一种自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于水凝胶制备技术领域，具体涉及一种自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶及其制备方法。

背景技术

皮肤组织缺失是是临床医学中普遍存在的问题，创伤、烧伤或慢性疾病都会导致患者皮肤伤口缺损或破裂。然而，一些表现出不规则破裂形状的伤口，特别是组织塌陷，甚至形成空腔的严重皮肤伤口愈合困难，传统伤口敷料难以从新愈合的不规则伤口表面移除和清理，进而导致皮肤组织受到二次创伤。

水凝胶因组织样弹性、潮湿的伤口界面环境、气体交换和吸收伤口渗出物等优点得到了广泛关注。其中，可注射水凝胶允许通过针头注射填充不规则或深层伤口，并在生理条件下自由成形，被认为是通过微创治疗方法修复伤口的最有前景的下一代生物材料。基于天然大分子衍生物的可注射水凝胶虽然具有优异的生物降解性，但受到批次间性能差异和潜在免疫原性的限制。而合成水凝胶虽然具有稳定的物理化学性质，但生物相容性和生物降解性较差，存在移除操作造成的二次皮肤损伤风险。

作为一种半合成高分子，聚天冬氨酸是一种蛋白质衍生物，既具有稳定的物理化学性质，又具有生物降解性能，此外，聚天冬氨酸及其衍生物降解产生的小分子氨基酸具有非免疫原性，可以促进伤口愈合，最终可以在生理过程中被人体吸收或排出。因此，基于聚天冬氨酸的可注射水凝胶有望克服天然和合成可注射水凝胶的缺陷。虽然，已经报道了一些基于聚氨基酸的水凝胶，但是，由于存在无可注射性能、添加了有毒性物质(如二硫苏糖醇、巯基、丙烯酰胺)等问题，而不适用于可注射、自降解伤口敷料。研发适用于伤口敷料的，同时具有可注射性、自生物降解性、形状适应性、生物相容性和粘附性等综合优点的聚氨基酸水凝胶仍然具有挑战性，需要发展新的策略。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶及其制备方法，用以解决现有的基于聚氨基酸的水凝胶无可注射性能或添加了有毒性物质而引起的不适用于可注射伤口敷料的问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1：将聚氨基酸溶解在磷酸缓冲盐溶液中，得到聚氨基酸溶液；将聚氨基酸衍生物溶解在磷酸缓冲盐溶液中，得到聚氨基酸衍生物溶液；

S2：将催化剂加入到聚氨基酸溶液中，得到混合溶液，随后将聚氨基酸衍生物溶液加入到混合溶液中，混合均匀后得到一种自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶。

进一步地，S2中，所述催化剂为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。

进一步地，所述1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、聚氨基酸溶液和聚氨基酸衍生物溶液的用量比为1mol：(1～3)mol：(1～4)mL：(1～4)mL。

进一步地，S1中，所述聚氨基酸为聚天冬氨酸；所述聚氨基酸衍生物为聚天冬酰肼；

所述聚氨基酸溶液的质量浓度为2％～8％；所述聚氨基酸衍生物溶液的质量浓度为2％～8％；所述磷酸缓冲盐溶液的pH值为7～8。

进一步地，S1中，所述聚天冬氨酸的制备方法，包括以下步骤：

S11：将L-天冬氨酸和晶体磷酸混合后进行反应，得到聚琥珀酰亚胺；随后将聚琥珀酰亚胺溶于N‘N-二甲基甲酰胺中，依次进行沉淀、洗涤、干燥处理，得到聚琥珀酰亚胺；

S22：将聚琥珀酰亚胺加入到氢氧化钠溶液中，调节pH值后，得到反应溶液；将反应溶液进行透析、干燥后，得到聚天冬氨酸。

进一步地，S11中，所述反应的温度为180～200℃，反应的时间为7～14h；所述L-天冬氨酸、晶体磷酸和N‘N-二甲基甲酰胺的用量比为0.2mol：0.31mol：(200～400)mL；所述沉淀是采用蒸馏水进行沉淀；所述洗涤是洗涤直至洗涤液呈中性；所述干燥的温度为40～60℃，时间为12h～48h。

进一步地，S11中，所述反应的温度为180～200℃，反应的时间为7～14h；所述L-天冬氨酸、晶体磷酸和N‘N-二甲基甲酰胺的用量比为0.2mol：0.31mol：(200～400)mL；所述沉淀是采用蒸馏水进行沉淀；所述洗涤是洗涤直至洗涤液呈中性；所述干燥的温度为40～60℃，时间为12～48h。

进一步地，S22中，所述L-天冬氨酸和氢氧化钠溶液的用量比为0.2mol：(30～50)mL；所述调节pH值是采用盐酸调节pH值直至中性；所述透析的时间为1～3天；所述干燥是在冷冻干燥机中干燥1～3天。

进一步地，S1中，所述聚天冬酰肼的制备方法，包括以下步骤：

将聚琥珀酰亚胺加入到N‘N-二甲基甲酰胺中，随后加入水合肼在水浴条件下进行反应，反应结束后得到反应产物；将反应产物真空抽滤并用丙酮洗涤得到固体产物；将固体产物在烘干箱中进行干燥后，溶于蒸馏水中进行透析，随后在冷冻干燥机中进行干燥后，得到聚天冬酰肼。

进一步地，所述水合肼溶液的浓度为30mmol/L；所述聚琥珀酰亚胺、N‘N-二甲基甲酰胺和水合肼溶液的用量比为31mmol：(25～30)mL：30mmol；所述反应的温度为40～50℃，时间为4～5h；所述在烘干箱中进行干燥的温度为45～50℃；所述在冷冻干燥机中进行干燥的时间为1～3天。

本发明还公开了采用上述制备方法制备得到的一种自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶的制备方法，在制备的过程中，采用了聚氨基酸和聚氨基酸衍生物作为原料进行制备，由于聚氨基酸具有获取方便、成本较低、优异的生物降解性和良好的生物相容性等优点，并且在所述聚氨基酸水凝胶中同时引入了化学键(酰胺键)和物理键(离子键、氢键)的多重交联，从而赋予了该水凝胶优异的自溶解降解性能，作为伤口敷料可以避免因二次去除造成的伤口破坏，基于聚氨基酸衍生物的加入使该水凝胶同时拥有天然水凝胶和合成水凝胶的优势；另外，通过生物相容性催化剂EDC/NHS可以使修饰在PASP大分子链上的羧基(-COOH)与修饰在PAHy大分子链上的氨基(-NH2)反应形成动态化学键(酰胺键)，耦合羧基与氨基之间的物理键(离子键和氢键)，形成多级动态交联体系，提升该水凝胶的稳定性；采用EDC/NHS作为催化剂，可以使羧基和氨基相互反应生成酰胺键，EDC可以与PASP上的羧基反应形成酸酐，而生成的酸酐易与聚天冬氨酸的羧基继续反应生成不稳定的酯基，此中间产物非常不稳定容易分解，因此加入NHS可得到亚稳态的中间产物，再与PAHy上的氨基反应生成酰胺键。因此，在EDC/NHS催化作用下，PASP上的羧基与PAHy上的氨基反应交联形成三维网络结构的聚氨基酸水凝胶，而催化剂EDC/NHS的量决定着水凝胶的交联度，催化剂的量越多活化的羧基越多，则交联度就越高，可以通过改变催化剂EDC/NHS的量，进而改变水凝胶的交联度，寻找到合适的匹配皮肤组织修复愈合的材料；最后，以磷酸缓冲盐溶液为分散介质，完美适配伤口处的生理环境。

本发明还公开了采用上述制备方法制备得到的自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶，该水凝胶可通过针管注射到大鼠皮肤全层创伤模型创口处，具有完美适配不规则空腔的特性，同时在使用过程中具有良好的生物相容性和生物降解性能；根据相关实验结果表明，本发明制备得到的可注射自溶性降解的聚氨基酸水凝胶可以加速伤口愈合过程，促进皮肤组织再生，而不需要添加任何外源性生物活性因子，并且可以在伤口基本愈合后自溶性崩解，避免伤口敷料的移除造成的创伤，为同时具有有效避免皮肤组织缺陷修复中敷料移除引起的二次损伤以及自主性为伤口愈合提供营养的多功能敷料的制备奠定了基础，且可注射用于不规则和塌陷伤口敷料，具有广阔的应用前景。同时，本发明保证了自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶的自溶性降解行为，其特征是在生物降解10-14天后自动崩解降解。这种崩解的自溶性降解行为的优点是，可以在初始阶段保持一定的形状，为伤口愈合提供安全和潮湿的环境，随后在伤口基本愈合后因自溶性崩解而完全降解，该独特的自溶崩解行为不但有效避免了伤口愈合后因敷料移除而造成的二次创伤，而且从聚氨基酸水凝胶中生物降解的小分子可以促进伤口愈合。从而避免了现有聚氨基酸水凝胶由于存在无可注射性能、添加了有毒性物质(如二硫苏糖醇、巯基、丙烯酰胺)等问题，难以应用于可注射、自降解伤口修复的缺陷。

附图说明

图1为自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶以及PASP及其衍生物PAHy粉末的红外光谱图；

图2为不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

图3为不同实施例制备得到的的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

图4为不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

图5不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

图6为不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

图7为不同实施例制备得到的自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶注射在一块猪皮表面上创造的不规则的三角形伤口中并粘附在伤口的展示照片；

图8为不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

图9为不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

图10为不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

具体实施方式

为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。

本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。

本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)。

本文中，若无特别说明，“包含”、“包括”、“含有”、“具有”或类似用语涵盖了“由……组成”和“主要由……组成”的意思，例如“A包含a”涵盖了“A包含a和其他”和“A仅包含a”的意思。

本文中，为使描述简洁，未对各个实施方案或实施例中的各个技术特征的所有可能的组合都进行描述。因此，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，各个实施方案或实施例中的各个技术特征可以进行任意的组合，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中使用本领域常规的仪器设备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中使用各种原料，除非另作说明，都使用常规市售产品，其规格为本领域常规规格。在本发明的说明书以及下述实施例中，如没有特别说明，“％”都表示重量百分比，“份”都表示重量份，比例都表示重量比。

实施例1

一种可注射自溶性降解的聚氨基酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1：将0.2mol的L-天冬氨酸和0.31mol的晶体磷酸加入到500ml的圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪在180℃高温下进行反应7h，得到聚琥珀酰亚胺；将聚琥珀酰亚胺溶于300mL的N‘N-二甲基甲酰胺(DMF)中，用冷蒸馏水沉淀，洗涤至中性pH放入真空干燥箱，在40℃下干燥48h，得到聚琥珀酰亚胺；

将聚琥珀酰亚胺加入到30mL的氢氧化钠溶液中，室温下搅拌至溶解，再用盐酸调节pH值至中性，得到反应溶液；将反应溶液移到透析袋中透析3天，每天更换3次新的蒸馏水，透析完后在冷冻干燥机中干燥3天得到聚天冬氨酸；

将31mmol的聚琥珀酰亚胺加入到25mL的DMF中，室温下搅拌至溶解，随后加入由30mmol和5mLDMF组成的水合肼溶液在40℃的水浴条件下进行反应4h，反应结束后得到反应产物；将反应产物真空抽滤并用丙酮洗涤3次得到固体产物；将固体产物在45℃的烘干箱中进行干燥后，之后将干燥好的固体聚天冬酰肼溶于蒸馏水中，并转移至透析袋中，透析3天，每天更换3次新的蒸馏水，透析完后在冷冻干燥机中干燥3天得到聚天冬酰肼；

将0.07g聚天冬氨酸溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH＝7.4)中，得到质量浓度为4％的聚天冬氨酸溶液；将0.06g聚天冬酰肼溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH＝7.4)中，得到质量浓度为4.7％的聚天冬酰肼溶液；

在37℃下，通过针头将1.5mL的聚天冬酰肼溶液注射到小瓶中，随后加入0.01917g的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.01150的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，再将1.5mL的聚天冬酰肼溶液加入到小瓶中，利用涡旋仪震荡混合均匀，其中EDC/NHS摩尔比为1：1，得到一种可注射自溶性降解的聚氨基酸水凝胶(EN

实施例2

一种可注射自溶性降解的聚氨基酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1：将0.2mol的L-天冬氨酸和0.31mol的晶体磷酸加入到500ml的圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪在190℃高温下进行反应10h，得到聚琥珀酰亚胺；将聚琥珀酰亚胺溶于200mL的N‘N-二甲基甲酰胺(DMF)中，用冷蒸馏水沉淀，洗涤至中性pH放入真空干燥箱，在50℃下干燥12h，得到聚琥珀酰亚胺；

将聚琥珀酰亚胺加入到35mL的氢氧化钠溶液中，室温下搅拌至溶解，再用盐酸调节pH值至中性，得到反应溶液；将该溶液移到透析袋中进行透析1天，每天更换3次新的蒸馏水，透析完后在冷冻干燥机中干燥1天得到聚天冬氨酸；

将31mmol的聚琥珀酰亚胺加入到30mL的DMF中，室温下搅拌至溶解，随后加入由30mmol和5mLDMF组成的水合肼溶液在40℃的水浴条件下进行反应5h，反应结束后得到反应产物；将反应产物真空抽滤并用丙酮洗涤3次得到固体产物；将固体产物在50℃的烘干箱中进行干燥后，将干燥好的固体聚天冬酰肼溶于蒸馏水中，并转移至透析袋中，透析1天，每天更换3次新的蒸馏水，透析完后在冷冻干燥机中干燥3天得到聚天冬酰肼；

将0.07g聚天冬氨酸溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH＝7.4)中，得到质量浓度为4％的聚天冬氨酸溶液；将0.06g聚天冬酰肼溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH＝7.4)中，得到质量浓度为4.7％的聚天冬酰肼溶液；

在37℃下，通过针头将1.5mL的聚天冬酰肼溶液注射到小瓶中，随后加入0.02875g的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.01725mmol的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，再将1.5mL聚天冬酰肼溶液加入到小瓶中，利用涡旋仪震荡混合均匀，其中EDC/NHS摩尔比为1：1，得到一种可注射自溶性降解的聚氨基酸水凝胶(EN

实施例3

一种可注射自溶性降解的聚氨基酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1：将0.2mol的L-天冬氨酸和0.31mol的晶体磷酸加入到500ml的圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪在200℃高温下进行反应10h，得到聚琥珀酰亚胺；将聚琥珀酰亚胺溶于400mL的N‘N-二甲基甲酰胺(DMF)中，用冷蒸馏水沉淀，洗涤至中性pH放入真空干燥箱，在60℃下干燥24h，得到聚琥珀酰亚胺；

将聚琥珀酰亚胺加入到50mL的氢氧化钠溶液中，室温下搅拌至溶解，再用盐酸调节pH值至中性，得到反应溶液；将该溶液移到透析袋中进行透析3天，每天更换3次新的蒸馏水，透析完后在冷冻干燥机中干燥3天得到聚天冬氨酸；

将31mmol的聚琥珀酰亚胺加入到30mL的DMF中，室温下搅拌至溶解，随后加入由30mmol和5mLDMF组成的水合肼溶液在50℃的水浴条件下进行反应4h，反应结束后得到反应产物；将反应产物真空抽滤并用丙酮洗涤3次得到固体产物；将固体产物在50℃的烘干箱中进行干燥后，将干燥好的固体聚天冬酰肼溶于蒸馏水中，并转移至透析袋中，透析3天，每天更换3次新的蒸馏水，透析完后在冷冻干燥机中干燥3天得到聚天冬酰肼；

将0.07g聚天冬氨酸溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH＝8)中，得到质量浓度为6.5％的聚天冬氨酸溶液；将0.06g聚天冬酰肼溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH＝8)中，得到质量浓度为7.8％的聚天冬酰肼溶液；

在37℃下，通过针头将1.5mL的聚天冬酰肼溶液注射到小瓶中，随后加入0.03834g的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.02300g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，再将1.5mL的聚天冬氨酸溶液加入到小瓶中，利用涡旋仪震荡混合均匀，其中EDC/NHS摩尔比为1：1，得到一种可注射自溶性降解的聚氨基酸水凝胶(EN

实施例4

一种可注射自溶性降解的聚氨基酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1：将0.2mol的L-天冬氨酸和0.31mol的晶体磷酸加入到500ml的圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪在180℃高温下进行反应14h，得到聚琥珀酰亚胺；将聚琥珀酰亚胺溶于200mL的N‘N-二甲基甲酰胺(DMF)中，用冷蒸馏水沉淀，洗涤至中性pH放入真空干燥箱，在40℃下干燥48h，得到聚琥珀酰亚胺；

将聚琥珀酰亚胺加入到50mL的氢氧化钠溶液中，室温下搅拌至溶解，再用盐酸调节pH值至中性，得到反应溶液；将该溶液移到透析袋中进行透析3天，每天更换3次新的蒸馏水，透析完后在冷冻干燥机中干燥3天得到聚天冬氨酸；

将31mmol的聚琥珀酰亚胺加入到30mL的DMF中，室温下搅拌至溶解，随后加入由30mmol和5mLDMF组成的水合肼溶液在50℃的水浴条件下进行反应4h，反应结束后得到反应产物；将反应产物真空抽滤并用丙酮洗涤3次得到固体产物；将固体产物在45℃的烘干箱中进行干燥后，将干燥好的固体聚天冬酰肼溶于蒸馏水中，并转移至透析袋中，透析3天，每天更换3次新的蒸馏水，透析完后在冷冻干燥机中干燥3天得到聚天冬酰肼；

将聚天冬氨酸溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH＝7.4)中，得到质量浓度为8％的聚天冬氨酸溶液；将聚天冬氨酸溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH＝7.4)中，得到质量浓度为6.5％的聚天冬氨酸溶液；

在37℃下，通过针头将1mL的聚天冬酰肼溶液注射到小瓶中，随后加入0.01917g的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.0345g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，再将4mL的聚天冬氨酸溶液加入到小瓶中，利用涡旋仪震荡混合均匀，其中EDC/NHS摩尔比为1：3，得到一种可注射自溶性降解的聚氨基酸水凝胶。

将实施例1制备得到的聚氨基酸、聚氨基酸衍生物和聚氨基酸水凝胶利用红外光谱仪进行测试。首先将在真空冷冻干燥机中冷冻干燥得到的聚氨基素水凝胶研磨成粉末，再将PASP、PAHy、PASP-PAHy水凝胶的干燥粉末分别和干燥的KBr粉末压片，然后再使用红外光谱仪进行测试得到它们各自的红外光谱图。从图1中可以看出，PASP上的羧基(-COOH)对应的特征峰1398cm-1在形成水凝胶后有所减弱。而且，聚天冬酰肼上的氨基(-NH与-NH2)对应的特征峰分别在3282cm-1和3066cm-1处，在形成水凝胶后这些峰都有明显地减弱。另外，水凝胶结构中酰胺键的(CO-NH)伸缩振动在1680cm

将不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

将不同交联度的水凝胶EN

从图3中可以看出，随着交联度的降低，水凝胶的溶胀率增加，导致高吸水率。这说明该水凝胶具有显著的水溶液吸收倾向，尤其是低交联水凝胶，这意味着它们有利于通过吸收伤口组织的多余渗出物促进伤口愈合过程。

图4为不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

将不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

将不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

将不同实施例制备得到的自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶原位注射至在一块猪的表皮上创造的一个不规则的三角形伤口中，25s左右迅速成胶。然后从各个不同方向使劲扭转附有凝胶的猪皮，从图7可以看出水凝胶与猪皮组织紧紧贴附，不会脱离皮肤组织，说明该水凝胶拥有良好的粘附性能。水凝胶的可注射性能以及良好的粘附性能在其作为医用伤口敷料中有重大作用。

将不同实施例制备得到的不同交联度自溶性降解的可注射聚氨基酸水凝胶(EN

为了进一步量化该水凝胶对伤口愈合的效果，固定时间点记录了每只大鼠的伤口面积，并计算了伤口面积的愈合率。从图9中的数据可以看出，该聚氨基酸水凝胶EN

待大鼠的伤口完全愈合至第14天后，将愈合部分新长出的组织切除下来，做组织切片染色实验，分别用苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin，H&E)染色和Masson三色(Masson，s trichrome，MT)染色，然后我们在荧光显微镜下进行组织学观察，并拍照记录(如图10)。从图中的H&E染色照片可以看出，与对照组相比，水凝胶覆盖的伤口组织的新的上皮组织已经完全形成(从图10的左边竖行的图片可以观察到)，而且有更多新血管的形成(从图10的中间竖行的图片可以观察到，红色箭头为新生血管)，这些上皮组织和新血管的出现都有助于伤口肉芽组织的形成，从而促进大鼠的伤口愈合速度。从图10中的Masson三色染色照片可以看出，实验组与对照组均无明显地炎症反应，与对照组相比，水凝胶EN

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。