一种双交联水凝胶及其作为伤口愈合敷料的应用

技术领域

本发明属于伤口愈合敷料技术领域，具体涉及一种双交联水凝胶及其作为伤口愈合敷料的应用。

背景技术

皮肤作为身体最大的防御器官、人体第一道防线，很容易受到外部刺激，包括强烈冲击、剧烈摩擦和尖锐切割等，往往会导致皮肤创伤。严重的皮肤创伤如果没有得到及时有效的治疗，往往会导致伤口感染、愈合延迟、瘢痕增生甚至组织坏死。

目前已经广泛应用于临床的各种纱布、绷带具备保护伤口的作用，但是仍然会对伤口愈合造成不利影响，如异物反应、敷料与伤口粘连、伤口感染等。这些材料只能为伤口提供物理保护，对伤口的闭合和愈合的效益有限。目前已经开发了许多具有独特生物化学功能的水凝胶，这些水凝胶着眼于促进伤口愈合速度上，即通过引入药物或生物活性因子改变伤口的微环境，加快伤口愈合的各种反应，通过发挥材料的生物化学功能促进伤口愈合。但是，一种能够加速伤口闭合、促进伤口愈合、具有组织粘附能力，并且对温度敏感的敷料依旧是一项有待解决的技术问题。

发明内容

本发明一方面提供了一种双交联水凝胶(PNI-HA)，由两种交联网络互相交织而成，其中一种为：由N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)与N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)通过自由基聚合反应形成聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)，另一种为：由透明质酸(HA)与戊二醛(GTA)发生亲核加成反应形成交联网络。

本发明一方面提供了一种双交联水凝胶的制备方法，步骤如下：

1)将NIPAM和MBA加入到HA溶液中，再加入引发剂，搅拌后，加入促进剂，得到半互穿交联网络(SIPN)；

2)将SIPN直接浸泡在含有GTA的丙酮溶液中，然后用蒸馏水浸泡去除GTA和丙酮，得到PNI-HA。

进一步的，所述搅拌的过程为在室温下进行；搅拌时间为30min。所述搅拌的过程还可以在氮气保护下或低温保护下或冰浴环境下。条件筛选发现室温下不影响该材料的制备。所述室温指的是18～25℃。

进一步的，所述丙酮为80％丙酮溶液，在丙酮溶液中的浸泡时间为24h。

进一步的，所述丙酮溶液的pH值低于4。优选1～2之间。

进一步的，HA选用分子量为500kDa～2000kDa之间。优选：700～800kDa之间。

进一步的，HA溶液浓度不超过1％。

进一步的，NIPAM、MBA质量比为1：0.06。

进一步的，引发剂选自过硫酸盐、含偶氮有机引发剂等。

进一步的，促进剂选自四甲基乙二胺、三乙胺等。

本发明一方面提供了一种双交联水凝胶在作为伤口愈合敷料中的应用。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

1、本发明在深刻认识伤口愈合的生物学原理之上，制备了一种新型的双交联水凝胶，将加速伤口闭合、促进伤口愈合、具有组织粘附能力，并且对温度敏感的多项要求融合在一起，满足伤口愈合的需要。

2、与现有的伤口敷料相比，PNI-HA通过席夫碱作用牢固粘附在皮肤上，协同热响应自收缩能力，通过粘附和机械作用收缩伤口；同时具有降低炎症反应、减少胶原沉积、促进新生血管生成的生化作用，促进伤口愈合。

3、PNI-HA制作环境要求低，制备方法简单，原料易得，可大量制备。

4、本发明所述的水凝胶所采用的制备成分不单单是各自功能的考虑，各成分之间相互配合是实现水凝胶性能的重要因素。PNIPAM具有热响应自收缩性。HA的加入增强了水凝胶的结构密度，提升了机械性能；同时增强了水凝胶的柔软性，有助于水凝胶贴合创面，避免敷料对伤口产生二次损伤；此外，提高了水凝胶的生物相容性，增强水凝胶促进伤口愈合的能力。GTA的加入提高了HA的搭载率；同时增强了水凝胶的粘附力，有助于水凝胶紧密贴合创面，避免微生物入侵，协同PNIPAM的热响应自收缩能力发挥促进伤口闭合的功能。

5、热响应材料NIPAM，由亲水性酰胺基(-CONH-)和疏水性异丙基(-CH(CH

6、HA是一种存在于皮肤细胞外基质中的天然大分子，它在维持湿润微环境、抑制炎症反应和加速皮肤无疤再生方面具有明显效果。然而，传统的HA材料对皮肤的组织粘附性低。GTA交联的HA水凝胶(HA-GTA)可以增强材料的组织粘附性，这是因为戊二醛暴露的醛基与组织表面的氨基发生席夫碱反应。

7、在互穿聚合物网络(IPN)中，PNIPAM赋予水凝胶优异的热响应自收缩能力；HA-GTA可以增强水凝胶的组织粘附性、赋予水凝胶生物化学功能。与目前已有的其他伤口敷料相比，该材料通过生物力学活性和生物化学功能相结合，同时实现伤口快速闭合和促进伤口愈合两种策略。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：PNI、PNI-0.5HA、PNI-1.0HA的电镜图。

图2：PNI-HA的热响应自收缩性，其中，(A)PNI、PNI-0.5HA和PNI-1.0HA热响应自收缩图像，(B)水凝胶从25℃移至37℃收缩率的变化，(C)水凝胶在37℃下的收缩率随时间的变化，(D)PNI-1.0HA在不同温度(25℃和37℃)下经历3次“收缩-膨胀”循环后的SR变化。

图3：PNI-HA的热响应粘附性，其中，(A)在不同温度(25℃、29℃、33℃、37℃)下，最终尺寸一致的水凝胶的粘附强度热图，(B)在25℃下初始尺寸一致的水凝胶粘附强度随温度的变化。

图4：PNI-HA介导创面闭合，其中，(A)PNI和PNI-1.0HA在0、2和4h介导伤口闭合的图像，(B)图像(A)伤口区域的堆叠放置比较，(C-D)2h和4h伤口面积的定量分析。

图5：PNI-HA介导创面愈合，其中，(A)PNI和PNI-1.0HA介导的21d伤口愈合的图像，(B-C)叠加放置的伤口面积和定量的伤口闭合率形成图像(A)，(D-E)H&E染色(绿色剪头表示炎症细胞)，(F)H&E染色中炎症细胞定量(160×240μm)，(G-I)Masson染色、CD31(红色箭头表示CD31阳性血管)和整合素β1免疫组化染色。

具体实施方式

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：PNI的制备

NIPAM(50mg/mL)和MBA(3mg/mL)溶于蒸馏水。然后将过硫酸铵(APS)(5mg/mL)作为引发剂加入到NIPAM/MBA溶液中，在室温下搅拌30min。随后，加入N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)(1.5mg/mL)作为促进剂加速网络的形成。用蒸馏水彻底冲洗后，得到PNI水凝胶。电镜图见图1。

实施例2：PNI-HA的制备

将不同量(5mg/mL、10mg/mL)的HA(Mw＝700～800kDa)分别溶于蒸馏水中制成两种HA溶液。然后将NIPAM(50mg/mL)和MBA(3mg/mL)溶解在HA溶液中，再加入过硫酸铵(APS)(5mg/mL)作为引发剂，在室温下搅拌30min。再加入四甲基乙二胺(TEMED)(1.5mg/mL)作为促进剂，加速PNI网络的形成，得到半互穿交联网络(SIPN)。为了进一步促进水凝胶中HA的交联，将SIPN水凝胶直接浸泡在含有100mM GTA和0.01M HCl的80％丙酮溶液中24h。用蒸馏水浸泡4h去除戊二醛和丙酮后，得到PNI-0.5HA(0.5％HA水凝胶)和PNI-1.0HA(1％ HA水凝胶)。电镜图见图1。

实施例3：PNI-HA的热响应自收缩性

方法：将PNI-HA分别放入不同温度(25℃、29℃、33℃、37℃)的蒸馏水中，记录样品图片。为了研究水凝胶的热响应自收缩与时间的关系，计算了水凝胶从25℃放置到37℃后面积收缩的变化。同时，为计算热响应自收缩性引起的溶胀率(SR)变化，还对样品重量进行了称重。为分析热响应自收缩的可重复性，测定了PNI-1.0HA在25℃或37℃蒸馏水孵育3h后，经历3次“收缩-膨胀”循环后的SR变化。

结果：PNI、PNI-0.5HA和PNI-1.0HA具有典型的热响应自收缩现象(图2A)。将水凝胶从25℃移至37℃来测量自收缩速度(图2B)。在前240min可以观察到水凝胶明显收缩，在360min收缩达到最大值，然后在后续时间里保持相对稳定。测定了PNI和PNI-HA在不同温度下的溶胀平衡(图2C)。随着温度的升高，所有水凝胶的体积都明显缩小了。同时，SR显著降低。在25～37℃的反复循环中，还观察到了水凝胶溶胀平衡的变化(图2D)。结果表明，3次循环后溶胀平衡无明显变化，表明PNI-HA的热响应自收缩性具有良好的重复性。

实施例4：PNI-HA的热响应粘附性

采用改进的拉伸实验方法，在台式拉伸实验机上检测PNI-1A在不同温度(25℃、29℃、33℃、37℃)下的组织粘附性。简单地说，用两张猪皮在25℃时贴在初始尺寸一致(直径12mm，厚度1mm)的水凝胶两侧，或在不同温度(25℃、29℃、33℃、37℃)下最终尺寸一致(直径5mm，厚度1mm)的水凝胶两侧。然后，猪皮被拉向垂直于水凝胶表面的相反方向，在完全分离前，记录最大拉力和相关的粘合强度。

结果：采用改进的拉伸实验方法定量测定PNI-HA的组织粘附性。结果观察到所有水凝胶都表现出对温度敏感的粘附强度。如图3A所示，在相同尺寸下，HA的引入和温度的升高都显著增强了水凝胶的粘附能力。在25℃下使用初始尺寸一致的水凝胶，观察温度对水凝胶粘附强度的影响。如图3B所示，温度的升高也显著增强了水凝胶的组织粘附性。PNI-HA不仅可以像其他临床使用的胶水一样粘附在伤口上，而且较高的粘附强度有助于通过热响应自收缩加速伤口闭合，从而促进伤口愈合。

实施例5：PNI-HA介导创面闭合

方法：1.选取5-6周龄30-40g的雄性昆明小鼠在无菌条件下制作全层皮肤缺损模型。

2.对照组创口暴露在空气中不作处理，实验组使用PNI-HA覆盖创口及其周围皮肤。

3.为分析PNI-HA在热刺激下自收缩介导创面闭合的作用，分别在0、2、4h记录创面闭合的图像。然后标记出伤口区域，比较小鼠伤口随时间的堆叠位置。用公式(1)计算伤口闭合率WCR(％):

其中Area

结果：如图4A所示，PNI-HA通过热响应自收缩显著促进大鼠皮肤创面闭合。为了更直观地观察闭合变化，我们对不同时间的创面进行了堆叠放置(图4B)。结果再次证实了PNI-1.0HA的热响应自收缩性加速伤口闭合的效果最明显。进一步定量比较了2h和4h较0h的创面面积缩小程度(图4C/D)，PNI-1.0HA在2h时创面面积减少了约26.6％，在4h时减少了约45.9％，显著高于PNI组(2h时减少11.0％，4h时减少21.1％)和对照组(2h时减少4.6％，4h时减少10.5％)。总体而言，PNI-1.0HA表现出良好的热响应自收缩性，加速创面闭合。

实施例6：PNI-HA介导创面闭合PNI-HA介导创面愈合

方法：1.选取5-6周龄30-40g的雄性昆明小鼠在无菌条件下制作全层皮肤缺损模型。

2.对照组创口暴露在空气中不作处理，实验组使用PNI-HA覆盖创口及其周围皮肤。分别于第0、3、7、10、14、21d记录创面愈合的图像。

3.并于第21d采集各组创面组织标本进行组织学评价(H&E、Masson染色、CD31免疫组化、整合素β1免疫组化)。

结果：图5A所示，21d的时间里各组创面面积逐渐减小，其中PNI-1.0HA创面愈合最好。伤口叠放的结果再次证实了PNI-1.0HA促进伤口愈合的能力(图5B)。具体来说，与第0天相比，PNI-1.0HA组在第3天的伤口面积减少了约43.7％，伤口愈合的速度明显快于对照组(19.9％)和PNI组(28.3％)。同样地，在前10天，PNI-1.0HA组伤口愈合效果最佳(图5C)。观察肉芽组织形成，进行H&E染色，如图5D/E所示。结果发现PNI和PNI-1.0HA组均有明显残余的水凝胶物质(绿色箭头标注)，但PNI和PNI-1.0HA组炎症细胞浸润程度明显低于对照组。对炎症细胞进行定量结果(图5F)显示，PNI-1.0HA组炎症细胞数量明显少于PNI组，而且在PNI-1.0HA组的炎症细胞比PNI组少。通过Masson染色进一步评估创面部位的胶原沉积(图5G)。与PNI-1.0HA相比，对照组和PNI组的深蓝色染色面积更大(胶原沉积更多)，说明瘢痕组织形成率更高。

通过CD31免疫组化染色评估血管生成(图5H)，红色箭头表示CD31阳性血管。与对照组相比，PNI-1.0HA组CD31阳性细胞显著增加，提示PNI-1.0HA促进血管生成，促进创面愈合。整合素β1在上皮细胞再生中起关键作用，如图5I所示，与对照组相比，PNI-1.0HA组上皮区蓝色较深，整合素β1表达水平较高。

综上所述，PNI-HA表现出热响应性和组织粘附性，利用水凝胶的热响应自收缩和HA的优良生物功能，显著促进创面闭合和创面愈合。这些结果表明，PNI-HA为加速伤口闭合和促进伤口愈合的伤口敷料提供了一个很有意义的策略。