人工微生物多细胞同步硝化反硝化脱氮菌群的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及人工多细胞同步硝化反硝化脱氮菌群的构建方法及其应用。

背景技术

垃圾渗滤液中氮元素是主要的污染物之一，氮含量浓度一般在1500mg/L-3000mg/L，且随着垃圾填埋场的填埋年限的增加不断积累。垃圾渗滤液水质复杂，如果垃圾渗滤液未经处理或处理不达标而排放，导致水体污染，最终对自然环境、人类的健康以及社会的可持续发展产生恶劣的影响。

水体中氮素含量过高会导致水体污染，造成水体富营养化，使得藻类等生物大量繁殖，破坏水体的生态平衡。其中NO

目前移除氮素主要有物理法、化学法和生物法。通过物理化学方法处理操作繁琐且成本较高，易造成二次污染，而生物法脱氮技术因其经济、有效、易操作、无二次污染等特点被广泛应用。其中微生物污水处理工艺前段生化处理部分采用高效脱氮菌群替代传统活性污泥，总氮除去率高，污泥沉降性好，出水澄清度高，没有污泥膨胀上浮等异常现象出现，解决了垃圾渗滤液处理中污泥膨胀、泥水分离困难、水温波动以及碳氮比失衡影响处理效率、低温、高氨氮高浓度等问题。后端深度处理部分利用Fenton高级氧化法和BAF曝气生物滤池的组合工艺，对有机污染物进行氧化、生物絮凝、过滤，使污水中氮系、碳系污染物充分分解，完成水质的净化过程。微生物污水处理技术是一种操作简单、效果稳定、实用性极强的城市污水处理工艺。全工艺流程中没有涉及膜处理工艺，物浓缩液的产生，有效解决了现在的处理难题。

硝化作用是硝化细菌氨氮氧化为硝酸盐的过程。它包括两个连续的阶段：首先，氨氮经亚硝酸细菌作用氧化为亚硝酸盐；亚硝酸盐又经硝酸细菌作用氧化为硝酸盐。亚硝酸细菌与硝酸细菌合称为硝化细菌，是一类具有硝化作用的化能自养细菌。但是，由于硝化细菌生长缓慢，且伴生的异养细菌生长迅速，稳定性差，所以在一些污水处理体系中，硝化细菌的含量较低。因为硝化细菌的含量与硝化速度成正比关系，较低的硝化细菌含量不利于硝化反应的进行，进而影响生物脱氮的效果，因此富集培养硝化细菌并鉴定显得尤为重要，旨在提高硝化细菌的产率，在污水处理和环境保护等方面十分必要。

发明内容

本发明要解决的问题是提供污水处理系统中同步硝化反硝化脱氮菌群的构建及其应用。人工微生物多细胞体系基于细胞间通信、代谢分工、能量与物质转移和电子传递耦合构建的合成微生物体系，其功能更为明确，结构更为稳定，与单一微生物相比，人工微生物多细胞体系通过细胞间沟通、交流等相互作用，具有更高的稳定性，对外界环境扰动具有更强的适应性和鲁棒性，能够克服传统活性污泥污水脱氮菌群结构复杂，稳定性差等问题。本发明通过挖掘污水处理系统的天然菌群，通过富集培养和适应性驯化等策略，获得了具有高效脱氮，尤其是异养反硝化的人工多细胞脱氮菌群。具体技术方案如下：

一种人工微生物多细胞同步硝化反硝化脱氮菌群的构建方法，包括如下步骤：

步骤1、制备硝化细菌培养基、反硝化细菌培养基和硝化细菌富集液体培养基；

步骤2、污水样的采集；

步骤3、硝化细菌的富集培养；

步骤4、将富集培养液接种至硝化细菌培养基、反硝化细菌培养基中培养，测定NH

步骤5、处理过程中水体菌群结构的分析；

步骤6、硝化细菌硝化能力检测。

进一步的，所述硝化细菌富集液体培养基成分如下：

每1000mL中含KNO

进一步的，所述硝化细菌培养基配方为：每1000m L中含硫酸铵((NH

进一步的，所述反硝化细菌培养基将所述硝化细菌培养基中的硫酸铵((NH

进一步的，所述微量元素溶液每1000m L含有：EDTA 50g，七水硫酸锌(ZnSO

进一步的，步骤3具体如下：取污水样2mL，投加于装有100mL硝化细菌富集液体培养基的500mL摇瓶，混匀；置于恒温振荡培养器30℃，160rpm培养；每天取2mL培养后的硝化细菌富集液体培养基检测NO

进一步的，步骤4中所述分析步骤包括：DNA抽提、PCR扩增、荧光定量、Miseq文库构建、Miseq测序。

上述人工微生物多细胞同步硝化反硝化脱氮菌群的构建方法在培养的菌群在高含氮污水脱氮处理中的应用。

采用本发明的方法能有效对硝化细菌进行富集，大大提高了硝化细菌的含量，得到的菌群NO

附图说明

图1为本发明硝化细菌的亚硝氮降解能力的示意图；

图2为本发明硝化细菌的硝氮生长能力的示意图；

图3为本发明中硝化细菌群在门水平上的柱状图；

图4为本发明中硝化细菌群在属水平上的柱状图；

图5为本发明中硝化细菌群的稀释曲线；

图6为本发明中硝化细菌群对氨氮的降解示意图；

图7为本发明中硝化细菌群对硝氮的降解示意图；

图8为本发明中硝化细菌群对亚硝氮的降解示意图；

图9为本发明中硝化细菌群在高含氮污水中的应用；

图10为本发明中未接种硝化细菌在高含氮污水中的应用；

图11为本发明中硝化细菌群在实际生活污水中的应用。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例中如无特殊说明，均为常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：硝化细菌中硝酸细菌的富集培养

取杭州某污水处理厂污水样2mL，投加于装有100mL硝化细菌富集液体培养基的500mL摇瓶，混匀。置于恒温振荡培养器30℃，160rpm培养。每天各取2mL培养后的硝化细菌富集液体培养基检测NO

表1硝化细菌富集液体培养基配方。

采用本方法对硝化细菌中的硝酸细菌富集培养，初始亚硝氮浓度423.54mg/L，硝氮浓度134.95mg/L；最终亚硝氮浓度0mg/L，硝氮浓度454.65mg/L。

实施例2：硝酸细菌的高通量测序鉴定

将经过每次7天共经7次富集培养的硝酸细菌菌液进行水体菌群结构分析。建库测序：分别提取菌液总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina Novaseq 6000进行测序。高通量测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(SequencedReads)。

数据预处理：1)质量过滤：首先使用Trimmomatic v0.33软件，对测序得到的RawReads进行过滤；然后使用cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的Clean Reads；2)双端序列拼接：使用Usearch v10软件，通过overlap对每个样品的Clean Reads进行拼接，然后根据不同区域的长度范围对拼接后数据进行长度过滤；3)去噪：使用QIIME2 2020.6软件中的dada2方法进行去噪并去除嵌合体序列，得到最终有效数据(Non-chimeric Reads)。

在门水平上，菌液的菌群组成变化如图3所示，菌液前期相对于菌液后期，变形菌门(Proteobacteria)比例减少，拟杆菌门(Bacteroidetes)比例增多，检测结果说明硝化细菌富集液适合硝化细菌的生长富集，其他菌类只可少量生长，产生这个结果可能是因为硝化细菌的产物会抑制其他菌类的生长，或是培养条件不适合其他菌类的生长，但硝化细菌可以稳定生长。

在菌属水平上，菌群组成变化如图4所示，菌群中黄杆菌(Flavobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、甲基黄花菜(Methyloversatilis)、含量增加，其他菌属均有减少，检测结果显示，在属水平上，硝化细菌会抑制其他菌类的生长，其中包含一些有害菌属，说明硝化细菌在一定程度上可以净化水体。

测定菌液的前期(A)和后期(B)丰富度，所使用的方法为稀释曲线。稀释曲线法的操作方法随机抽取所有样本中的部分个体，计算出其中包含的物种数量，根据所得的结果构建稀释曲线。如图5所示，样品的稀释曲线上升趋势较弱，最后趋向平坦，当样品的测序数量接近饱和时，稀释曲线的波动幅度变得很小，也可说明该实验数据的合理性。

实施例3：硝化细菌群的硝化/反硝化能力鉴定

硝化培养基配方为：硫酸铵((NH

微量元素溶液包括：EDTA 50g，七水硫酸锌(ZnSO

处理方式为：接种2％富集培养液，30℃、160rpm培养。定期取样分别测定上清液中的中NH

结论：当氮源为氨氮时，前24h氨氮降解迅速，菌体处于对数期。24-72h内氨氮浓度缓慢下降，在72h降解率达到峰值，同时未发现硝氮亚硝氮的积累，具有良好的硝化能力。当氮源为硝氮时，前48h硝氮降解迅速，降解率达93.88％。在48-72h内，菌体处于稳定期，存在少量的硝氮被释放。当氮源为亚硝氮时，菌体处于迟缓期、对数期和稳定期时，亚硝氮均为下降的趋势。在反硝化过程中未发现氨氮的积累，具有良好的反硝化能力。

实施例4：硝化细菌群在实际高氨氮垃圾渗滤液处理中的应用

硝化菌群应用于某污水处理厂生化处理器的曝气池中。按照2％的接种量接种于LB培养基，在30℃，160rpm条件下培养18h后以8000rpm离心10min，得到菌体。按照1:1的比例添加麦麸以此固定菌剂，防止游离态的微生物菌剂投入污水中造成菌体流失，也可使游动的微生物被限制在某一空间，使保持微生物活性。投加一定量的固定化菌剂后，取样测定污水处理前后氨氮、硝氮和亚硝氮浓度，测定结果如图9-10所示。

表2污水水样检测处理前后水体变化

由图9-10可知，菌体的污水在24h中氨氮浓度降解速率最高，在48h氨氮浓度接近0。由表2可知，本菌种对较高浓度污水中的氨氮和硝氮有很好的脱氮效果，且处理过程中不会产生亚硝氮的积累。

实施例5：硝化细菌群在实际生活污水中的应用

实际生活污水样品取自杭州某污水处理厂，离心去除不溶物以用于后续实验。添加外源碳源丁二酸钠至C/N为10，其余配方保持不变。处理方式：接种2％种子液(种子液为实施例1中LB培养基在30℃，160rpm条件下培养12h后的菌悬液)。定期取样测定污水处理前后氨氮、硝氮和亚硝氮浓度，测定结果如图11所示。

结论：由图11可知，在实际生活污水脱氮过程中，菌群在24h内持续增长，氨氮脱除效率达到95.12％，同时对硝氮有很好的脱除效果，且在实验期间没有亚硝氮的积累。因此，相较于现有的菌体，本菌体应用范围广，能够丰富环境微生物的菌种库，提高高效脱氮的环境微生物，为不同程度的污染水提供了解决方案。