将Expi293F

转染前一天，以2E6个细胞/mL的浓度接种细胞。转染当天，通过带有台盼蓝的Countess II(ThermoFisher)对细胞计数以确定细胞存活率。将细胞浓度调节至2.5E6个细胞/mL，并将细胞以1mL体积平铺到未处理的12孔板(Corning)中。按照制造商的说明，使用Expifectamine

将含有DS-Cav1-I53-50A构建体的过滤上清液变性，并在含2巯基乙醇的2xLaemmli缓冲液中于95℃下煮沸10分钟。SDS-PAGE分离了样品级分，然后将其转移到硝酸纤维素膜上，并先用帕利珠单抗探测，再用二抗(与HRP共轭的抗人抗体)探测。使用ClarityWestern ECL印迹底物(Bio-Rad)对印迹成像。

将含有DS-Cav1-I53-50A构建体的滤过上清液以两倍稀释系列与Nunc MaxiSorp

融合前特异性单克隆抗体(mAb)D25的表达产量和结合(数据未显示)表明所有构建体表达良好并且处于融合前构象。本领域技术人员将预期，异源三聚化结构域(例如折叠子)将需要用于融合前F构建体的正确表达和折叠。我们的结果表明I53-50A纳米结构组分可以支持DS-Cav1的表达和正确折叠，而无需使用三聚化结构域(例如折叠子)。D25与这些构建体的结合表明它们具有完整的抗原性，并预期诱导有效的免疫应答(包括中和抗体)，类似于包含DS-Cav1-折叠子-I53-50融合多肽的纳米结构。

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该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：N·P·金;D·贝克;B·尼克森;L·J·斯图尔特;L·佩雷斯;A·兰扎韦基亚;J·马坎达力;
专利申请人：华盛顿大学;生物医学研究所;

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