一种喉咽清HPLC指纹图谱的建立方法

技术领域

本申请涉及医药技术领域，具体涉及一种喉咽清HPLC指纹图谱的建立方法。

背景技术

咽炎分为急性咽炎和慢性咽炎。急性咽炎为咽部黏膜及黏膜下组织的急性炎症，咽淋巴组织常被累及，炎症早期可局限，随病情进展常可涉及整个咽腔，以秋冬及冬春之交较常见。主要表现为咽部干燥，灼热，疼痛，吞咽疼痛明显，咽部充血肿胀等。慢性咽炎又可分为慢性单纯性咽炎、慢性肥厚性咽炎和萎缩性咽炎，其中慢性单纯性咽炎较多见，病变主要在黏膜层，表现为咽部黏膜慢性充血，黏膜及黏膜下结缔组织增生，黏液腺可肥大，分泌功能亢进，黏液分泌增多。患者常咯出咽内黏痰，或感觉咽部有异物感，咯不出，咽不下。病程长，易复发，症状顽固。

现行《中国药典》关于喉咽清口服液的质量标准，含量测定项中是先将样品水解、石油醚萃取后，通过薄层层析分离采用薄层色谱扫描法，测定水解产物中齐墩果酸的含量，但通过水解方式所得到的该成分是多种皂苷的苷元，而不是单一成分，故无法全面控制该制剂质量，且采用薄层色谱扫描法进行定量实验，无论准确性、稳定性还是精密度上都不好，薄层色谱扫描法用于定量研究已经处于逐步被取消境地。另外现行通过水解方式测定齐墩果酸的含量，齐墩果酸是多种皂苷的苷元而不是喉咽清的单一活性指标成分，因而不能精准的控制喉咽清的质量。

发明内容

本申请为了解决现有的方法通过薄层色谱扫描法测定水解产物中齐墩果酸的含量，但通过水解方式所得到的该成分是多种皂苷的苷元，而不是单一成分，故无法全面控制该制剂质量，故质量控制标准存在准确性、稳定性、精密度都不理想的问题，提供一种处理简便、精密度和准确性高、稳定性好、成本低的喉咽清质量控制方法，为不同批次的喉咽清在质量控制与整体评价方面提供可参考的方法的喉咽清HPLC指纹图谱的建立方法。

一种喉咽清HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

S1、供试品溶液的制备：准确称取喉咽清，加入甲醇溶液超声提取后稀释定容，混合完全使用0.45μm的微孔滤膜过滤，得供试品溶液；

S2、对照品溶液的制备：精密称取对照品绿原酸、阿魏酸、大车前苷、β-蜕皮甾酮、R-牛膝甾酮、S-牛膝甾酮、异绿原酸A、异绿原酸C，以甲醇为溶剂，配制成绿原酸浓度为0.11mg/mL、阿魏酸浓度为0.30mg/mL、大车前苷浓度为0.27mg/mL、β-蜕皮甾酮浓度为0.08mg/mL、R-牛膝甾酮浓度为0.05mg/mL、S-牛膝甾酮浓度为0.06mg/mL、异绿原酸A浓度为0.35mg/mL、异绿原酸C浓度为0.31mg/mL的混合对照品溶液；

S3、色谱条件：色谱柱为C

S4、测定：吸取供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪中，用步骤S3的高效液相色谱检测，匹配24个共有峰，确定8个特征峰，建立喉咽清指纹图谱。

优选的，所述步骤S1供试品溶液的制备方法中，供试品喉咽清与甲醇的比例为1:10。

优选的，所述步骤S1供试品溶液的制备方法中，超声提取的功率为250W，频率为40kHz，提取1h。

优选的，所述步骤S2对照品溶液的制备方法中，具体包括：精密称取对照品绿原酸、阿魏酸、大车前苷、β-蜕皮甾酮、R-牛膝甾酮、S-牛膝甾酮、异绿原酸A、异绿原酸C，以甲醇为溶剂，以频率40kHz超声3min，混匀后采用0.45μm微孔滤膜过滤，即得混合对照品溶液。

优选的，所述步骤S3色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行：

0～8min时，流动相A为10％的乙腈溶液；

8～25min时，流动相A为10～13％的乙腈溶液；

25～35min时，流动相A为13～15％的乙腈溶液；

35～50min时，流动相A为15～20％的乙腈溶液；

50～55min时，流动相A为20％的乙腈溶液；

55～75min时，流动相A为20～25％的乙腈溶液；

75～85min时，流动相A为25％的乙腈溶液；

90min时，流动相A为10％的乙腈溶液。

优选的，所述步骤S3的色谱条件中所述的色谱柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm；所述的色谱柱，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm。

优选的，所述步骤S4中8个特征峰分别为：6号峰绿原酸、13号峰阿魏酸、14号峰大车前苷、15号峰β-蜕皮甾酮、17号峰R-牛膝甾酮、18号峰S-牛膝甾酮、20号峰异绿原酸A和22号峰异绿原酸C；其中15号峰为参照峰。

优选的，所述6号峰绿原酸的相对保留时间t

所述13号峰阿魏酸的相对保留时间t

所述14号峰大车前苷的相对保留时间t

所述15号峰β-蜕皮甾酮的相对保留时间t

所述17号峰R-牛膝甾酮的相对保留时间t

所述18号峰S-牛膝甾酮的相对保留时间t

所述20号峰异绿原酸A的相对保留时间t

所述22号峰异绿原酸C的相对保留时间t

优选的，所述步骤S1供试品的制备方法中，喉咽清为喉咽清颗粒、喉咽清颗粒(无蔗糖)或喉咽清口服液中的任意一种。

优选的，所述步骤S1供试品的制备方法，具体包括以下步骤：取装量差异项下的喉咽清颗粒或喉咽清颗粒(无蔗糖)，混匀，研细，按比例精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇，密塞，称定重量，超声处理1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按比例精密量取喉咽清口服液，置于容器中，加入甲醇，摇匀，离心，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

与现有技术相比，本申请的有益效果如下：

本申请提供一种喉咽清HPLC指纹图谱的建立方法，具有整体性、模糊性、特征性强等特点，能够全面地反映出中药化学成分之间的关系，展示出中药内在关系的完整面貌，是目前对中药复方制剂进行质量控制的一种可行模式。另外采用HPLC指纹图谱对喉咽清进行质量控制，优点是相对薄层扫描法，高效液相色谱仪具有精密度和准确性高、稳定性好，成本低等优点，且本发明方法对于喉咽清样品处理简单，不需要像现行《中国药典》喉咽清质量控制项进行水解、萃取等复杂操作。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是空白溶剂色谱图；

图2-A是16批喉咽清的叠加指纹图谱；

图2-B是16批喉咽清的对照图谱；

图3是混合对照标准品色谱图；

图4是喉咽清负离子模式下UPLC-Q-TOF-MS总离子流色谱图(TIC)；

图5是混合对照标准品负离子模式下UPLC-Q-TOF-MS总离子流色谱图(TIC)；

图6是仪器精密度色谱图；

图7是样品稳定性色谱图；

图8是样品重复性色谱图；

图9是混合对照品溶液色谱图；

图10是本申请喉咽清口服液HPLC标准指纹图谱；

图11是16批次喉咽清指纹图谱共有峰保留时间及峰面积；

图12是16批次喉咽清指纹图谱相似度评价结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明：

一、色谱条件

岛津HPLC仪(LC-20A二元高压梯度仪，SPD-20A紫外检测仪)，色谱柱为Agilent-C

表1喉咽清梯度洗脱程序

二、样品制备

1)混合对照品制备

精密称取绿原酸对照品1.1mg、阿魏酸对照品3.0mg、大车前苷对照品2.7mg、β-蜕皮甾酮对照品0.80mg、R-牛膝甾酮对照品0.50mg、S-牛膝甾酮对照品0.60mg、异绿原酸A3.5mg、异绿原酸C 3.1mg置于10mL容量瓶中加甲醇定容，超声3min混匀后过0.45μm微孔滤膜，即得混合对照品溶液。

2)供试品溶液的制备

取喉咽清颗粒适量，用研钵研细，精密称定1.00g置于带塞锥形瓶中，加入10mL甲醇，盖塞后用封口膜密封，称定质量，40kHz超声提取1h，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀后过0.45μm微孔滤膜，即得。

实施例1

1、空白对照实验

取甲醇溶液，过0.45μm微孔滤膜，按步骤1)中的色谱条件测定色谱图，测试结果如图1所示。

2、喉咽清指纹图谱共有模式的建立

取喉咽清颗粒16批，按照步骤2)中的制备方法制备供试品溶液，按步骤1)中的色谱条件进行测定。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012年版)，以批号S9(20220205)样品图谱为参照图谱，采用平均数法，时间窗宽度为0.5，得到16批喉咽清的叠加指纹图谱见图2-A，其对照图谱见2-B；通过软件分析，选取分离度较好，保留时间及峰面积稳定的色谱峰，通过对比不同批次间各峰的保留时间来确定共有峰，16批喉咽清HPLC色谱图最终确定24个共有峰，如图2-B所示。不同批次样品共有峰的保留时间及峰面积见图11。各共有峰保留时间稳定，具有指纹图谱特征性，可初步拟定为喉咽清的指标成分群。由表2结果可以看出，不同批次之间喉咽清样品色谱图的共有峰保留时间RSD值均小于3％，符合指纹图谱技术要求，可以将以上24个共有峰认定为喉咽清指纹图谱的稳定特征峰。但不同批次间色谱峰的峰面积具有较大差值，其共有峰峰面积RSD值在28％～69％之间。

特征峰的指认

利用混合对照色谱图(图3)与喉咽清指纹色谱图(图2-B)对比，同时结合超高液相色谱-质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)技术对目标峰进行验证。

UPLC-Q-TOF-MS色谱条件为：Waters UHPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相为0.1％甲酸水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，洗脱程序为：0～2.5min，10％B；2.5～8.5min，10％～13％B；8.5～12min，13％～15％B；12～17min，15％～20％B；17～18.5min，20％B；18.5～25min，20％～25％B；25～28min，25％B；28～29min，25％～90％B；29～30min，90％～10％B。柱温35℃，流速0.3mL/min，进样量2μL。

UPLC-Q-TOF-MS质谱条件为：Xevo G2-S QTOF ESI离子源，电离方式为负离子模式(ESI-)，负离子毛细管电压3.0kV，样品锥孔电压40V，离子源温度120℃，脱溶剂温度为400℃，雾化气温度400℃，锥孔气体积流量为50L/h，溶媒挥散体积流量为800L/h，质量扫描范围m/z 50～1200。负离子模式下低碰撞能量为20e V，高碰撞能量为50e V。液质系统由Masslynx4.1软件控制，并进行数据采集和图谱处理。喉咽清和混合对照标准品负离子模式下UPLC-Q-TOF-MS总离子流色谱图(TIC)分别见图4、图5。

通过对比喉咽清与混合对照标准品UPLC-Q-TOF-MS结果，如表3所示，最终指认了8个特征峰，结果见表4。

表3负离子模式下喉咽清的化学成分鉴定

表4喉咽清特征峰指认

相似度评价

将16批喉咽清的指纹图谱均导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，计算相似度，相似度评价结果见图12。

根据16批次喉咽清指纹图谱相似度评价结果可以看出，与对照图谱R相比，各批次喉咽清样品相似度均在0.89以上，相似度最高达到了0.992。其中相似度大于0.9的样品数量共计14个，占总数量的87.5％，可初步判定各批次样品质量相似。S11与S16样品相似度分别为0.893与0.896，相似度接近0.9，造成相似度降低的原因可能与喉咽清复方中各味药材的产地、采收时间、储存保管以及交通运输等所导致的批次差异有关。

精密度试验结果与分析

取喉咽清颗粒(样品9)，按照步骤2)中的制备方法方法制备样品，按“色谱条件”连续进样6次，结果显示共有峰的峰面积RSD＜3％，保留时间RSD＜2％，仪器精密度实验色谱图见图6，结果见表6。

表6喉咽清精密度实验共有峰保留时间及峰面积(n＝6)

将连续进样6次的色谱图进行相似度评价，相似度评价结果见表7，结果显示其相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

表7喉咽清精密度图谱相似度(n＝6)

样品稳定性试验结果与分析

取喉咽清颗粒(样品9)，按“供试品溶液制备”制备同一供试品溶液(S9)，分别于0、2、4、8、10、24h进样，按“色谱条件”进样测定，计算共有峰峰面积和保留时间的RSD值。结果显示共有峰的峰面积RSD＜3％，保留时间RSD＜2％，样品稳定性实验色谱图见图7，结果见表8。

表8喉咽清稳定性实验共有峰保留时间及峰面积(n＝6)

将得到的色谱图导入相似度评价软件进行评估，结果显示其相似度大于0.99，结果见表9，表明喉咽清供试品溶液于室温下放置24h稳定性良好。

表9喉咽清稳定性图谱相似度(n＝6)

重复性试验结果与分析

取同一批次样品(样品9)，按“供试品溶液制备”平行制备6份供试品溶液，按“色谱条件”进样测定，计算共有峰峰面积和保留时间。结果显示共有峰的峰面积RSD＜3％，保留时间RSD＜3％，样品重复性实验色谱图见图8，结果见表10。

表10喉咽清重复性实验共有峰保留时间及峰面积(n＝6)

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将样品重复性实验色谱图导入相似度评价软件进行评估，结果显示其相似度大于0.99，结果见表11，表明该方法重复性良好。

表11喉咽清重复性图谱相似度(n＝6)

实施例2

1)供试品溶液的制备：取喉咽清口服液，摇匀后过0.45μm微孔滤膜，即得，10批次喉咽清口服液由湖南时代阳光药业股份有限公司提供，乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

指纹图谱的建立

将步骤二中制备的对照品溶液以及上述步骤1)制备的样品溶液分别注入HPLC色谱系统，测定10个批号喉咽清口服液HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的喉咽清口服液HPLC标准指纹图谱。混合对照品溶液的图谱如图9所示，喉咽清口服液HPLC标准指纹图谱如图10所示，其中以15号β-蜕皮甾酮为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的共有峰的相对保留时间tR分别为：0.143、0.204、0.250、0.307、0.363、0.382、0.436、0.454、0.485、0.506、0.709、0.732、0.915、1.000、1.017、1.036、1.063、1.092、1.197、1.260、1.353、1.393、1.519、1.646。

中药指纹图谱具有整体性、模糊性、特征性强等特点，能够全面地反映出中药化学成分之间的关系，展示出中药内在关系的完整面貌，是目前对中药复方制剂进行质量控制的一种可行模式。另外采用HPLC指纹图谱对喉咽清进行质量控制，优点是相对薄层扫描法，高效液相色谱仪具有精密度和准确性高、稳定性好，成本低等优点，且本发明方法对于喉咽清样品处理简单，不需要像现行《中国药典》喉咽清质量控制项进行水解、萃取等复杂操作。

本申请是反相高效液相色谱法-紫外检测器进行喉咽清HPLC指纹图谱的建立。理论上还可以通过超高液相色谱-质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)、反相超高效液相(UPLC)色谱法-紫外检测器等测定，相比之下，本设计方案具有仪器设备价格较低、普遍适用(反相高效液相色谱法-紫外检测器是药企的标配和常规设备)、成本低的优点和优势。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。