一种肿瘤个体化DC疫苗、制备方法及应用

技术领域

本发明属于DC疫苗技术领域，具体地，涉及一种肿瘤个体化DC疫苗、制备方法及应用。

背景技术

恶性肿瘤已成为威胁国民健康的头号杀手，近20年来，中国癌症的发病率正处于快速上升期，据统计每年发病人数约260万人，死亡人数约180万人，并且由于快节奏高压力的工作环境和不良生活方式，癌症的发病群体正日益年轻化。虽然随着医疗技术的不断发展，以手术、放化疗为主要方法的癌症治疗手段有了长足的进展，但是由于癌症的发病机理复杂，目前对于寻找有效的治疗手段一直是当今癌症治疗领域的巨大挑战。

近年来，随着分子生物学、基因工程技术及免疫学的飞速发展，以免疫治疗为基础的生物治疗已成为癌症治疗的新模式。有研究报道以CD19为靶点的CAR-T技术，用于急性淋巴细胞白血病，非霍奇金淋巴瘤的治疗，即使是治疗失败的复发难治的晚期患者，依然拥有50％-90％的其完全缓解率，其中部分患者甚至达到长期生存，实现了临床治愈。但目前CAR-T治疗仅在少数血液系统肿瘤的狭窄领域获得成功，在实体瘤领域的治疗中仍然存在许多局限性。与CAR-T技术相比，T细胞受体基因工程化T细胞(T cell receptor engineredT cells，TCR-T)治疗技术更为安全，但其受限于靶点和HLA分型两个要素，故适用范围狭窄。此外，无论CAR-T还是TCR-T，均针对单一靶点。但肿瘤呈现的突变谱可以包含成百上千的体细胞突变，而且这些突变是动态变化的，新的突变不断产生的同时伴随部分旧的突变消失，故仅针对单一靶点的治疗无疑具有限制性，携带其他突变的肿瘤细胞会继续生长，这也是目前基因工程化T细胞治疗后很快耐药或复发的原因。

肿瘤是细胞基因突变的产物，在这些突变产物之中，许多基因突变是正常组织细胞所没有的，这些突变蛋白很有可能会激活免疫系统，并引来免疫系统对肿瘤细胞的攻击。这些能够激活免疫系统的由肿瘤细胞基因突变所产生的异常蛋白质即为肿瘤新抗原。不但不同类型的肿瘤具有不同的基因突变，甚至是同一患者肿瘤内部的不同部位都存在着广泛的突变异质性。由于肿瘤突变是高度异质性，高度个体化的。因此，靶向肿瘤新抗原的个体化多靶点免疫治疗为肿瘤治疗带来了新希望，能够很好的解决肿瘤突变抑制性和动态演化这两大难题，是能够真正实现个体化多靶点的精准治疗方案。

制备个体化DC疫苗可以很好的实现靶向肿瘤新抗原的个体化多靶点免疫细胞治疗，DC细胞可以将多个肿瘤相关靶肽递程并刺激T细胞，最终实现对肿瘤细胞的清除。越来越多的证据表明，癌症疫苗可以诱导免疫应答，并产生临床效应。George Coukos等人利用卵巢癌细胞株制备DC疫苗在复发性卵巢癌受试者中取得一定的临床疗效。值得注意的是，该临床研究中运用的是肿瘤细胞株裂解物提供的抗原，并不能真正做到个体化，是否能够在体内激活有效的抗肿瘤免疫效应，还有进一步的临床研究，并具有潜在临床风险。

因此真正有效的个体化多靶点DC疫苗应基于患者自身的肿瘤抗原，目前有效的肿瘤抗原主要包括原代肿瘤细胞裂解物和基于二代测序和HLA分型筛选的肿瘤新抗原(Neoantigen)。后者因过渡依赖测序技术，存在靶点漏筛、成本高等弊端，而原代肿瘤细胞裂解物则可以提供大量的肿瘤抗原，且不需要筛选，极大的降低了成本。

目前类器官技术是运用较多的原代肿瘤细胞培养方法，然而类器官技术通常培养周期较长，且成本高。然而为了解决上述问题，我们利用手术或穿刺活检获取的肿瘤样本构建一种个体化原代肿瘤细胞培养方法。该培养方法通过改进型“eCR”培养方法，对比刘雪峰等人2017年在nature protocols描述的“CR”原代细胞培养方法，原文献使用鼠源成纤维细胞作为滋养层细胞，有引入异种抗原的风险。本发明为了避免该风险，前期利用健康成人脐带组织进行大量筛选，最终筛选出一株体外快速稳定扩增原代细胞的滋养层细胞。因此本发明建立的原代细胞培养方法不仅解决了类器官体外扩增周期长，耗时久的问题，同时还避免了异种抗原和突变基因抗原污染的风险。此外由于目前细胞治疗的应用还停留在晚期患者对常规治疗无效时，而晚期患者前列腺癌患者，往往较难获取足够多样本进行细胞培养，这极大地限制了该技术手段的应用。然而本技术手段针对该临床问题，可以利用穿刺小样本培养出原代肿瘤细胞，尤其适合晚期患者。

在上述原代细胞培养的基础上，我们通过物理方法裂解原代肿瘤细胞提供体化肿瘤抗原，利用该原代肿瘤细胞裂解物负载到DC细胞与外周血T细胞共培养获得肿瘤反应性T细胞，最终同时通过一系列体内和体外实验验证其具备激活特异性T细胞进而杀伤肿瘤细胞的功能。在这里我们证明了原代肿瘤细胞可以提供有效的肿瘤新抗原，基于原代肿瘤细胞的个体化DC疫苗可用于从患者外周血中刺激生成肿瘤反应性T细胞，此外我们证明了这些T细胞可有效抑制原代肿瘤细胞的生长。该研究最终打造一款可以应用到临床的基于原代肿瘤细胞的个体化DC疫苗。

发明内容

发明目的：针对在晚期患者通常无法手术获取样本，本发明结合临床实际出发，开发出利用肿瘤活检样本构建的个体化原代肿瘤细胞培养方法，在体外扩增培养原代肿瘤细胞。在此之前多数原代细胞在体外很难持续传代，无法获得足够多的原代肿瘤细胞。针对此不足，本发明提供了一种肿瘤个体化DC疫苗制备方法及应用。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种肿瘤个体化DC疫苗，所述疫苗是包含原代肿瘤细胞裂解物的DC疫苗。

优选的，所述肿瘤包括前列腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等实体瘤。

所述的肿瘤个体化DC疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)体外培养原代肿瘤细胞和DC细胞；体外培养原代肿瘤细胞的方法包括如下：

1)试剂配制：

Complete DMEM＝DMEM(Gibco)+10％FBS(Gibco)+1％双抗+1％L-G(Gibco)；

Complete F medium：＝Complete DMEM+F12(Gibco)+0.1％ Insulin(Sigm a-Aldrich)+0.1％ ROCK inhibitor(Enzo)+0.1％ Hydrocortisone(Sigma-Aldrich)；

消化酶＝DMEM(Gibco)+A、H、R酶(Miltenyi)；

2)提前24小时复苏1辐照后的滋养层细胞，2ml complete F medium重悬后接种于6孔板中，每孔1ml细胞悬液；

3)通过活检或手术获取新鲜肿瘤样本，BS洗干净，眼科剪剪碎，加入5ml消化酶

37℃，摇床40rmp，消化30min，用100um的细胞筛蒋消化物过滤于15ml的离心管中；

4)离心后的细胞用2ml Complete F medium培养基重悬，加入接种有滋养层细胞的孔板中，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；

5)培养72h后进行半量/全量换液处理，当原代肿瘤细胞融合达90％时，进行细胞收获。

体外培养DC细胞的方法包括如下：

1)采集肿瘤患者外周血，利用淋巴细胞提取液(天津瀚洋)分离出白细胞，

2)加入RPMI 1640(gibco)培养基进行重悬，培养箱培养2小时，将贴壁细胞加DC培养因子继续培养；

(2)原代肿瘤细胞裂解：收集步骤(1)中培养的原代肿瘤细胞，利用反复冻融法裂解肿瘤原代细胞；所述反复冻融法，采用液氮进行冻融，冻18-22min后室温溶解，重复5-7次；

(3)原代肿瘤细胞裂解物与DC细胞共孵育，即得。

其中，步骤(1)中的滋养层细胞可来源于人的脐带组织。

步骤(3)中，原代肿瘤细胞裂解物与DC细胞共孵育的方法包括如下：

将步骤(2)所得原代肿瘤细胞裂解物与步骤(1)中培养的DC细胞混合，进行孵育，后续将DC细胞培养中使用的DC培养因子换为DC细胞成熟因子继续培养，即获得所述DC疫苗；

任选的，以细胞数量计，所述DC细胞与原代肿瘤细胞裂解物的比例为1：1，孵育时间为22-26h，DC培养因子换为DC细胞成熟因子继续培养46-50h。

更优选的，通过活检获取新鲜肿瘤样本。

本发明最后还提供了所述的肿瘤个体化DC疫苗在制备治疗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述肿瘤包括前列腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等实体瘤。

本发明利用肿瘤活检或手术样本构建个体化原代肿瘤细胞培养方法。同时通过对肿瘤细胞裂解、DC细胞诱导培养等一系列技术方法改进升级，最终建立一种基于原代肿瘤细胞的个体化DC疫苗的制备方法。同时通过一系列体内和体外实验验证其具备激活特异性T细胞进而杀伤肿瘤细胞的功能，最终打造一款可以应用到临床和商业化的肿瘤个体化DC疫苗制备技术产品。

有益效果：与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

1、本发明建立了一套少样本且快速的培养原代肿瘤细胞的方法，对于晚期无法手术获取肿瘤样本的患者同样适用。

2、本发明培养原代肿瘤细胞所使用的滋养层细胞来源于人的脐带组织，避免了异种抗原污染的风险，提高了临床使用的安全性。

3、本发明利用患者肿瘤样本培养原代肿瘤细胞裂解后提供抗原，与自体DC细胞共孵育真正做到个体化精准治疗。

4、本发明通过原代肿瘤细胞裂解的全抗原解决以往DC疫苗靶点单一的局限性。

5、本发明在DC疫苗制备中通过前期实验摸索最适冻融条件，能完全裂解原代肿瘤细胞，避免了临床应用风险同时也保证最佳的DC吞噬效果。

6、本发明通过前期系列实验摸索出DC细胞吞噬的最佳时间，制备出更多有效的DC疫苗。

附图说明

图1：光学显微镜下原代肿瘤细胞，其中，A：第0代和第3代的原代肿瘤细胞；B：Ckpan免疫荧光染色；C：扩增倍数；

图2：原代肿瘤细胞生物学特性；

图3：原代肿瘤细胞裸鼠皮下移植瘤建立；

图4：成熟的DC细胞表型鉴定，其中，A：DC细胞镜下形态；B：DC细胞成熟表面maker检测；

图5：原代肿瘤细胞裂解效果检测，其中，A：镜下观察原代肿瘤裂解效果；B：流式检测原代肿瘤细胞裂解效果；

图6：DC细胞吞噬原代肿瘤细胞裂解物效率检测，其中，A：DiI标记原代肿瘤细胞效果检测；B：DC疫苗对原代肿瘤细胞裂解物吞噬效果检测；

图7：反应性T细胞对原代肿瘤细胞的体外杀伤效果检测，其中，A：反应性T细胞对原代肿瘤细胞的直接杀伤作用；B：细胞因子IL-2的表达；C：细胞因子TNF-α的表达；D：细胞因子IFN-γ的表达。

图8：反应性T细胞对原代肿瘤细胞的体内杀伤效果检测，其中，A：每组小鼠的最终肿瘤大小和体积；B：肿瘤体积大小随时间变化的比较；C：生存曲线。

具体实施方式

以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1原代肿瘤细胞培养

1.体外培养原代肿瘤细胞

1)试剂配制：

Complete DMEM＝DMEM(Gibco)+10％FBS(Gibco)+1％双抗+1％L-G(Gibco)；Complete F medium：＝Complete DMEM+F12(Gibco)+0.1％ Insulin(Sigma-Aldrich)+0.1％ ROCK inhibitor(Enzo)+0.1％ Hydrocortisone(Sigma-Aldrich)；

消化酶＝DMEM(Gibco)+A、H、R酶(Miltenyi)；

2)提前24小时复苏1辐照后的滋养层细胞，2ml complete F medium重悬后接种于6孔板中，每孔1ml细胞悬液；

3)通过活检获取新鲜肿瘤样本，BS洗干净，眼科剪反复剪切至小碎片1-5mm3后，加入5ml消化酶，37度，摇床40rmp，消化30min，用100um的细胞筛蒋消化物过滤于15ml的离心管中，离心收集沉淀；

4)离心后的细胞用2ml Complete F medium培养基重悬，加入接种有滋养层细胞的孔板中，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；

5)培养72h后进行半量/全量换液处理，当原代肿瘤细胞融合达90％时，进行细胞收获。

6)每3-4天进行1：2-1：5的细胞传代。

镜下观察培养的原代肿瘤细胞，如图1A所示为第0代和第3代的原代肿瘤细胞。并进一步使用Ckpan免疫荧光染色法验证其来源于上皮组织(图1B)。在扩增倍数方面，30天内的扩增倍数可达到20-30倍，因此可以实现活检小样本进行DC疫苗的制备(图1C)。

2.原代肿瘤细胞的生物学特征验证

为了验证传代后的原代细胞保留了亲本的的生物学特征，我们培养了三份原代肿瘤细胞，样本均由穿刺活检获取，传代至P12代，进行全基因组测序和RNA测序，染色体拷贝数(CNV)分析结果如图2A所示，当X≥10％为无害事件，即传代到第12代的原代细胞其染色体拷贝数正常。RNA测序分析显示，基因表达与亲本组织无明显差异(图2B-C)。

3.原代肿瘤细胞团的致瘤性验证

进一步取出上一步体外培养的细胞团，消化重悬得到单细胞悬液，经皮下注如裸鼠体内，实验组(CR组)每只裸鼠注入5.0×106个细胞，对照组注入等体积的生理盐水，观察小鼠的成瘤情况，如图3所示，在注射后的第21天CR组成功长出皮下移植瘤。

实施例2DC细胞培养

所用DC细胞为外周血来源，采集患者外周血50-100ml，按照1:1的稀释比,将全血用PBS缓冲液进行稀释，并转移到50ml离心管中。在新的50ml离心管中先加入15ml人外周血淋巴细胞分离液(TBD)，之后沿壁小心加入25ml稀释后的全血,不可破坏两种液体之间的分界面。750g速度离心20分钟，设置离心机慢升慢降。离心后，自下往上依次为红细胞、ficoll层、白细胞层、血清层。将白细胞层吸取到新的50ml离心管中，加PBS洗涤后弃上清，用RPMI1640(Gibco)培养基进行重悬，37度培养2小时贴壁，将悬浮细胞吸出冻存，贴壁细胞加DC培养因子培养(CytoCares)。每2-3天更换新鲜培养液，并补加DC培养因子。第5天换成成熟培养因子继续培养48小时，镜下观察DC细胞伸出触角，如图4A所示。并进一步对其表面成熟maker进行检测，如图4B所示，成熟makerCD83表达较高。

实施例3DC疫苗制备

1.原代肿瘤细胞裂解

收集实施例1中培养的肿瘤原代细胞，利用反复冻融法(液氮冻20min后室温溶解，重复6次冻融)裂解肿瘤原代细胞。裂解效果采用镜下观察和流式检测法进行检测，如图5A所示，裂解后镜下观察不到完整细胞形态，同时如图5B所示裂解后流式细胞术检测显示基本为细胞碎片，与对照组相比无完整的细胞颗粒。

2.原代肿瘤细胞裂解物与DC细胞共孵育

为了检测DC细胞对原代肿瘤细胞裂解物的吞噬效果，取一部分原代肿瘤细胞进行DiI标记，如图6A所示原代肿瘤细胞被DiI标记效率较高。并进一步对原代肿瘤细胞进行裂解后与上述实施例2中培养到第4天的DC细胞按1:1的比例(以细胞数量计)加入肿瘤原代细胞裂解物进行孵育。孵育24小时后，全量换液，换为DC细胞成熟因子(CytoCares)继续培养48小时，即可获得DC疫苗。并进一步检测DC细胞对原代肿瘤裂解物吞噬效果，如图6B所示，首先用HLA-DR标记出DC细胞，然后观察DC细胞上DiI信号值，与没有裂解的原代肿瘤细胞相比DC细胞对裂解后的原代肿瘤细胞表现较高的吞噬能力。

实施列4DC疫苗功能验证

1.反应性T细胞(Ttr)制备

复苏实施例2中冻存的悬浮细胞，二氧化碳培养箱培养2小时(37℃、5％ CO

2.反应性T细胞制备对原代肿瘤细胞的体外杀伤性检测

将上述制备的反应性细胞以0.5:1，1:1，2:1，5:1与原代肿瘤细胞进行共培养，培养24小时后检测原代肿瘤细胞的裂解情况，并检测细胞因子的表达情况。如图7所示，反应性T细胞的杀伤性高于没有被DC疫苗激活的对照T细胞对原代肿瘤细胞的杀伤性。

3.反应性T细胞对原代肿瘤细胞的体内杀伤性检测

为了研究肿瘤反应性T细胞是否在体内抑制原发性肿瘤细胞的生长，我们继续在NSG小鼠皮下注射原代肿瘤细胞，1周后接受低剂量(5.0×106)或高剂量(1.0×107)的尾静脉注射。结果表明，肿瘤反应性T细胞在体内也能明显抑制原代肿瘤的生长，且高剂量的效果优于低剂量(图8A-B)。小鼠的存活时间显示出相同的趋势(图8C)。