一种白芷中10种香豆素类成分的含量测定方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种同时测定白芷中10种香豆素类成分含量的方法。

背景技术

白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根，《神农本草经》列为中品，是常用大宗药食同源中药，在药品、食品、化妆品、保健品领域应用广泛，是解表散寒，祛风止痛，宣通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓的良药。白芷在全国主要分布在四川、安徽、河南、河北等，习称“川白芷”、“亳白芷”、“禹白芷”、“祁白芷”。我国自1963年版始，历版药典中均收载了白芷，其现行标准为《中国药典》2020年版一部，收载了性状、鉴别、检查、含量测定等项目，但是质控指标单一，只有欧前胡素单成分含量测定。又通过市场调研和文献研究，发现白芷质量控制存在以下较大问题。一是现有质量标准质控指标单一，不能反映药材真实质量；二是加工过程中普遍存在硫磺熏蒸问题，安全隐患较大。白芷为根类药材，主要含呋喃香豆素类和挥发性成分，含淀粉也较多，不及时干燥很容易腐烂，因此产地药农习惯硫磺熏蒸，但是众多研究发现，白芷中主要香豆素类活性成分熏硫后损失较大，进而影响其镇痛药理活性。

发明内容

鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，本发明提供了一种白芷中10种香豆素类成分的含量测定方法，采用甲醇进行提取，并采用HPLC法进行含量测定，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：称取对照品，精称定，加甲醇制成含花椒毒酚2μg，水合氧化前胡素5μg，白当归素5μg，花椒毒素2μg，佛手柑内酯2μg，白当归脑5μg，氧化前胡素10μg，欧前胡素10μg，珊瑚菜5μg，异欧前胡素10μg的混合溶液作为对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：本品粉末过三号筛后取0.2g，称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，称定重量，超声处理，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(3)测定法吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

色谱条件：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，

流动相A：乙腈，

流动相B：水，

检测波长：254nm，

柱温为30℃，

梯度洗脱，

优选的，理论板数按欧前胡素峰计算不低于5000。

优选的，所述步骤(2)中，超声处理1小时，功率400W，频率50kHz。

本发明的有益效果在于：

中药发挥疗效的成分复杂而多元，质量控制需要以整体观念为指导，与多成分测定有机结合，共同反映药材品质。本方法在前人研究者对白芷中香豆素类成分的测定基础上，建立了一种高效液相色谱法同时测定白芷中10种香豆素类成分的方法，尤其是将不易分离的白当归脑与氧化前胡素成功分离，对白芷的质量控制提供了依据。

本方法采用甲醇进行提取，确保白芷中香豆素类成分的稳定性与准确性，并采用HPLC法进行含量测定，解决了使用同一提取方法、在同一测定系统完成白芷中香豆素类成分含量测定的关键问题。

附图说明

通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明中花椒毒酚成分最大吸收光谱；

图2为本发明中水合氧化前胡素成分最大吸收光谱；

图3为本发明中白当归素成分最大吸收光谱；

图4为本发明中花椒毒素成分最大吸收光谱；

图5为本发明中佛手柑内酯成分最大吸收光谱；

图6为本发明中白当归脑成分最大吸收光谱；

图7为本发明中氧化前胡素成分最大吸收光谱；

图8为本发明中欧前胡素成分最大吸收光谱；

图9为本发明中珊瑚菜素成分最大吸收光谱；

图10为本发明中异欧前胡素成分最大吸收光谱；

图11为本发明中28℃柱温耐用性图谱；

图12为本发明中30℃柱温耐用性图谱；

图13为本发明中32℃柱温耐用性图谱；

图14为本发明中0.9ml/min流速耐用性图谱；

图15为本发明中1.0ml/min流速耐用性图谱；

图16为本发明中1.1ml/min流速耐用性图谱；

图17为本发明中Thermo，C18(5μm,4.6×250mm)色谱柱耐用性图谱；

图18为本发明中Waters Symmtry，C18(5μm,4.6×250mm)色谱柱耐用性图谱；

图19为本发明中COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(5μm,4.6×250mm)色谱柱耐用性图谱；

图20为本发明中资生堂Capcell pak C18 MGⅡ(5μm,4.6×250mm)色谱柱耐用性图谱；

图21为本发明中SHIMADZU VP-ODS C18(5μm,4.6×250mm)色谱柱耐用性图谱；

图22为本发明中Ultimate 3000仪器耐用性图谱；

图23为本发明中Shimadzu LC-20AT仪器耐用性图谱；

图24为本发明中Waters e2695-2998仪器耐用性图谱；

图25为本发明中Agilent 1260仪器耐用性图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

实施例：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为30℃。理论板数按欧前胡素峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备称取对照品适量，精密称定，加甲醇制成含花椒毒酚2μg，水合氧化前胡素5μg，白当归素5μg，花椒毒素2μg，佛手柑内酯2μg，白当归脑5μg，氧化前胡素10μg，欧前胡素10μg，珊瑚菜5μg，异欧前胡素10μg的混合溶液作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率400W，频率50kHz)1小时，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

上述实施例按照药典要求进行了方法学验证，结果显示方法准确可靠、灵敏、专属，各项指标均符合质量控制的要求，该含量测定方法可以适用于白芷的质量控制。

1、仪器与试药

1.1仪器：

Ultimate 3000高效液相色谱仪(四元泵，二极管阵列检测器)；

Shimadzu LC-20AT(四元泵，二极管阵列检测器)；

Waters e2695-2998(四元泵，二极管阵列检测器)；

Agilent1260高效液相色谱仪(四元泵，紫外检测器)；

Mettler XPE26分析天平(0.001mg)；

Mettler XS105DU分析天平(0.01mg)；

美国Millipore公司超纯水仪。

色谱柱：

Thermo，C18(5μm,4.6×250mm)

Boston Green ODS，C18(5μm,4.6×250mm)

Waters Symmtry，C18(5μm,4.6×250mm)

COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(5μm,4.6×250mm)

资生堂Capcell pak C18 MGⅡ(5μm,4.6×250mm)

1.2试剂与试药：

试剂：甲醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：10014118，分析纯)；

乙腈(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，批号：F22M2A201,色谱纯)；

水为超纯水。

对照品：花椒毒酚对照品(批号2009-24-7，以98％计)、水合氧化前胡素对照品(批号2643-85-8，以98％计)、白当归素对照品(482-25-7，以98％计)、氧化前胡素对照品(批号737-52-0，以99.6％计)、白当归脑对照品(批号26091-79-2，以98％计)、珊瑚菜素对照品(批号2543-94-4，以98％计)购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；花椒毒素对照品(批号DST210407-062，以98％计)、佛手柑内酯对照品(批号DST210409-012，以98％计)购自成都德思特生物技术有限公司；欧前胡素对照品(批号110826-201918，以99.0％计)、异欧前胡素对照品(批号110827-202113)购自中国食品药品检定研究院。

2、方法确定

2.1色谱条件的选择

2.1.1波长的选择

如图1，文献中白芷香豆素类成分测定多选择254nm和300nm波长，取10种对照品溶液，在200nm～400nm进行光谱扫描，10种香豆素类成分最大吸收见图1。经试验，样品在254nm波长处峰形好，分离佳，故选择254nm作为10种成分的测定波长。

2.1.2提取溶剂的选择

取白芷药材(批号BBZ2022006)粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入乙醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇25ml，超声处理(功率400W，频率50KHz)60分钟，制成供试品溶液，测定结果见表1。甲醇溶剂提取的香豆素类成分含量最高，且峰形较好，杂峰较少，容易滤过，因此选择甲醇作为提取溶剂。

表1不同提取溶剂对白芷含量(mg/g)的影响考察

2.1.3提取方式的选择

取白芷药材(批号BBZ2022006)粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，分别考察了超声(功率400W，频率50KHz，时间60min)、回流(时间60min)等方法对白芷香豆素类成分的影响，提取条件及测定结果见表2。表明不同提取方法测得的香豆素类成分含量无显著差异，从简便、易操作上考虑，选择超声提取方法。

表2不同提取方法对白芷含量(mg/g)的影响考察

2.1.4提取时间的选择

取白芷药材(批号BBZ2022006)粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，分别考察了超声处理(功率400W，频率50KHz)45、60、75分钟，制成供试品溶液，测定结果见表3，表明超声时间45min以上含量基本相同，因此超声时间选定为60分钟。

表3不同提取时间对白芷含量(mg/g)的影响考察

3方法学验证

3.1线性关系考察

分别称取花椒毒酚3.093mg、水合氧化前胡素6.022mg、白当归素6.049mg、花椒毒素3.096mg、佛手柑内酯3.050mg、白当归脑3.938mg、氧化前胡素5.008mg、欧前胡素5.211mg、珊瑚菜素4.912mg、异欧前胡素5.038mg，加甲醇配成系列浓度溶液，进样测定，记录峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，见表4～13，10种成分线性关系良好。

表4花椒毒酚线性考察结果

表5水合氧化前胡素线性考察结果

表6白当归素线性考察结果

表7花椒毒素线性考察结果

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表8佛手柑内酯线性考察结果

表9白当归脑线性考察结果

表10氧化前胡素线性考察结果

表11欧前胡素线性考察结果

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表12珊瑚菜素线性考察结果

表13异欧前胡素线性考察结果

3.2重复性试验

取白芷药材(批号BBZ2022006)粉末，称取粉末0.1、0.2、0.3g各3份，精密称定，按“供试品溶液的制备”方法制成供试品溶液，测定10种成分含量(mg/g)。结果见表14，表明方法的重复性良好。

表14重复性试验结果(单位mg/g)

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3.3准确度试验

取已知含量的白芷药材(批号BBZ2022006)粉末，称取粉末0.1、0.2、0.3g各3份，共取9份，精密称定，加入高、中、低三种浓度混合对照品溶液，按“供试品溶液的制备”方法制成供试品溶液，计算回收率，结果见表15～24，表明方法的重复性良好。

表15花椒毒酚回收率试验结果

表16水合氧化前胡素回收率试验结果

表17白当归素回收率试验结果

表18花椒毒素回收率试验结果

表19佛手柑内酯回收率试验结果

表20白当归脑回收率试验结果

表21氧化前胡素回收率试验结果

表22欧前胡素回收率试验结果

表23珊瑚菜素回收率试验结果

表24异欧前胡素回收率试验结果

3.4稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、1、2、5、12、15、24小时进样测定，记录峰面积积分值，见表25。表明供试品溶液在24小时内稳定。

表25供试品溶液稳定性试验结果

3.5耐用性试验

3.5.1柱温考察

在不同柱温下测定同一批白芷样品，测定结果见表26、图2，含量测定结果基本一致，表明该色谱系统对柱温有较好的耐用性。

表26不同柱温含量测定结果(mg/g)

3.5.2流速考察

在不同流速下测定同一批白芷样品，测定结果见表27、图3，含量测定结果基本一致，表明该色谱系统对流速有较好的耐用性。

表27不同流速含量测定结果(mg/g)

3.5.3色谱柱考察

采用五种不同色谱柱，测定同一批药材含量，结果见表28，色谱图见图4，供试品色谱中各主成分出峰时间适宜，分离良好，含量测定结果基本一致，表明该色谱系统对色谱柱有较好的耐用性。

表28不同色谱柱含量测定结果(mg/g)

注：ⅠThermo，C

ⅢCOSMOSIL5C

ⅤSHIMADZUVP-ODSC

3.5.4仪器考察

采用同一根色谱柱(Waters Symmtry，C18，5μm，4.6×250mm)，分别用不同品牌高效液相色谱仪测定同一批白芷样品，测定结果见表29、图5，含量测定结果基本一致，表明该色谱系统对仪器有较好的耐用性。

表29不同仪器含量测定结果(mg/g)

注：ⅠUltimate 3000；ⅡShimadzuLC-20AT；ⅢWaterse2695-2998；ⅣAgilent 1260

6样品测定

根据制定的方法对26批白芷样品进行了测定，见表30。

表30白芷药材样品测定(mg/g)

以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。