一类具有抗菌用途的化合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一类具有抗菌用途的化合物，具体为N-烯丙基取代的吲哚啉-2-酮-3-肼基二硫代甲酸酯衍生物、制备方法及其在抗菌药物中的应用。

背景技术

抗生素的发现和开发是20世纪最伟大的突破。近年来，由于抗生素的不合理使用等原因，对抗生素产生耐药性的细菌不断出现，使得细菌感染性疾病的治疗难度和成本增加，从而对人类健康构成了严重威胁。作为主要抗生素之一，β-内酰胺类抗生素(青霉素类、卡巴培南类、头孢菌素类和单环内酰胺类)具有广谱、高效和低毒性的特点，因而是临床上最重要和最常用的抗生素之一。但是随着β-内酰胺酶(β-lactamases，BLs)的出现和传播，该类药物的临床应用受到了前所未有的挑战。β-内酰胺酶(MBL)通过催化水解切割β-内酰胺键从而降解β-内酰胺类抗生素从而产生耐药性。

根据氨基酸序列的同源性，β-内酰胺酶可分为A、B、C和D四种类型。A、C和D三类是丝氨酸-β-内酰胺酶，通过活性位点丝氨酸水解而起作用，主要出现在临床相关的TEM、SHV、CTX-M和KPC型变体(A类)、AmpC和质粒编码的CMY型头孢菌素酶(C类)和OXA型酶(氧杂环丙烷酶，D类)。而B类β-内酰胺酶依赖一个或两个锌离子才能水解β-内酰胺环，因此被称为金属-β-内酰胺酶(metallo-β-lactamases，MBLs)。NDM-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1，新德里金属-β-内酰胺酶1)，属于金属-β-内酰胺酶的一员，因为携带金属-β-内酰胺酶的超级细菌感染首先发生于印度新德里而得名。新德里金属-β-内酰胺酶1可以降解几乎所有的β-内酰胺类抗生素(如青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类)，因而它所带来的细菌耐药问题更加严重。携带NDM-1的细菌主要包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌等，往往引起尿路和肺等部位的感染。

通过将开发金属-β-内酰胺酶抑制剂，可以有效抑制超级细菌对β-内酰胺类抗生素的降解，与现有的β-内酰胺类抗生素联用，恢复超级细菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性。尽管文献报道的金属-β-内酰胺酶抑制剂高达500多个,但是没有上市药物，且鲜有进入临床试验的化合物，因此迫切需要研发新结构类型的NDM-1抑制剂，克服β-内酰胺类抗生素耐药，从而满足临床需求。

发明内容

本专利涉及的化合物属于N-烯丙基取代的吲哚啉-2-酮-3-肼基二硫代甲酸酯衍生物，具有明显抑制新德里金属-β-内酰胺酶1(NDM-1)的活性，与美罗培南联用，可恢复产NDM-1酶的大肠杆菌ATCC BAA-2469对美罗培南的敏感性，具有进一步开发的价值。本发明解决的技术问题是克服现有技术中抗耐药菌药物不足的缺陷，提供N-烯丙基取代的吲哚啉-2-酮-3-肼基二硫代甲酸酯类衍生物、制备方法及其抗菌用途。

为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

第一方面，提供了如式(1)所示的化合物：

其中：

R

R

优选地，所述的化合物为式(II)所示的化合物：

其中，R

作为优选，本发明提供的化合物为：

T1：N’-(5-氟-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T2：N’-(6-氟-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T3：N’-(7-氟-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T4：N’-(4,7-二氟-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T5：N’-(5-氯-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T6：N’-(6-氯-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T7：N’-(7-氯-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T8：N’-(5-溴-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T9：N’-(5-碘-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T10：N’-(7-甲基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T11：N’-(5-异丙基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T12：N’-(5-甲氧基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T13：N’-(6-甲氧基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T14：N’-(5-三氟甲氧基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯

T15：N’-(6-三氟甲氧基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯。

第二方面，本发明提供了化合物的制备方法，它包括如下步骤：

其中，式(III)和(IV)中R

(1)在25℃下，在碳酸钾的催化条件下，向装有磁力搅拌子的圆底烧瓶中加入1当量的吲哚啉-2,3-二酮和1-1.2当量的3-溴丙烯,加入2当量的碳酸钾，再滴加溶剂N,N-二甲基甲酰胺。在25℃下搅拌过夜后，加入水，固体析出，抽滤，加水反复淋洗3次，所得滤饼于50℃减压干燥，得中间体IV。

(2)1当量的中间体IV投入装有磁力搅拌子的圆底烧瓶中，加入1-1.1当量的肼基二硫代甲酸酯，加入少量冰醋酸，再加入甲醇。在25℃下搅拌10小时后抽滤，加甲醇反复淋洗3次，所得滤饼于50℃减压干燥，即得终产物I。

第三方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物含有上述的化合物或其立体异构体、或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂、媒介物或赋形剂。

第四方面，本发明提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备新德里金属-β-内酰胺酶1抑制剂中的应用提供了N’-(1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯或其药学上可接受的盐在制备新德里金属-β-内酰胺酶1抑制剂中的应用。

第五方面，本发明提供了一种联合用药物，该联合用药物含有上述的所有化合物或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂、媒介物或赋形剂与β-内酰胺类抗生素。

作为优选，所述的β-内酰胺类抗生素选自青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、硫霉素类、单环β内酰胺类和碳青霉烯类的一种或者多种：厄他培南、美罗培南、多立培南、比阿培南、帕尼培南、替卡西林、氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、哌拉西林、阿洛西林、美洛西林、替卡西林、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟，ceftolozane和头孢他啶。

第六方面，本发明提供了上述的联合用药物在制备抗产NDM-1酶的细菌或超级细菌药物中的应用

优选地，所述的产NDM-1酶的细菌或超级细菌选自大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登斯菌的一种或者多种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

实验首次发现N-烯丙基取代的吲哚啉-2-酮-3-肼基二硫代甲酸酯衍生物具有明显抑制新德里金属-β-内酰胺酶1(NDM-1)的活性，与美罗培南联用，可恢复产NDM-1酶的大肠杆菌ATCC BAA-2469对美罗培南的敏感性。由于该结构类型不同于已报道的NDM-1抑制剂，具有深入研究的价值以及临床应用的潜力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明进行限制。实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

一、新化合物的制备和检测

实施例1：N’-(5-氟-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T1)

向装有磁力搅拌子的100mL圆底烧瓶中加入5-氟吲哚-2,3-二酮(500mg,1eq)和3-溴丙烯(1.1eq),加入碳酸钾(2eq),再滴加溶剂N,N-二甲基甲酰胺10mL。在25℃下搅拌过夜后，加入50mL水，固体析出，抽滤，加水反复淋洗3次，所得滤饼于50℃减压干燥,得中间体5-氟-1-烯丙基-吲哚-2,3-二酮(产率：82％)。

所得5-氟-1-烯丙基-1H-吲哚-2,3-二酮(509mg)，投入装有磁力搅拌子的100mL圆底烧瓶中加入肼基二硫代甲酸甲酯(1.02eq)，加入2μL冰醋酸,再加入8mL甲醇。在25℃下搅拌10小时后抽滤，加甲醇反复淋洗3次，所得滤饼于50℃减压干燥，得目标产物N’-(5-氟-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯660mg。

橙黄色固体，收率86％。ESI-MS(m/z):310.40[M+H]

实施例2：N’-(6-氟-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T2)

以6-氟吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率74％。ESI-MS(m/z):310.47[M+H]

实施例3：N’-(7-氟-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T3)

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以7-氟吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率78％。ESI-MS(m/z):308.55[M-H].

实施例4：N’-(4,7-二氟-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T4)

以4，7-二氟吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率53％。ESI-MS(m/z):350.33[M+Na]

实施例5：N’-(5-氯-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T5)

以5-氯吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率74％。ESI-MS(m/z):348.35[M+Na]

实施例6：N’-(6-氯-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T6)

以6-氯吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率77％。ESI-MS(m/z):326.60[M+H]

实施例7：N’-(7-氯-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T7)

以7-氯吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率65％。ESI-MS(m/z):326.22[M+H]

实施例8：N’-(5-溴-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T8)

以5-溴吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率69％。ESI-MS(m/z):392.42[M+Na]

实施例9：N’-(5-碘-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T9)

以5-碘吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率85％。ESI-MS(m/z):440.45[M+Na]

实施例10：N’-(7-甲基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T10)

以7-甲基吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率78％。ESI-MS(m/z):328.45[M+Na]

实施例11：N’-(5-异丙基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T11)

以5-异丙基吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率82％。ESI-MS(m/z):334.70[M+H]

实施例12：N’-(5-甲氧基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T12)

以5-甲氧基吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率65％。ESI-MS(m/z):382.60[M+Na]

实施例13：N’-(6-甲氧基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T13)

以6-甲氧基吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率82％。ESI-MS(m/z):344.33[M+23]

实施例14：N’-(5-三氟甲氧基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T14)

以5-三氟甲氧基吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率82％。ESI-MS(m/z):376.61[M+H]

实施例15：N’-(6-三氟甲氧基-1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(T15)

以6-三氟甲氧基吲哚-2,3-二酮为起始原料，合成方法同实施例1。

橙黄色固体，收率86％。ESI-MS(m/z):376.67[M+H]

二、结构已公开的化合物Z1的获取和制备

N’-(1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(CAS号：364055-05-0)

实施例1：购买自Compound Handling B.V.(Trade name:Specs)，公司地址为Bleiswijkseweg 55,2712PB Zoetermeer,The Netherlands。其购买编号为：AG-670/33914015

实施例2：合成和结构表征

向装有磁力搅拌子的100ml圆底烧瓶中加入吲哚-2,3-二酮(500mg,1eq)和3-溴丙烯(1.1eq),加入碳酸钾(2eq),再滴加溶剂N,N-二甲基甲酰胺10mL。在25℃下搅拌过夜后，加入50mL水，固体析出，抽滤，加水反复淋洗3次，所得滤饼于50℃减压干燥,得中间体1-烯丙基吲哚-2,3-二酮553mg(产率：87％)。

所得1-烯丙基-1H-吲哚-2,3-二酮，称重，投入装有磁力搅拌子的100mL圆底烧瓶中加入肼基二硫代甲酸甲酯(1.02eq)，加入2μL冰醋酸,再加入8mL甲醇。在25℃下搅拌10小时后抽滤，加甲醇反复淋洗3次，所得滤饼于50℃减压干燥，得目标产物N’-(1-烯丙基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯646mg。

橙黄色固体，收率75％。ESI-MS(m/z):314.31[M+Na]

三、生物活性测定

实验例1：化合物对NDM-1酶的抑制活性测试

1.实验材料与仪器

·96孔紫外分析板：CORNING公司；

·N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸游离酸(HEPES FREE ACID)：美国Amresco公司；

·DMSO：北京伊诺凯科技有限公司；

·美罗培南三水合物：上海毕得医药科技股份有限公司；

·2,6-吡啶二羧酸(DPA)：上海毕得医药科技股份有限公司；

·酶标仪：PerkinElmer公司Enspire 2300Multiabel Reader。

2.实验终体系

·体积200μL，NDM-1酶浓度1nM，美罗培南浓度250μM，50mM HEPES(PH＝7.35),250mM NaCl，10μg/mL BSA，25℃(DMSO含量≤1％)。

3.实验方法

·梯度稀释，抑制剂及阳性化合物DPA设定终浓度：200μM、100μM、50μM、25μM、12.50μM、6.25μM、3.13μM、1.56μM、0.78μM、0.39μM、0.20μM、0.10μM(12个浓度梯度)；

·抑制剂先与NDM-1酶(除底物全部包含)共孵育10min。加入100μL底物，混合均匀，引发反应；

·监测反应，每隔1min测定体系在300nm处的吸光值，25℃下连续检测30min，计算各浓度抑制剂下的酶活性，用GraphPad Prism 8软件拟合IC50(拟合曲线作为原始数据)；

·本实验设置三个复孔。并设置阳性对照组(酶、底物、DPA)，阴性对照组(酶、底物、DMSO)，空白对照组(底物、DMSO)，实验组(酶、底物、抑制剂)。

4.化合物对NDM-1的抑制活性见表1。

实验例2：化合物体外联合用药抗菌活性测试

1.试验菌株及其培养方法

·试验菌株

产NDM-1酶的大肠杆菌ATCC BAA-2469。

·培养基及培养条件

CAMHB肉汤，35-37℃孵育18-20h观察结果。

·培养基的配制

CAMHB肉汤的配制：称取适量的CAMHB干粉，加入适量的纯水，搅拌溶解后121℃，20min高压灭菌，冷却至室温备用。现配现用。

·阳性对照品

VNRX-5133：购自MedChemExpress(MCE)。

2.测试方法

·测定美罗培南对试验菌株的最低抑菌浓度，设定美罗培南终浓度为：128μg/ml、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL。

·测定化合物的最低抑菌浓度，设定终浓度为：32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL。

·测定美罗培南与化合物联用(32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL)时的最低抑菌浓度。

3.化合物与美罗培南联用的抗菌活性见表1。

表1.化合物对NDM1的抑制活性

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