胺脱氢酶突变体及其在手性胺合成中的应用

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，尤其涉及手性化合物的制备。本发明具体涉及一种赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)来源的苯丙氨酸脱氢酶通过分子改造获得的具有胺脱氢酶活性的突变体、含有所述突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及所述突变体或重组表达转化体作为催化剂在羰基化合物不对称还原胺化制备手性胺的应用。

背景技术

手性胺广泛存在于天然活性分子中，也是许多手性药品和精细化学品合成的重要前体。目前，市场上约40％的化学药物都含有一个或多个手性氨基结构砌块，这类药物涉及抗炎、抗阿尔茨海默病、抗抑郁、抗艾滋病等，在医药领域占据着重要地位。由于手性胺类化合物在药物合成中的重要性和巨大价值，其合成技术的开发已成为新药研究领域的热点。

其中，β-氨基酮类化合物是一些天然产物中的重要骨架，其结构很容易的就可以转变为α，β-不饱和羰基化合物，1，3-氨基醇以及其它功能类的化合物，该类化合物具有抗炎、抗癌、抗结核、止痛和止咳等功效，同时也被广泛应用于合成具有生物活性的天然产物和重要的药物分子。β-氨基酮结构中具有两个不同的官能团：羰基和氨基，这就决定了该类化合物具有广泛的药理活性，如解痉挛作用利，尿作用，抗肾上腺素作用，抗糖尿病以及局部麻醉作用等。β-氨基酮的合成方法主要是Mannich反应法。该方式存在需要有毒试剂或剧烈而苛刻的反应条件、环境不友好，副产物多等缺点。迄今为止，尚未有生物法制备β-氨基酮类化合物的相关文献报道。

因此，开发一种绿色高效的，高区域选择性、高立体选择性合成手性胺类化合物，特别是β-氨基酮类化合物的方法是非常必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何利用胺脱氢酶突变体以2-甲基-2-取代-1，3-环戊二酮为底物合成手性(2R,3R)-3-氨基-2-取代-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，或者以(取代)苯基丙酮作为底物合成(R)-1-(取代)苯基-2-丙胺。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一应用：

胺脱氢酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或在对应于SEQ ID NO.1的氨基酸序列的第1至381位中的位点将第51，125，145，157在内的一个或多个位点突变获得的胺脱氢酶突变体；优选地，所述突变选自L51A、T125A、N145L、S157P、T125A/N145L、L51A/T125A/N145L、T125A/N145L/S157P或L51A/T125A/N145L/S157P。

本发明还提供了所述的胺脱氢酶突变体的编码基因，编码基因的表达载体，编码基因的重组细胞。

本发明还提供了以2-甲基-2-取代-1,3-环戊二酮化合物(式I)作为底物合成手性(2R,3R)-3-氨基-2-取代-2-甲基环戊-1-酮(式Ⅱ)及其盐酸盐(式Ⅲ)，同时也可以利用下式Ⅳ(取代)苯基丙酮作为底物合成(R)-1-(取代)苯基-2-丙胺(式Ⅴ)：

具体的，所述催化反应是以表达所述胺脱氢酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-甲基-2-取代-1,3-环戊二酮化合物或者(取代)苯基丙酮为底物，以pH为6.0-11.0的缓冲液作为反应介质，在20℃-50℃条件下进行反应。

优选的，反应体系中的催化底物浓度为1-100g/L，含有菌体量为10-150g/L，反应体系的pH为6.0-9.0，反应温度为25℃-35℃。

在另外的优选方式中，在反应体系还添加有乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、1,4-二氧六环中的一种作为助溶剂。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下面通过具体实施方式对本发明作进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。其中，如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“L51A”表示第51位的亮氨酸L突变为丙氨酸A，以此类推。

在本发明的实施例中，胺脱氢酶突变体的制备方法如下：

(1)胺脱氢酶突变体的基因构建到pET22b(+)表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞(具体为大肠杆菌BL21(DE3))，获得相应的工程菌株。(3)将工程菌株接种至LB培养基中，37℃培养12小时，以接种量1％转接至新的培养基，再培养2小时后加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，25℃培养6-12小时。(4)离心收集菌体。

实施例1:胺脱氢酶酶库的构建

本实验室收集胺脱氢酶酶库共有51种胺脱氢酶。该51种胺脱氢酶基因分别构建到pET22b(+)表达载体上，其酶切位点为Nde I和XhoI，将重组质粒转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中并进行诱导表达。其中包括42种野生胺脱氢酶和9种L-氨基酸脱氢酶突变体。42种野生胺脱氢酶均来自于基因库，以野生胺脱氢酶CfAmDH(来源于Cystobacter fuscus)为模板，通过基因挖掘的方式并选取同源性在30％-60％的序列，从而获得野生胺脱氢酶。另9种L-氨基酸脱氢酶分别按照文献所示，将与氨基酸底物的羧基部分相结合的两个氨基酸残基，分别突变为丝氨酸和亮氨酸后获得。

实施例2:胺脱氢酶酶库的筛选

以2-甲基-2-苄基-1,3-环戊二酮为筛选底物，对胺脱氢酶酶库进行筛选。筛选体系为1mL：底物浓度为5mM，5％ DMF(v/v)，0.5mM NAD

表1 2-甲基-2-苄基-1,3-环戊二酮的筛选结果

实施例3:胺脱氢酶LsAmDH突变位点的选择

利用AlphaFold2(

实施例4：胺脱氢酶LsAmDH饱和突变库的构建

构建胺脱氢酶饱和突变库：以pET-22b-LsAmDHLsAmDH(K79S/N277L)为模板，对51，55，76，94，122，123，125，127，145，157，161，190，194，195，213，214，215，239，253，254，275，276，303，304，307，308，310进行定点突变。设计引物(引物序列见表1)，采用质粒滚环扩增的方法构建突变体，高保真聚合酶KOD-plus进行PCR。PCR反应条件如下：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入5μL 10×KODbuffer，5μL dNTP(2mM)，2μLMgSO

表2饱和突变引物

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表中加粗字体“NNK”代表简并密码子包含了32种密码子组合，覆盖了所有20种氨基酸残基，N＝A/C/G/T，K＝G/T。

实施例5：胺脱氢酶突变体库的诱导以及活性筛选

将上述突变体库中的单菌落分别接入400μL含有氨苄抗生素的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中，于37℃，800rpm摇床中培养过夜，即为种子液。将过夜培养的种子液以10％的接种量转接到800μL含有氨苄抗生素的LB培养基，37℃，800rpm培养至OD600为0.6-0.8左右，加入0.1mM的IPTG，并置于25℃，800rpm诱导8～12h。4℃，4000rpm条件下离心收集菌体。用200μL的2M甲酸铵缓冲液重悬(含有2mg/mL溶菌酶)，37℃，800rpm培养2h后于-80℃冰箱保存。保存10-16h后，室温解冻后，4℃，4000rpm条件下离心30min，破菌上清进行活力检测。

通过检测340nm下NADH吸光值的变化来计算LsAmDH突变体的催化活性，活性检测体系为底物为2-甲基-2-苄基-1,3-环戊二酮，底物浓度为5mM，5％(v/v)DMF，0.5mM NADH，缓冲液为5M pH 9.0甲酸铵缓冲液。

实施例6：LsAmDH突变子的诱导以及复筛测定

将活性提高的单克隆分别接入4mL含有氨苄抗生素的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中，于37℃，200rpm摇床中培养过夜，即为种子液。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到4mL含有氨苄抗生素的LB培养基，37℃，200rpm培养至OD600为0.6-0.8左右，加入0.5mM的IPTG，并置于25℃，200rpm诱导8～12h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体准备复筛。

向1mL 2M甲酸铵缓冲液(pH 9.0)中加入2-甲基-2-苄基-1,3-环戊二酮5mM、5％DMF、0.5mM NAD

表3胺脱氢酶LsAmDH突变子活性及选择性测定

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实施例7：胺脱氢酶及其突变体与甲酸脱氢酶的共表达菌株的构建以及诱导

将LsAmDH突变体和PseFDH-T4分别克隆到pRSFDuet-1载体的限制性内切酶位点NcoI和NotI之间和NdeI和XhoI之间，得到重组质粒pRSFDuet-LsAmDH-pseFDH-T4，进一步转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-LsAmDH-pseFDH-T4。

实施例8：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-N145L催化制备(2R,3R)-3-氨基-2-苄基-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物

按照实施例6中所述，将含有突变体LsAmDH-N145L氨基酸序列为SEQ ID NO.3的菌体，并按照实施例5培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。

向95mL的2M甲酸铵缓冲液(pH 9.0)中加入2-甲基-2-苄基-1,3-环戊二酮(0.202g)、DMF(5mL)、0.04g NAD

实施例9：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A催化制备(2R,3R)-3-氨基-2-(4-甲基苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物

按照实施例6中所述，将含有突变体LsAmDH-T125A氨基酸序列为SEQ ID NO.4的菌体，并按照实施例5培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。按照实施例8中所述，加入底物2-甲基-2-(4-甲基苄基)-1,3-环戊二酮(0.216g)，制备(2R,3R)-3-氨基-2-(4-甲基苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，得白色固体(2R,3R)-3-氨基-2-(4-甲基苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，产量为0.164g，收率65％，de值99％，ee值99％。

实施例10：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A催化制备(2R,3R)-3-氨基-2-(4-氟苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物

按照实施例6中所述，将含有突变体LsAmDH-T125A氨基酸序列为SEQ ID NO.4的菌体，并按照实施例5培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。按照实施例8中所述，加入底物2-甲基-2-(4-氟苄基)-1,3-环戊二酮(0.220g)，制备(2R,3R)-3-氨基-2-(4-氟苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，得白色固体(2R,3R)-3-氨基-2-(4-氟苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，产量为0.180g，收率70％，de值99％，ee值99％。

实施例11：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A催化制备(2R,3R)-3-氨基-2-(4-氯苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物

按照实施例6中所述，将含有突变体LsAmDH-T125A氨基酸序列为SEQ ID NO.4的菌体，并按照实施例5培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。按照实施例8中所述，加入底物2-甲基-2-(4-氯苄基)-1,3-环戊二酮(0.236g)，制备(2R,3R)-3-氨基-2-(4-氯苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，得白色固体(2R,3R)-3-氨基-2-(4-氯苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，产量为0.169g，收率62％，de值99％，ee值99％。

实施例12：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A催化制备(2R,3R)-3-氨基-2-(4-溴苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物

按照实施例6中所述，将含有突变体LsAmDH-T125A氨基酸序列为SEQ ID NO.4的菌体，并按照实施例5培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。按照实施例8中所述，加入底物2-甲基-2-(4-溴苄基)-1,3-环戊二酮(0.280g)，制备(2R,3R)-3-氨基-2-(4-溴苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，得白色固体(2R,3R)-3-氨基-2-(4-溴苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，产量为0.190g，收率60％，de值99％，ee值99％。

实施例13：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(2R,3R)-3-氨基-2-(2-甲基苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物

按照实施例6中所述，将含有突变体LsAmDH-T125A/N145L氨基酸序列为SEQ IDNO.5的菌体，并按照实施例5培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。按照实施例8中所述，加入底物2-甲基-2-(2-甲基苄基)-1,3-环戊二酮(0.216g)，制备(2R,3R)-3-氨基-2-(2-甲基苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，得白色固体(2R,3R)-3-氨基-2-(2-甲基苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，产量为0.177g，收率70％，de值99％，ee值99％。

实施例14：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(2R,3R)-3-氨基-2-(2-氟苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物

按照实施例6中所述，将含有突变体LsAmDH-T125A/N145L氨基酸序列为SEQ IDNO.5的菌体，并按照实施例5培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。按照实施例8中所述，加入底物2-甲基-2-(2-氟苄基)-1,3-环戊二酮(0.220g)，制备(2R,3R)-3-氨基-2-(2-氟苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，得白色固体(2R,3R)-3-氨基-2-(2-氟苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，产量为0.208g，收率81％，de值99％，ee值99％。

实施例15：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(2R,3R)-3-氨基-2-(2-氯苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物

按照实施例6中所述，将含有突变体LsAmDH-T125A/N145L氨基酸序列为SEQ IDNO.5的菌体，并按照实施例5培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。按照实施例8中所述，加入底物2-甲基-2-(2-氯苄基)-1,3-环戊二酮(0.236g)，制备(2R,3R)-3-氨基-2-(2-氯苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，得白色固体(2R,3R)-3-氨基-2-(2-氯苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，产量为0.224g，收率82％，de值99％，ee值99％。

实施例16：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(2R,3R)-3-氨基-2-(2-溴苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物

按照实施例6中所述，将含有突变体LsAmDH-T125A/N145L氨基酸序列为SEQ IDNO.5的菌体，并按照实施例5培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。按照实施例8中所述方法，加入底物2-甲基-2-(2-溴苄基)-1,3-环戊二酮(0.280g)，制备(2R,3R)-3-氨基-2-(2-溴苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，得白色固体(2R,3R)-3-氨基-2-(2-溴苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，产量为0.222g，收率70％，de值99％，ee值99％。

实施例17：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-N145L催化制备(2R,3R)-3-氨基-2-(3-氟苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物

按照实施例6中所述，将含有突变体LsAmDH-N145L氨基酸序列为SEQ ID NO.3的菌体，并按照实施例5培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。按照实施例8中所述方法，加入底物2-甲基-2-(3-氟苄基)-1,3-环戊二酮(0.220g)，制备(2R,3R)-3-氨基-2-(3-氟苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，得白色固体(2R,3R)-3-氨基-2-(3-氟苄基)-2-甲基环戊-1-酮盐酸盐化合物，产量为0.180g，收率70％，de值99％，ee值99％。

实施例18：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(R)-(-)-2-(4-甲氧基苯基)-1-甲基乙胺

按照实施例6中所述，将含有突变体LsAmDH-T125A/N145L氨基酸序列为SEQ IDNO.5的菌体，并按照实施例5培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。

向95mL的1M甲酸铵缓冲液(pH 9.0)中加入对甲氧基苯丙酮(6.56g)、DMF(5mL)、0.04g NAD

实施例19：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(R)-(-)-2-(3-甲氧基苯基)-1-甲基乙胺

按照实施例18中所述方法，加入底物3-甲氧基苯基丙酮(6.56g)，制备(R)-(-)-2-(3-甲氧基苯基)-1-甲基乙胺，产量为5.25g，收率80％，ee值99％。

实施例20：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(R)-(-)-2-(4-甲基苯基)-1-甲基乙胺

按照实施例18中所述方法，加入底物4-甲基苯丙酮(5.92g)，制备(R)-(-)-2-(4-甲基苯基)-1-甲基乙胺，产量为4.77g，收率80％，ee值99％。

实施例21：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(R)-(-)-2-(2-氟苯基)-1-甲基乙胺

按照实施例18中所述方法，加入底物2-氟苯基丙酮(6.08g)，制备(R)-(-)-2-(2-氟苯基)-1-甲基乙胺，产量为4.89g，收率80％，ee值99％。

实施例22：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(R)-(-)-2-(4-氟苯基)-1-甲基乙胺

按照实施例18中所述方法，加入底物4-氟苯基丙酮(6.08g)，制备(R)-(-)-2-(4-氟苯基)-1-甲基乙胺，产量为5.12g，收率85％，ee值99％。

实施例23：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(R)-(-)-2-(2-溴苯基)-1-甲基乙胺

按照实施例18中所述方法，加入底物2-溴苯基丙酮(8.48g)，制备(R)-(-)-2-(2-溴苯基)-1-甲基乙胺，产量为6.42g，收率80％，ee值99％。

实施例24：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(R)-(-)-2-(4-溴苯基)-1-甲基乙胺

按照实施例18中所述方法，加入底物4-溴苯基丙酮(8.48g)，制备(R)-(-)-2-(4-溴苯基)-1-甲基乙胺，产量为6.82g，收率85％，ee值99％。

实施例25：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(R)-(-)-2-(2-氯苯基)-1-甲基乙胺

按照实施例18中所述方法，加入底物2-氯苯基丙酮(6.72g)，制备(R)-(-)-2-(2-氯苯基)-1-甲基乙胺，产量为5.61g，收率83％，ee值99％。

实施例26：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(R)-(-)-2-(3-氯苯基)-1-甲基乙胺

按照实施例18中所述方法，加入底物3-氯苯基丙酮(6.72g)，制备(R)-(-)-2-(3-氯苯基)-1-甲基乙胺，产量为5.41g，收率80％，ee值99％。

实施例27：利用胺脱氢酶突变子LsAmDH-T125A/N145L催化制备(R)-(-)-2-(4-氯苯基)-1-甲基乙胺按照实施例18中所述方法，加入底物4-氯苯基丙酮(6.72g)，制备(R)-(-)-2-(4-氯苯基)-1-甲基乙胺，产量为5.75g，收率85％，ee值99％。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。