微生物气溶胶的群落多样性检测的预处理方法

技术领域

本发明涉及微生物预处理技术领域，具体而言，涉及微生物气溶胶的群落多样性检测的预处理方法。

背景技术

生物气溶胶是指空气中所有来自生物的悬浮颗粒。从理论上讲，所有的生物材料都可以直接释放或在地球表面的各种干扰下重新悬浮到空气中，如土壤、海洋、动物、森林、人类等。一旦进入空气，气溶胶颗粒可能会经历人体吸入、干/湿沉降、空中运输、冰核化、云凝结、大气转化等过程。因此，它们对传染病传播、过敏性疾病、生物安全、大气化学以及气候都有重要影响。微生物组分在生物气溶胶中，因其对人体健康的负面影响，及其在生物气溶胶的健康风险评估，健康危害评价中的重要作用，一直是众多研究者的研究热点。

而关于致病微生物的群落多样性研究则属于微生物气溶胶研究中的重点研究对象。群落多样性的研究是进行群落代谢途径与群落功能等多方面的分析基础。而在生物气溶胶的样品采集时，需要持续性地获得大批量样品进行群落多样性的研究，往往消耗大量的人力和时间成本，而目前的传统方法缺少高效而成本合算的方法能方便地经济地获得大量高质量样品用于群落多样性检测。

发明内容

本发明解决的问题是如何解决群落多样性检测时样品需求量大且成本高的问题。

为解决上述问题，本发明提供一种微生物气溶胶的群落多样性检测的预处理方法，包括如下步骤：

步骤1：在无菌环境下，对实验器具消毒，将微生物气溶胶的采样膜剪碎成采样膜碎片；

步骤2：将所述采样膜碎片转移到离心管中，再加入1×PBS缓冲液或超纯水浸没所述采样膜碎片；

步骤3：将所述离心管置于摇床振摇，再经过超声处理后，得到混合液，完成群落多样性检测的预处理。

进一步地，步骤1中，所述无菌环境包括超净工作台、生物安全柜及其他能提供无菌清洁操作环境的设备中的一种。

进一步地，步骤1中，所述消毒采用的消毒液为75％的乙醇溶液。

进一步地，步骤2中，所述离心管需要经过灭菌处理后使用，所述灭菌处理方式包括紫外线灭菌或高温高压蒸汽灭菌。

进一步地，所述紫外线灭菌包括：

用超声清洗或手工清洗晾干，然后用1％的盐酸浸泡或75％的乙醇溶液浸泡1-2h，接着用流水冲洗4-5次后，再用蒸馏水冲洗2-3次，晾干，然后紫外线照射30-45min。

进一步地，所述高温高压蒸汽灭菌包括：

用洗洁精超声清洗后，再用超纯水冲洗干净并烘干，置于高压蒸汽灭菌锅中121℃高压消毒20h并烘干。

进一步地，步骤3中，所述离心管置于摇床振摇的时间为15-30min。

进一步地，步骤3中，所述超声次数为3次，每次超声时间为15-20min，每次间隔2-5min。

本发明所述的微生物气溶胶的群落多样性检测的预处理方法相对于现有技术的有益效果为：本发明的预处理方法相对简单，通过在无菌环境下操作，减少干扰，又利用1×PBS缓冲液或超纯水作为等渗溶液，极大地保护了微生物结构的完整性，有助于后续DNA的提取，同时减少了多样性检测对样品量的需求，降低了样品量，降低了研究成本，适于推广和普及。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。

本发明实施例一种微生物气溶胶的群落多样性检测的预处理方法，包括如下步骤：

步骤1：在无菌环境下，对实验器具消毒，将微生物气溶胶的采样膜剪碎成采样膜碎片；

步骤2：将采样膜碎片转移到离心管中，再加入1×PBS缓冲液或超纯水浸没采样膜碎片；

步骤3：将离心管置于摇床振摇，再经过超声处理后，得到混合液，完成群落多样性检测的预处理。

本发明实施例所述的预处理方法相对简单，通过在无菌环境下操作，减少干扰，又利用1×PBS缓冲液或超纯水作为等渗溶液，极大地保护了微生物结构的完整性，有助于后续DNA的提取，同时减少了多样性检测对样品量的需求，降低了样品量，降低了研究成本，适于推广和普及。

在一些具体的实施例中，步骤1中，无菌环境包括超净工作台、生物安全柜及其他能提供无菌清洁操作环境的设备中的一种。

本实施例中的对环境的要求较高，需要在无菌或接近无菌的环境下进行，以减少对群落多样性检测的影响，但是对温度和湿度没有特别的要求，操作时，相应的人需要佩戴医用口罩，手术灭菌手套，穿着洁净的实验服，长发操作人员最好将头发扎入实验帽中进行该预处理操作，进一步保证无菌操作。

在一些具体的实施例中，步骤1中，消毒采用的消毒液为75％的乙醇溶液。

具体地，用75％的乙醇溶液进行消毒处理，具有更强的杀菌作用，同时极大地减少影响后续对于微生物群落基因组的测序。若使用无水乙醇消毒，会导致微生物表面蛋白质凝固，因而起不到良好的杀菌作用，且进入微生物内部的酒精会破坏其细胞结构，核酸也因此而变性，影响后续检测。本实施例的75％的乙醇溶液的制备方法为：将无水乙醇和双蒸水按3:4的比例稀释，使用前可在封闭的容器中在室温下储存1周。

在一些具体的实施例中，步骤2中，离心管需要经过灭菌处理后使用，灭菌处理方式包括紫外线灭菌或高温高压蒸汽灭菌。由此，能够避免离心管内其他菌种对微生物多样性检测的影响，提高检测的准确率。

在一些具体的实施例中，紫外线灭菌包括：

用超声清洗或手工清洗晾干，然后用1％的盐酸浸泡或75％的乙醇溶液浸泡1-2h，接着用流水冲洗4-5次后，再用蒸馏水冲洗2-3次，晾干，然后紫外线照射30-45min。

由此，通过紫外线照射实现对离心管内菌种的灭菌，提高离心管的洁净度。

在一些具体的实施例中，高温高压蒸汽灭菌包括：

用洗洁精超声清洗后，再用超纯水冲洗干净并烘干，置于高压蒸汽灭菌锅中121℃高压消毒20h并烘干。

由此，在实现离心管灭菌的同时，有利于在实施例环境下进行操作。

在一些具体的实施例中，步骤3中，离心管置于摇床振摇的时间为15-30min。由此，充分振摇以使采样膜碎片上的微生物与1×PBS缓冲液或超纯水充分混合均匀，同时防止在摇匀状态下，微生物的结构组织遭到破坏。

在一些具体的实施例中，步骤3中，超声次数为3次，每次超声时间为15-20min，每次间隔2-5min。优选地，每次超声15min，时间间隔为3min时，超声效果更好。由此，实现微生物的分散均匀，有利于后续提取操作。

具体实施例1

本实施例一种微生物气溶胶的群落多样性检测的预处理方法，包括如下步骤：

步骤1：在超净工作台中，用75％的乙醇溶液对实验器具消毒，使用浸过体积浓度为75％的乙醇溶液的无纺棉擦拭实验器具表面，过程中尽量减少手与器具的接触；用消毒后的剪刀将微生物气溶胶的采样膜剪碎成采样膜碎片；

步骤2：用经过消毒处理的镊子将剪碎的采样膜碎片转移到50ml经过灭菌处理的离心管中，采用紫外线灭菌：用超声清洗晾干，然后用1％的盐酸浸泡浸泡1.5h，接着用流水冲洗5次后，再用蒸馏水冲洗3次，晾干，然后紫外线照射40min，完成灭菌处理；使用10ml移液枪向50ml经过灭菌处理的离心管中加入1×PBS缓冲液，缓冲液需要浸没所有采样膜碎片；

步骤3：将离心管置于摇床振摇20min，再经过3次超声，每次超声15min，时间间隔为3min后，得到混合液，完成群落多样性检测的预处理。

将混合液的用10ml移液枪全部移到到鸡心瓶中，再用无菌注射器取鸡心瓶里的溶液10ml到15ml灭过菌的离心管中，进行后续DNA提取操作。

表1为经过本实施例的微生物气溶胶的群落多样性检测的预处理方法后，DNA的提取率数据表，可见DNA提取率得到明显提升。

表1

具体实施例2

本实施例一种微生物气溶胶的群落多样性检测的预处理方法，包括如下步骤：

步骤1：在超净工作台中，用75％的乙醇溶液对实验器具消毒，使用浸过体积浓度为75％的乙醇溶液的无纺棉擦拭实验器具表面，过程中尽量减少手与器具的接触；用消毒后的剪刀将微生物气溶胶的采样膜剪碎成采样膜碎片；

步骤2：用经过消毒处理的镊子将剪碎的采样膜碎片转移到50ml经过灭菌处理的离心管中，采用紫外线灭菌：用超声清洗晾干，然后用1％的盐酸浸泡浸泡1h，接着用流水冲洗4次后，再用蒸馏水冲洗3次，晾干，然后紫外线照射30min，完成灭菌处理；使用10ml移液枪向50ml经过灭菌处理的离心管中加入1×PBS缓冲液，缓冲液需要浸没所有采样膜碎片；

步骤3：将离心管置于摇床振摇15min，再经过3次超声，每次超声20min，时间间隔为2min后，得到混合液，完成群落多样性检测的预处理。

将混合液的用10ml移液枪全部移到到鸡心瓶中，再用无菌注射器取鸡心瓶里的溶液10ml到15ml灭过菌的离心管中，进行后续DNA提取操作。

具体实施例3

本实施例一种微生物气溶胶的群落多样性检测的预处理方法，包括如下步骤：

步骤1：在超净工作台中，用75％的乙醇溶液对实验器具消毒，使用浸过体积浓度为75％的乙醇溶液的无纺棉擦拭实验器具表面，过程中尽量减少手与器具的接触；用消毒后的剪刀将微生物气溶胶的采样膜剪碎成采样膜碎片；

步骤2：用经过消毒处理的镊子将剪碎的采样膜碎片转移到50ml经过灭菌处理的离心管中，采用紫外线灭菌：用超声清洗晾干，然后用1％的盐酸浸泡浸泡2h，接着用流水冲洗5次后，再用蒸馏水冲洗2次，晾干，然后紫外线照射45min，完成灭菌处理；使用10ml移液枪向50ml经过灭菌处理的离心管中加入1×PBS缓冲液，缓冲液需要浸没所有采样膜碎片；

步骤3：将离心管置于摇床振摇30min，再经过3次，每次超声18min，时间间隔为5min后，得到混合液，完成群落多样性检测的预处理。

将混合液的用10ml移液枪全部移到到鸡心瓶中，再用无菌注射器取鸡心瓶里的溶液10ml到15ml灭过菌的离心管中，进行后续DNA提取操作。

虽然本发明公开披露如上，但本发明公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本发明公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。