基于核酸外切酶Ⅲ的荧光分析法检测黄曲霉毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种基于核酸外切酶Ⅲ的荧光分析法检测黄曲霉毒素的方法，用于检测黄曲霉毒素B

背景技术

黄曲霉毒素B

长期以来，科研工作者为AFB

近年来，核酸适配体受到科学家的广泛关注，核酸适配体(核酸适体)1990年由Ellington等提出，是采用指数富集的配体系统进化技术从体外人工合成的单链核酸文库中筛选出与靶物质高特异性﹑高亲和力结合的寡核苷酸片段，其特定的三维结构可与靶标高特异性、高亲和力结合，与抗体相比,适配体具有生产方便、成本低﹑热稳定好、易化学合成、易与多种官能团修饰、高亲和合力和高特异性等优点，在食品安全检测、环境污染物监测以及临床诊断方面得到广泛的关注。目前基于适配体技术的均相检测方法有比色法、荧光法、电化学等。

基于适配体的信号放大主要是核酸酶信号放大技术，包括限制性核酸内切酶，核酸外切酶和核酸酶等。因此筛选高亲和力的适配体是开发高灵敏特异的霉菌毒素检测技术的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于核酸外切酶Ⅲ的荧光分析法检测黄曲霉毒素的方法，实现黄曲霉毒素B

为解决上述技术问题，本发明基于核酸外切酶Ⅲ的荧光分析法检测黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：

(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段：

设计一段能够对AFB

模板DNA：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGC

GATGTTTCTTAGCGCCGTTGGGCACGTGTTG

TCTCTCTCTCTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’

互补DNA：5’-TGTGGGCCTAGCGAAGGGCACGAGAGAGA

GAGAGACAACACGTGCCCAACGGCGCTAA

GAAACATCGCCACGGGGAAGGCGTACTCGCG-3’

上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’

下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’。

(2)核酸外切酶Ⅲ对DNA的剪切：

把模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，加入检测样品，然后混合液在恒温金属浴中37℃下处理30min，在AFB

(3)AFB

加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR，测定检测样品AFB

所述线性方程通过以下方法建立：

将模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，然后再依次加入AFB

AFB

取5个PCR管，将模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，分装在不同的PCR管中，然后在PCR管中分别加入10ng/mLAFB

本发明反应中加入外切酶的作用，使反应的步骤简单很多步，没有核酸的生物素化，PCR管子的亲和素包裹等多个过程，相对于非均相反应，本发明属于均相反应。本发明主要两个步骤就可以实现：第一步，核酸和汞离子反应；第二步，继续和外切酶反应，然后就可以实现信号的检测了。没有了核酸的生物素化，PCR管子的亲和素包裹等以及多个过程。由于检测步骤的减少，特别是减少了本来每个反应步骤后的洗涤过程，洗涤过程会影响检测的效果，本专利连洗涤的过程也不需要的，故检测中的损失几乎没有。

本发明方法实现黄曲霉毒素B

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为通过扩增曲线图得到AFB

具体实施方式

(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段。

设计一段能够对AFB

模板DNA：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGC

GATGTTTCTTAGCGCCGTTGGGCACGTGTTG

TCTCTCTCTCTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’

互补DNA：5’-TGTGGGCCTAGCGAAGGGCACGAGAGAGA

GAGAGACAACACGTGCCCAACGGCGCTAA

GAAACATCGCCACGGGGAAGGCGTACTCGCG-3’

上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’

下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’

(2)核酸外切酶Ⅲ对DNA的剪切。

首先把模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，加入检测样品(AFB

(3)核酸适配体杂交反应及标准曲线的建立；

核酸适配体杂交反应：将模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，然后再依次加入AFB

(4)AFB

取5个PCR管，将模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，分装在不同的PCR管中，然后在PCR管中分别加入10ng/mLAFB

(5)实际添加样品的测定。

向自来水样品中分别添加0.1、1、5、10nM的AFB

表1自来水样品添加AFB

由表1可知，采用基于核酸外切酶Ⅲ的荧光分析法检测黄曲霉毒素的方法测定实际样本中的AFB

上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。