一种玉米ZmCP03基因的应用

技术领域

本发明属于玉米抗旱技术领域，具体涉及一种玉米ZmCP03基因的应用。

背景技术

玉米是重要的粮食、饲料和能源作物，随着人口的増加和工业的发展，对玉米的需求量不断增加。玉米产量的安全问题是国之大事,而干旱胁迫又频频严重发生,导致产量下降,要减少或解决这个问题,必须培育出抗旱型新品种。干旱胁迫已然成为影响玉米生长发育和产量最重要的非生物胁迫之一。挖掘优良抗旱基因,通过转基因或者分子辅助育种,将抗旱基因导入到骨干自交系中，从而有效提高玉米的抗旱性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种玉米ZmCP03基因的应用，该玉米ZmCP03基因在玉米植株中过表达，用于提高玉米抗旱性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种玉米ZmCP03基因的应用，所述玉米ZmCP03基因在玉米植株中过表达，用于提高玉米抗旱性；所述玉米ZmCP03基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述玉米ZmCP03基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述玉米ZmCP03基因在玉米植株中过表达的方法为：

S1、ZmCP03基因的克隆：

S101、选择玉米B73自交系为实验材料，提取三叶期玉米叶片组织RNA，并反转录成cDNA；

S102、以S101中得到的cDNA为模板，用引物ZmCP03-F和引物ZmCP03-R为引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

所述PCR扩增的反应体系为：cDNA 1μL、KOD高保真酶1μL、引物ZmCP03-F 1μL、引物ZmCP03-R 1μL、buffer 5μL、dNTP mix 10μL、无菌水补足至50μL；

所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸64s，共30个循环后，加入0.5μL的Taq酶，72℃延伸10min；

所述引物ZmCP03-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述引物ZmCP03-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

S103、将S102中得到的PCR产物用胶回收试剂盒进行切胶回收后，与载体pCambia3300连接，然后转化到大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，用Xba I/BamH I进行双酶切验证，筛选取1～3个阳性条带对应的菌液，测序；

S2、ZmCP03基因的生物信息学分析：

将S103中测序的结果经过Mega4.0软件与玉米ZmCP03基因的核苷酸序列比对，若核苷酸序列相同，即为克隆成功，克隆成功的S102中所述PCR产物即为ZmCP03目的基因片段；

S3、玉米ZmCP03基因过表达载体的构建：

将载体pCambia3300用BsaI/Eco31I进行双酶切，得到pCambia3300载体大片段；将S3中所述ZmCP03目的基因片段用BsaI/Eco31I进行双酶切，得到P-rDNAo1目的片段，电泳验证片段大小后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒将酶切电泳产物回收后，将所述pCambia3300载体大片段和所述P-rDNAo1目的片段在T4连接酶的作用下，在温度为37℃的条件下连接反应1h，得到连接产物；

所述连接反应的体系为：pCambia3300载体大片段3μL、P-rDNAo1目的片段5μL、T4DNA连接酶1μL、10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL、无菌水1μL；

将得到的连接的产物转化大肠杆菌感受态细胞，将转化菌液涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上，在温度为37℃的条件下培养12h后，挑选阳性克隆进行培养，进行菌斑PCR鉴定，得到玉米ZmCP03基因过表达载体，即pCambia3300-ZmCP03质粒；

S4、ZmCP03基因的玉米遗传转化：

用S3中得到的pCambia3300-ZmCP03质粒转化农杆菌，侵染玉米自交系B104幼胚的幼胚，经过诱导培养、共培养培养、筛选培养、分化培养、生根培养和移栽成苗，得到ZmCP03转基因的阳性植株；

S5、ZmCP03转基因的阳性植株的鉴定：S4中得到的ZmCP03转基因的阳性植株进行行ZmCP03基因PCR检测，在1059bp的位置扩增出与阳性对照S3中所述pCambia3300-ZmCP03质粒中大小一致的一条带，测序后序列比对正确，则为玉米ZmCP03基因过表达植株。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明的玉米ZmCP03基因在玉米植株中过表达，用于提高玉米抗旱性。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明的实施例3的ZmCP03-OE过表达植株中ZmCP03表达水平检测。

图2本发明的实施例3的ZmCP03-OE过表达转基因植株抗旱性图。

图3本发明的实施例3的ZmCP03-OE过表达转基因植株干旱胁迫下生存率图。

图4本发明的实施例4的基因编辑敲除突变体ZmCP03-KO中ZmCP03基因序列分析。

图5本发明的实施例4的基因编辑敲除突变体ZmCP03-KO抗旱性图。

图6本发明的实施例4的基因编辑敲除突变体ZmCP03-KO干旱胁迫下生存率图。

具体实施方式

实施例1

本实施例的玉米ZmCP03基因的应用，所述玉米ZmCP03基因在玉米植株中过表达，用于提高玉米抗旱性；所述玉米ZmCP03基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述玉米ZmCP03基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述玉米ZmCP03基因在玉米植株中过表达的方法为：

S1、ZmCP03基因的克隆：从玉米数据库检索获取ZmCP03的生物学信息，转录本ID为GRMZM2G072448；

S101、选择玉米B73自交系为实验材料，提取三叶期玉米叶片组织RNA，并反转录成cDNA；

S102、以S101中得到的cDNA为模板，用引物ZmCP03-F和引物ZmCP03-R为引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

所述PCR扩增的反应体系为：cDNA 1μL、KOD高保真酶1μL、引物ZmCP03-F 1μL、引物ZmCP03-R 1μL、buffer 5μL、dNTP mix 10μL、无菌水补足至50μL；

所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸64s，共30个循环后，加入0.5μL的Taq酶，72℃延伸10min；

所述引物ZmCP03-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述引物ZmCP03-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

S103、将S102中得到的PCR产物用胶回收试剂盒进行切胶回收后，与载体pCambia3300连接，然后转化到大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，用Xba I/BamH I进行双酶切验证，筛选取1～3个阳性条带对应的菌液，测序；

S2、ZmCP03基因的生物信息学分析：

将S103中测序的结果经过Mega4.0软件与玉米ZmCP03基因的核苷酸序列(SEQ IDNO:1)比对，若核苷酸序列相同，即为克隆成功，克隆成功的S102中所述PCR产物即为ZmCP03目的基因片段；

经序列分析发现ZmCP03基因编码区全长1059bp，共计编码352个氨基酸，pI为8.02，Mw为38.089kD；

S3、玉米ZmCP03基因过表达载体的构建：

将载体pCambia3300用BsaI/Eco31I进行双酶切，得到pCambia3300载体大片段；将S3中所述ZmCP03目的基因片段用BsaI/Eco31I进行双酶切，得到P-rDNAo1目的片段，电泳验证片段大小后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒将酶切电泳产物回收后，将所述pCambia3300载体大片段和所述P-rDNAo1目的片段在T4连接酶的作用下，在温度为37℃的条件下连接反应1h，得到连接产物；

所述连接反应的体系为：pCambia3300载体大片段3μL、P-rDNAo1目的片段5μL、T4DNA连接酶1μL、10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL、无菌水1μL；

将得到的连接的产物转化大肠杆菌感受态细胞，将转化菌液涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上，在温度为37℃的条件下培养12h后，挑选阳性克隆进行培养，进行菌斑PCR鉴定，得到玉米ZmCP03基因过表达载体，即pCambia3300-ZmCP03质粒；

S4、ZmCP03基因的玉米遗传转化：

用S3中得到的pCambia3300-ZmCP03质粒转化农杆菌，侵染玉米自交系B104幼胚的幼胚，经过诱导培养、共培养培养、筛选培养、分化培养、生根培养和移栽成苗，得到ZmCP03转基因的阳性植株；

具体的方法为：首先，挑选大小均一的玉米自交系B104幼胚，在无菌操作台中剥取幼胚，34℃高温诱导暗培养3d；再放在培养箱25℃，暗培养7d。将诱导产生的愈伤切去内生芽，接种至继代培养基中25℃暗培养7d，继代两次，备用于农杆菌转化。愈伤组织置于无菌的侵染培养基，洗两次；最后一次洗完倒掉液体加入菌液(OD600＝0.4)，侵染30min；农杆菌侵染后，胚在无菌滤纸上吸干农杆菌，转移至共培养基表面，胚轴端与培养基接触(盾片朝上)，23℃暗培养3d。筛选2次，待长出完整的再生苗后转入生根培养基中，28℃，16h光照，进行生根壮苗，根长至2cm左右，进行炼苗移栽；

S5、ZmCP03转基因的阳性植株的鉴定：S4中得到的ZmCP03转基因的阳性植株进行行ZmCP03基因PCR检测，在1059bp的位置扩增出与阳性对照S3中所述pCambia3300-ZmCP03质粒中大小一致的一条带，测序后序列比对正确，则为玉米ZmCP03基因过表达植株，命名为ZmCP03-OE-30转基因植株。

实施例2

本实施例为实施例1的阴性对照植株的获取方法：

CRISPR/Cas9敲除载体pOSCas9-ZmCP03的构建方法为：

(一)origin-9基因敲除载体构建：

(1)在美国国立信息技术中心(NCBI)的数据库中找到三个敲除的靶位序列片段，如下所示：

靶标1：核苷酸序列为ccgcaacattgagcacatcgagg；

靶标2：核苷酸序列为gtgctgcagcctcataatgctgg；

靶标3：核苷酸序列为cggtggtgacaggctgatgatgg；

并设计与靶序列相连的引物如下：

origin-9-T1+:核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

origin-9-T1-:核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

origin-9-T2+:核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

origin-9-T2-:核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

origin-9-T3+:核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

origin-9-T3-:核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

(2)首先，该基因功能缺失的玉米突变体CRISPR-Cas9定点突变技术创制，利用在线分析软件CRISPR-P(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR/)设计ZmPCP的sgRNA,构建中间载体，再采用同尾酶连接的方法，一次将多个含有靶位点的中间载体片段连入终载体。具体做法如下：

①先将3对载体的引物经PCR合成双链DNA；

PCR反应体系如下：正向引物：5μL；反向引物：5μL；H

PCR程序：95℃预变性10min，55℃变性10min，14℃退火5min

origin-9-T1+和origin-9-T1-合成gRNA-T1片段；

origin-9-T2+和origin-9-T2-合成gRNA-T2片段；

origin-9-T3+和origin-9-T3-合成gRNA-T3片段；

②用Eco31I对origin-9-T1、origin-9-T2、origin-9-T3在37℃进行酶切连接反应2h，分别得到酶切连接产物，分别命名为pSgA(pSgB)-T1载体、pSgA(pSgB)-T2载体和为pSgA(pSgB)-T3载体；

酶切反应体系依次为：

表1 gRNA-T1片段和origin-9-T1的酶切体系

表2 gRNA-T2片段和origin-9-T2的酶切体系

表3 gRNA-T3片段和origin-9-T3的酶切体系

③酶切连接反应之后进行重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆菌落，提取质粒DNA备用。

取一管200μL大肠杆菌感受态细胞DH5a与5μL酶切连接产物混合，冰浴30min；之后迅速置于42℃恒温水浴锅中，热激90s，冰浴2min；再加入500μL LB液体培养基，混匀；然后37℃、200rpm,培养45min，使细胞恢复正常生长状态；最后将菌液均匀涂布于带有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上；30min后，置37℃恒温培养箱，过夜培养。之后筛选阳性克隆子，送去公司测序；

④终载体连接：

采用同尾酶连接的方法，一次性将三个含有靶位点的中间载体连入终载体，首先线性化pOSCas9表达载体和中间载体；

用AscI和EcoRⅠ先后酶切pOSCas9载体；

再分别用不同的酶酶切三个中间载体，即：

用AscⅠ和XbaⅠ酶切pSgA(pSgB)-T1载体；

用NheⅠ+XhoⅠ酶切pSgA(pSgB)-T2载体；

用SalⅠ+EcoRⅠ酶切pSgA(pSgB)-T3载体；

利用T4DNA连接酶连接中间载体和pOSCas9表达载体，构建CRISPR/Cas9敲除载体OsCas9-ZmCP03，连接反应体系如下：

表4 CRISPR/Cas9敲除载体OsCas9-ZmCP03构建的连接反应体系

⑤转化和重组载体的筛选和农杆菌转化

取2-4μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用PCR及质粒DNA双酶切鉴定后，提取质粒DNA。转化农杆菌，并进行菌落PCR验证，然后保菌，于-20℃保存，将CRISPR/Cas9敲除载体pOSCas9-ZmCP03用于转化B104的幼胚，转化方法同实施例1中的pCambia3300-ZmCP03质粒转化B104的幼胚的方法，最终得到基因编辑敲除突变体ZmCP03-KO-3。

实施例3

本实施例为实施例1中的玉米ZmCP03基因过表达植株(ZmCP03-OE-30转基因植株)的耐旱性分析：

通过qRT-PCR实验检测，发现ZmCP03-OE-30转基因植株中ZmCP03基因表达水平显著高于对照B104(图1)。为了确认过表达ZmCP03-OE-30玉米是否比B104玉米抗旱，对两种玉米进行了干旱胁迫处理。正常生长时，土壤水分保持在90-100％，待玉米生长到三叶期时停止浇水。在干旱胁迫之前，B104和过表达ZmCP03-OE-30玉米的长势差别不大，经14天的干旱胁迫后，两者在表型上出现显著差异，B104较过表达ZmCP03-OE-30玉米出现严重的叶片打卷萎蔫和逐渐变黄现象。复水后，过表达ZmCP03-OE-30玉米能够恢复到原来的生长状态，且其存活率显著高于B104，过表达玉米ZmCP03-OE-30较B104具有更强的抗旱性(图2和图3)，说明过表达ZmCP03基因增强玉米抗旱性。

实施例4

本实施例为实施例2中基因编辑敲除突变体ZmCP03-KO-3的抗旱性试验：

为进一步确认ZmCP03基因在抗旱中的功能，我们通过基因编辑技术敲除ZmCP03基因。通过测序分析，发现ZmCP03基因中2个位点被敲除成功。其中一个位点缺失一个大片段，另一个位点缺失一个碱基，导致该基因功能丧失(图4)。为确认B104是否比基因编辑敲除突变体ZmCP03-KO-3玉米抗旱，对两种玉米进行了干旱胁迫处理。正常生长时，土壤水分保持在90-100％，待玉米生长到三叶期时停止浇水。在干旱胁迫之前，B104和基因编辑敲除突变体ZmCP03-KO-3玉米的长势差别不大，经10天的干旱胁迫后，两者在表型上出现显著差异，基因编辑敲除突变体ZmCP03-KO-3玉米较B104出现严重的叶片打卷萎蔫和逐渐变黄现象。复水后，B104能够恢复到原来的生长状态，且其存活率显著高于基因编辑敲除突变体ZmCP03-KO-3，B104较基因编辑敲除突变体ZmCP03-KO-3具有更强的抗旱性(图5和图6)，说明ZmCP03功能缺失导致玉米抗旱性降低。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。