血管化肺癌类器官球聚体模型的构建方法、血管化肺癌类器官球聚体模型及其应用

技术领域

本申请涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种血管化肺癌类器官球聚体模型的构建方法、血管化肺癌类器官球聚体模型及其应用。

背景技术

癌症是一个高度结构化的复杂生态系统，包括肿瘤细胞和大量非肿瘤细胞，均嵌入在细胞外基质中。肿瘤微环境(TME)包括多种免疫细胞、癌症相关成纤维细胞、内皮细胞、周细胞以及其他多种组织驻留细胞，这种复杂环境通过可溶性因子、细胞间接触和细胞外基质(ECM)重塑介导的复杂相互信号传导机制，直接或间接地影响肿瘤细胞表型，导致肿瘤的高度异质性。TME细胞参与癌症进展的每个阶段，影响肿瘤的发生、进展、侵袭、内渗到转移性传播和生长，TME细胞及其分泌的分子被认为在癌症的发病机制中起着关键作用，其代表着有吸引力的治疗靶点，肿瘤细胞与介质之间复杂的相互作用对于合理开发有效的抗癌药物至关重要。

癌症的异质性极大地导致了不同的患者治疗反应，包括治疗耐药性，这种复杂性已经成为发现治疗失败的具体机制的一个相当大的障碍。患者特异性肿瘤的器官型模型能够改变对癌症异质性的理解及其对个性化医疗的影响，这些进步部分归功于类器官模型在体外稳定保存母体肿瘤的遗传、蛋白质组学、形态和药物特征的能力，同时也提供了前所未有的基因组和环境操作。但是，肿瘤类器官模型很难完全表征原始组织，因为它们通常缺乏完整的微环境，肿瘤类器官与肿瘤微环境可被比喻为“种子和土壤”，构建具有微环境的肿瘤类器官模型进行药物检测，将更接近人体对药物作用的真实反应。

血管抑制剂是一类重要的抗肿瘤药物，1971年，Folkman教授提出了肿瘤血管生成理论学说，指出肿瘤的局部生长和远处转移都离不开肿瘤新生血管的生成。实体肿瘤的生长和转移有一个从血管前期到血管期的转化过程，通过肿瘤血管抑制剂，可以抑制肿瘤新生血管增生因子VEGF的形成，从而诱发血管内皮细胞自然凋亡，破坏肿瘤新生血管网。但是传统体外模型难以检测此类药物的抗肿瘤效果，肿瘤模型如肿瘤细胞模型、肿瘤类器官模型、肿瘤聚集体模型仅包含肿瘤细胞，不对血管抑制剂类药物产生反应，而血管类模型仅能反应对血管生成作用，不能进一步反映对肿瘤的效果。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种血管化肺癌类器官球聚体模型的构建方法、血管化肺癌类器官球聚体模型及其应用，通过本申请所述构建方法构建得到的血管化肺癌类器官球聚体模型的仿真性好且结构致密，更接近人体对药物作用的真实反映，能够应用于抗肿瘤药物的筛选以及抗肿瘤药物的敏感性测试。

第一方面，本申请提供了一种血管化肺癌类器官球聚体模型的构建方法，所述构建方法包括：步骤S100：制备或获取肺癌类器官，所述肺癌类器官经消化获得肺癌类器官细胞，获取成纤维细胞以及血管内皮细胞，步骤S200：将所述肺癌类器官细胞、所述成纤维细胞以及所述血管内皮细胞进行混合，培养基重悬，得到肺癌类器官多细胞悬液，步骤S300：将所述肺癌类器官多细胞悬液接种至培养腔或培养孔中，进行成球培养，自组装形成所述血管化肺癌类器官球聚体模型。优选地，将制备或获取的所述肺癌类器官消化为单细胞得到所述肺癌类器官细胞。

在一些实施方式中，所述肺癌类器官选自原代提取的肺癌类器官、iPS干细胞分化的肺癌类器官或者待传代的肺癌类器官中的任一者。具体地，一些实施方式中，所述肺癌类器官为原代提取的肺癌类器官，将所述原代提取的肺癌类器官消化为单细胞得到所述肺癌类器官细胞。另一些实施方式中，所述肺癌类器官为iPS干细胞分化的肺癌类器官，将所述iPS干细胞分化的肺癌类器官消化为单细胞得到所述肺癌类器官细胞。其他实施方式中，所述肺癌类器官为待传代的肺癌类器官，将所述待传代的肺癌类器官消化为单细胞得到所述肺癌类器官细胞。

在一些实施方式中，将所述肺癌类器官多细胞悬液接种至培养腔中进行成球培养，所述培养腔具有U型底部；在另一些实施方式中，将所述肺癌类器官多细胞悬液接种至培养孔中进行成球培养，所述培养孔具有U型底部。优选地，所述培养腔和/或所述培养孔为低粘附U型培养腔和/或低粘附U型培养孔，以利于后续的自组装成球培养。

本申请所述的血管化肺癌类器官球聚体模型的构建方法首先将经肺癌类器官消化得到的肺癌类器官细胞与成纤维细胞以及血管内皮细胞三者按照合适的比例混合，然后依次进行多个阶段的成球培养，在培养过程中利用低粘附U型培养器皿以利于形成结构紧密的球状体结构。本申请采用的肺癌类器官细胞一方面能够真实反映肺肿瘤组织的生理特征，另一方面肺癌类器官细胞可增值以及传代，以使制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型的仿真性好。同时，本申请采用适量的成纤维细胞以及适量的血管内皮细胞与肺癌类器官细胞共培养，可以生长得到由成纤维结构和微血管构成的肿瘤微环境，用以为肺癌类器官提供完整的肺肿瘤微环境，进一步提升了制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型的仿真性，使其能够更好地表征原始组织。而且，本申请所述的构建方法中采用成球培养加细胞培养支架材料，例如水凝胶、基质胶等细胞培养胶，以利于在后续的药敏检测中观察细胞迁移，研究肿瘤侵袭。

在一些实施方式中，所述肺癌类器官细胞、所述成纤维细胞和所述血管内皮细胞的细胞数目比为1:(0.1～1):(0.05～1)。

在一些实施方式中，所述成纤维细胞包括肺癌相关成纤维细胞，且满足：所述肺癌类器官细胞、所述肺癌相关成纤维细胞和所述血管内皮细胞的细胞数目比为1:(0.4～0.8):(0.1～0.5)。所述肺癌类器官细胞、所述肺癌相关成纤维细胞以及所述血管内皮细胞的细胞数目比在上述范围时，构建得到的血管化肺癌类器官球聚体模型的结构更致密且细胞之间的联系更紧密，仿真性更好。优选地，所述肺癌类器官细胞、所述肺癌相关成纤维细胞和所述血管内皮细胞的细胞数目比为1:(0.7～0.8):(0.2～0.3)。

在一些实施方式中，所述肺癌类器官细胞、所述成纤维细胞和所述血管内皮细胞的细胞总数范围为5000个至2*10

在本申请中若没有特殊说明，培养基均为至少包括用于培养肺癌类器官细胞的成分以及用于培养血管内皮细胞的成分。

在一些实施方式中，所述培养基为混合培养基，所述混合培养基至少包括用于培养所述肺癌类器官的第一培养基以及用于培养所述血管内皮细胞的第二培养基。在所述混合培养基中，所述第一培养基和所述第二培养基的质量比为1:(0.5～2)。此时，利于肺癌类器官细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞的共培养，以使细胞间的联系更紧密，更利于血管化肺癌类器官球聚体的生长以及繁殖。优选地，所述第一培养基和所述第二培养基的质量比为1:(0.8～1.2)。

在一些实施方式中，所述成球培养包括第一阶段成球培养和第二阶段成球培养。所述第一阶段成球培养包括：将所述肺癌类器官多细胞悬液接种至具有U型底部的培养腔或U型底部的培养孔中进行团聚处理，所述团聚处理包括以950rpm～1050rpm离心5min～6min，以使肺癌类器官多细胞悬液中的细胞成团，再放入培养环境中进行培养，培养时间为1～5天，得到边界清晰且具有微血管的肺癌类器官球聚体模型中间体，然后进行所述第二阶段成球培养。其中，第一阶段的培养时间优选为2～3天。需要说明的是，在本申请中，若没有特殊说明，所述的培养环境均指37℃，5％CO

在一些实施方式中，所述第二阶段成球培养的条件包括：将含有所述类器官球聚体模型中间体的所述培养腔或所述培养孔中的原有培养基弃掉，加入水凝胶、基质胶等细胞培养胶，成胶后加入所述混合培养基，放入培养环境中进行培养，培养时间为1～2天。优选地，所述第二阶段的培养时间为1天。

在另一些实施方式中，所述第二阶段成球培养的条件包括：将含有所述类器官球聚体模型中间体的所述培养腔或所述培养孔中的原有培养基弃掉，加入水凝胶、基质胶等细胞培养胶，转移至药敏芯片培养腔或药敏芯片培养孔中，所述药敏芯片培养腔和所述敏芯片培养孔具有U型底部且相互连通，成胶后加入所述混合培养基，放入培养环境中进行动态培养，所述第二阶段的培养时间为1～2天。优选地，所述第二阶段的培养时间为1天。

在一些实施方式中，所述动态培养的条件包括：在培养环境中以15min～120min摇摆3°～10°的速度进行流动灌注培养。示例性地，在一些实施方式中，在培养环境中以摇摆角度3°/120min进行灌注培养；在另一些实施方式中，在培养环境中以摇摆角度7°/30min进行灌注培养；在其他实施方式中，在培养环境中以摇摆角度7°/15min进行灌注培养。

本申请所述的构建方法中，首先将肺癌类器官多细胞悬液接种至低粘附U型培养腔或低粘附U型培养孔中，然后依次进行第一阶段成球培养和第二阶段成球培养。经过所述第一阶段成球培养，可以得到边界清晰且具有微血管的肺癌类器官球聚体模型中间体，再向含有所述肺癌类器官球聚体模型中间体的低粘附U型培养腔或低粘附U型培养孔中继续加入水凝胶、基质胶等细胞培养胶，成胶后进行第二阶段成球培养，第二阶段成球培养可以是直接放入培养环境中的静态培养，也可以是放入培养环境中的动态培养，可以根据实际情况进行选择，本申请并不限制。经过本申请第二阶段加基质的成球培养，以使微血管继续生长形成大面积的复杂网络，利于在后续药物检测时观察细胞迁移，仿真性更好。

第二方面，本申请提供了一种血管化肺癌类器官球聚体模型，所述血管化肺癌类器官球聚体模型是通过上述的构建方法构建得到。所述血管化肺癌类器官球聚体模型具有球状体结构，其内部聚集生长有多个肺癌类器官，所述血管化肺癌类器官球聚体模型由内向外发散生长有微血管，所述血管化肺癌类器官球聚体模型还包括由成纤维结构和微血管构成的肿瘤微环境。

在一些实施方式中，所述血管化肺癌类器官球聚体模型的直径范围为250μm至800μm。

在一些实施方式中，所述血管化肺癌类器官球聚体模型的球状体内部具有坏死核，所述血管化肺癌类器官球聚体模型的直径范围为300μm至600μm。

在一些实施方式中，所述血管化肺癌类器官球聚体模型具有细胞增殖性，其细胞增殖程度由内向外呈梯度递增，所述血管化肺癌类器官球聚体模型的氧含量由内向外逐渐递增。

第三方面，本申请提供了上述血管化肺癌类器官球聚体模型在药物检测中的应用，所述药物检测包括药物筛选和/或药物敏感性检测。

在一些实施方式中，所述应用至少包括以下步骤：向含有所述血管化肺癌类器官球聚体模型的培养腔或培养孔中加入待测药物，放入培养环境中培养，培养时间为3～5天，检测所述血管化肺癌类器官球聚体模型的指标变化，所述指标变化包括血管化肺癌类器官球聚体模型的形状变化、大小变化、活性变化、血管形态变化、蛋白分子表达变化或分布变化中的至少一种。

在另一些实施方式中，所述应用至少包括以下步骤：向含有所述血管化肺癌类器官球聚体模型的药敏芯片培养腔或药敏芯片培养孔中加入待测药物，放入培养环境中动态培养，培养时间为3～5天，检测所述血管化肺癌类器官球聚体模型的指标变化，所述指标变化包括血管化肺癌类器官球聚体模型的形状变化、大小变化、活性变化、血管形态变化、蛋白分子表达变化或分布变化中的至少一种。

第四方面，本申请提供了一种药物检测方法，所述药物检测方法包括以下步骤：S100：制备或获取肺癌类器官，所述肺癌类器官经消化获得肺癌类器官细胞，获取成纤维细胞以及血管内皮细胞，S200：将所述肺癌类器官细胞、所述成纤维细胞以及所述血管内皮细胞进行混合，培养基重悬，得到肺癌类器官多细胞悬液，S300：将所述肺癌类器官多细胞悬液接种至培养腔或培养孔中，进行成球培养，自组装形成所述血管化肺癌类器官球聚体模型，S400：向含有所述血管化肺癌类器官球聚体模型的培养腔或培养孔中加入待测药物，放入培养环境中培养后，检测所述血管化肺癌类器官球聚体模型的指标变化。具体参数的选择可参照上述三个方面的内容，不再赘述。

本申请的技术方案与现有技术相比至少存在以下技术效果：本申请采用将肺癌类器官细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞三者共培养的方式构建血管化肺癌类器官球聚体模型，在培养过程中利用低粘附U型底培养腔或U型底培养孔进行多个阶段的成球培养，以形成球状体结构，同时，本申请通过调控三种细胞的细胞数目比在合适范围，以使制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型的结构更致密，细胞间的联系更紧密，仿真性好，能够完全表征原始组织，其相比于现有技术的模型，更适用于药物检测，特别是抗肿瘤血管生成相关药物的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例1制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型的测试图；

图2为本申请实施例1在制备血管化肺癌类器官球聚体模型的过程中比较了将肺癌类器官消化成单细胞以及不消化成单细胞两种情况的对比测试图；

图3为本申请实施例1在制备血管化肺癌类器官球聚体模型的过程中改变细胞间的细胞数目比的对比测试图；

图4为本申请实施例1制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型在药敏测试过程中的观测图；

图5为将图4中三组实验的裂解液采用化学发光酶标仪进行检测的结果图；

图6为本申请实施例2制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型在药敏测试过程中的观测图；

图7为将图6中的裂解液采用化学发光酶标仪进行检测的结果图；

图8为本申请采用的药敏芯片的结构示意图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

血管化肺癌类器官球聚体模型的构建方法

S100：制备或获取肺癌类器官，所述肺癌类器官经消化获得肺癌类器官细胞，获取成纤维细胞以及血管内皮细胞；

所述肺癌类器官细胞选自组织提取的肺癌类器官、iPS干细胞分化的肺癌类器官。可以为原代肺癌类器官或者待传代的肺癌类器官中的任一者。

优选地，所述肺癌类器官细胞选自由原代提取的肺癌类器官经消化为单细胞得到的肺癌类器官细胞或者由待传代的肺癌类器官经消化为单细胞得到的肺癌类器官细胞。

S200：将所述肺癌类器官细胞、所述成纤维细胞以及所述血管内皮细胞进行混合，培养基重悬，得到肺癌类器官多细胞悬液；

所述肺癌类器官细胞、所述成纤维细胞和所述血管内皮细胞的细胞数目比为1:(0.1～1):(0.05～1)；

优选地，所述成纤维细胞包括所述肺癌相关成纤维细胞，所述肺癌类器官细胞、所述肺癌相关成纤维细胞以及所述血管内皮细胞的细胞数目比为1:(0.4～0.8):(0.1～0.5)；

所述培养基为混合培养基，所述混合培养基至少包括用于培养所述肺癌类器官的第一培养基以及用于培养所述血管内皮细胞的第二培养基。其中，所述第一培养基和所述第二培养基的质量比为1:(0.5～2)。优选地，所述第一培养基和所述第二培养基的质量比为1:(0.8～1.2)。

S300：将所述肺癌类器官多细胞悬液接种至培养腔或培养孔中，进行成球培养，自组装形成血管化肺癌类器官球聚体模型。

具体地，将所述肺癌类器官多细胞悬液接种至具有U型底部的培养腔或具有U型底部的培养孔中进行成球培养，所述成球培养包括依次进行第一阶段成球培养和第二阶段成球培养。所述第一阶段成球培养的条件包括：将所述肺癌类器官多细胞悬液接种至具有U型底部的培养腔或具有U型底部的培养孔中，以950rpm～1050rpm离心5min～6min，放入37℃、5％CO

在一些实施例中，所述第二阶段成球培养的条件包括：将所述培养腔或所述培养孔中的原有培养基弃掉，加入水凝胶、基质胶等细胞培养胶，成胶后加入所述混合培养基，放入37℃、5％CO

在另一些实施例中，所述第二阶段成球培养的条件包括：将所述培养腔或所述培养孔中的原有培养基弃掉，加入水凝胶、基质胶等细胞培养胶，转移至药敏芯片培养腔或药敏芯片培养孔中，成胶后加入所述混合培养基，放入37℃、5％CO

所述动态培养的条件包括：在培养环境中以15min～120min摇摆3°～10°的速度进行流动灌注培养。示例性地，在37℃、5％CO

示例1

血管化肺癌类器官球聚体模型的制备(在U型孔板上形成血管化肺癌类器官球聚体模型)

S100：获取肺癌类器官细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞。

步骤1、选择原代提取或待传代的肺癌类器官，将提前预冷的PBS加入至培养孔板中，每孔中均加入PBS，收集到离心管中，4℃～6℃冷藏15min～20min，离心，去除上清，得到肺癌类器官沉淀；

步骤2、加入Tryple E酶解5min～10min，消化成单细胞后离心，去除上清，加入PBS再次离心，去除多余酶液，得到沉淀，加入混合培养基重悬，进行细胞计数，得到肺癌类器官悬液的细胞浓度；

其中，在所述混合培养基中，所述第一培养基和所述第二培养基的质量比为1:(0.5～2)。

步骤3、取肺癌相关成纤维细胞，消化成单细胞，用上述的混合培养基重悬，计数；

步骤4、取血管内皮细胞，消化成单细胞，用上述的混合培养基重悬，计数。

S200：将肺癌类器官细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞进行混合，培养基重悬，得到肺癌类器官多细胞悬液。

步骤5、将肺癌类器官细胞、肺癌相关成纤维细胞以及血管内皮细胞按照细胞数目比为1:(0.4～0.8):(0.1～0.5)进行混合，用上述的混合培养基重悬，得到肺癌类器官多细胞悬液。

S300：将肺癌类器官多细胞悬液接种至培养腔或培养孔中，进行成球培养，自组装形成血管化肺癌类器官球聚体模型。

步骤6、将肺癌类器官多细胞悬液加入至低吸附U型底培养孔中，以950rpm～1050rpm离心5min～6min；

步骤7、放入37℃，5％CO

步骤8、培养1～5天后，吸除孔板中的原有培养基，加入水凝胶、基质胶等细胞培养胶，待成胶后，加入上述的混合培养基，放入37℃，5％CO

示例1的药物测试：

(1)配制合适浓度的含药培养基；

(2)将上述培养形成的血管化肺癌类器官球聚体模型转移至96孔板；

(3)观察并记录血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态，吸除96孔板中的原有培养基，每孔加入0.01～100μM的含药培养基，放入37℃、5％CO

(4)第3天观察并记录血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态；

(5)第5天观察并记录血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态，用CTG检测试剂盒进行活性检测；

每孔加入80～120μL CTG检测试剂，使用震荡仪震荡5～10min，放室温孵育20～30min；

(6)孵育结束后，使用化学发光酶标仪进行检测。

示例2

血管化肺癌类器官球聚体模型的制备(在药敏芯片上形成血管化肺癌类器官球聚体模型)

S100：获取肺癌类器官细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞。

步骤1、选择原代提取或待传代的肺癌类器官，将提前预冷的PBS加入至培养孔板中，每孔加入1mL～2mLPBS，收集到离心管中，4℃～6℃冷藏15min～20min，离心，去除上清，得到肺癌类器官沉淀；

步骤2、加入Tryple E酶解5min～10min，消化成单细胞后离心，去除上清，加入PBS再次离心，去除多余酶液，得到沉淀，加入混合培养基重悬，进行细胞计数，得到肺癌类器官悬液的细胞浓度；

其中，示例2中的混合培养基与示例1的混合培养基相同，不再赘述。

步骤3、取肺癌相关成纤维细胞，消化成单细胞，用上述的混合培养基重悬，计数；

步骤4、取血管内皮细胞，消化成单细胞，用上述的混合培养基重悬，计数。

S200：将肺癌类器官细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞进行混合，培养基重悬，得到肺癌类器官多细胞悬液。

步骤5、将所述肺癌类器官细胞、所述肺癌相关成纤维细胞和所述血管内皮细胞按照细胞数目比为1:(0.4～0.8):(0.1～0.5)进行混合，用上述的混合培养基重悬，得到肺癌类器官多细胞悬液。

S300：将肺癌类器官多细胞悬液接种至培养腔或培养孔中，进行成球培养，自组装形成血管化肺癌类器官球聚体模型。

步骤6、将肺癌类器官多细胞悬液加入至低吸附U型底培养腔中，以950rpm～1050rpm离心5min～6min；

步骤7、放入37℃、5％CO

步骤8、培养1～5天后，吸除孔板中的原有培养基，加入水凝胶、基质胶等细胞培养胶，将球聚体转移至药敏芯片中间孔，待成胶后，往药敏芯片中间孔加入25μL～35μL混合培养基，往药敏芯片两侧孔各加入45μL～55μL混合培养基。将药敏芯片放入摇摆灌注仪，在37℃、5％CO

示例2的药物测试：

(1)配制合适浓度的含药培养基；

(2)观察并记录药敏芯片培养腔内的血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态，吸除培养腔中的原有培养基；

(3)将药敏芯片两侧储液腔(对应药敏芯片两侧孔)内分别加入45～55μL含药培养基，中间培养腔(对应药敏芯片中间孔)内加入25～35μL含药培养基；

(4)将加药后的药敏芯片放入摇摆灌注仪，设置条件为3°/120min，随后将摇摆灌注仪放入培养箱，37℃，5％CO

(5)第3天观察并记录血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态，往中间培养腔内继续补充25～35μL含药培养基；

(6)第5天观察并记录血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态，用CTG检测试剂盒进行活性检测；

(7)两侧储液腔内弃掉全部含药培养基，加入20～30μL CTG稀释液(CTG试剂原液与混合培养基的1∶1稀释)；

(8)中间培养腔内的含药培养基不弃，直接加入45～55μL CTG原液，吹打混匀；

(9)使用震荡仪震荡5～10min，放室温孵育25～30min；

(10)将所有裂解液取出，放入四周和底部完全不透明的96孔板，使用化学发光酶标仪进行检测。

药物测试过程中的培养时间根据药物的作用和代谢快慢，设置为更短或更长的时间。

以下，举出实施例及对比例来对本申请的实施方式进行更具体地说明，下述实施例以及对比例中用到的试剂均可通过商业途径购买。

示例性地，肺癌类器官培养试剂盒采购于江苏艾玮得生物科技有限公司，货号为KLU0101；

非小细胞肺癌类器官培养基(即第一培养基)采购于江苏艾玮得生物科技有限公司，货号为KCJ-6-1；

人原代肺癌相关成纤维细胞采购于湖南美森生物科技有限公司，货号为CTCC-258-Hum；

人脐静脉内皮细胞HUVEC采购于协和细胞资源中心，货号为1101HUM-PUMC000437；

低吸附U型底96孔板采购于上海诺宁生物科技有限公司，货号为NBH1296。

实施例1

(一)血管化肺癌类器官球聚体模型的制备(在U型孔板上形成血管化肺癌类器官球聚体模型)

步骤1、选择原代提取的肺癌类器官(即货号为KLU0101的肺癌类器官培养试剂盒，实施例2同)，将提前预冷的PBS加入至培养孔板中，每孔加入1mLPBS，收集到离心管中，4℃冷藏15min，离心(1000rpm，5min)，去除上清，得到肺癌类器官沉淀；

步骤2、加入Tryple E酶解8min，消化成单细胞后离心(1000rpm，5min)，去除上清，加入PBS再次离心(1000rpm，5min)，去除多余酶液，得到沉淀，加入混合培养基重悬，进行细胞计数，得到肺癌类器官悬液的细胞浓度；

其中，在所述混合培养基中，所述第一培养基和所述第二培养基的质量比为1:0.8，实施例2同，不再赘述。

步骤3、取人原代肺癌相关成纤维细胞(即肺癌相关成纤维细胞，下同)，消化成单细胞，用上述的混合培养基重悬，计数；

步骤4、取人脐静脉内皮细胞HUVEC(即血管内皮细胞，下同)，消化成单细胞，用上述的混合培养基重悬，计数；

步骤5、将肺癌类器官细胞、人原代肺癌相关成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC按照细胞数目比为1:0.75:0.25进行混合(每孔总细胞数为5000个，肺癌类器官细胞的细胞数为2500个/孔人原代肺癌相关成纤维细胞的细胞数为1875个/孔，人脐静脉内皮细胞的细胞数为625个/孔)，得到肺癌类器官多细胞悬液；

步骤6、将上述的肺癌类器官多细胞悬液加入低吸附U型底96孔板中，以1000rpm离心5min；

步骤7、放入37℃、5％CO

步骤8、培养3天后，吸除孔板中的原有培养基，加入5uL水凝胶待成胶后，再加入100uL上述的混合培养基，放入37℃、5％CO

实施例1制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型的直径为400μm。

图1为本申请实施例1制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型的测试。

图1a为所述血管化肺癌类器官球聚体模型的明场图，可以看出，实施例1制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型的边界清晰且生长有大面积呈复杂网络结构的微血管。图1b采用绿色细胞示踪染料(cell tracker)标记肺癌类器官，通过肺癌类器官分布图，可以看出，肺癌类器官呈球状均匀生长。

图1c为肺癌类器官未染色石蜡切片，可以看出，球聚体细胞生长致密，外围内皮细胞呈管状生长。图1d为肺癌类器官石蜡切片苏木素伊红染色，可以看出，肺癌类器官细胞与肺癌相关成纤维细胞以及血管内皮融合生长，三种细胞相互促进，形成球聚体。图1e为肺癌类器官多细胞球聚体中生成的微血管荧光图像，采用绿色细胞示踪染料标记肺癌类器官，将肺癌类器官多细胞球聚体进行冰冻切片，绿色荧光显示类器官分布于球聚体，且类器官与内皮细胞、成纤维细胞融合生长。通过图1的测试图可以看出，本申请实施例1制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型具有较好的仿真性。

图2为本申请实施例1在制备血管化肺癌类器官球聚体模型的过程中，比较了将肺癌类器官消化成单细胞以及肺癌类器官不消化成单细胞的两种情况。图2(a)为在获取肺癌类器官细胞的过程中，将肺癌类器官消化成单细胞后再与其他细胞混合，培养第1天和第5天的状态，图2(b)为在获取肺癌类器官细胞的过程中，没有将肺癌类器官消化成单细胞，而是直接将肺癌类器官与其他细胞混合，培养第1天和第5天的状态。通过图2的对比照片可以看出，将肺癌类器官消化成单细胞后再与其他细胞混合形成多细胞球聚体更易形成球状体，同时，球聚体生长5天后可看出，类器官消化成单细胞后再形成多细胞球聚体，其模型的微血管生长更丰富。

图3为本申请实施例1在制备血管化肺癌类器官球聚体模型的过程中进一步对比了肺癌类器官细胞、肺癌相关成纤维细胞以及血管内皮细胞的细胞数目比。图3(a)中，肺癌类器官细胞、肺癌相关成纤维细胞和血管内皮细胞的细胞数目比为4:3:1，混合后培养3天明场图，图3(b)中，肺癌类器官细胞、肺癌相关成纤维细胞和血管内皮细胞的细胞数目比为30:1:2，混合后培养3天明场图。通过图3可以看出，肺癌类器官细胞、肺癌相关成纤维细胞以及血管内皮细胞的细胞数目比合适，利于模型成球，也更利于肿瘤微环境的构建，可以生长出具有微血管复杂网络且仿真性更好的肺癌类器官模型。

(二)药物测试：

(1)配制合适浓度的含药培养基：顺铂+紫杉醇(顺铂6μM，紫杉醇4μM)，培美曲塞(20μM)；

(2)将实施例1培养形成的血管化肺癌类器官球聚体模型转移至96孔板；

(3)观察并记录血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态，吸除96孔板中的原有培养基，每孔加入100μL含药培养基，放入37℃、5％CO

(4)第3天观察并记录血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态；

(5)第5天观察并记录血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态，用CTG检测试剂盒进行活性检测；

每孔加入100μL CTG检测试剂，使用震荡仪震荡5min，放室温孵育25min；

(6)孵育结束后，使用化学发光酶标仪进行检测。

图4为本申请实施例1制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型在药敏测试过程中，添加含药培养基后培养第3天和第5天的状态，其中，对照组中的培养基为空白培养基，所述空白培养基是在上述混合培养基的基础上添加1％DMSO。

图5为将图4中三组实验的裂解液采用化学发光酶标仪进行检测的结果图。

结合图4以及图5，可以看出，顺铂+紫杉醇(一种组合药物)和培美曲塞均对于本申请实施例1构建得到的血管化肺癌类器官球聚体模型有一定的血管抑制作用，且顺铂+紫杉醇的组合药物对该例肺癌类器官球聚体的敏感性更强。

实施例2

(一)血管化肺癌类器官球聚体模型的制备(在药敏芯片上形成血管化肺癌类器官球聚体模型)

步骤1、选择原代提取的肺癌类器官，将提前预冷的PBS加入至培养孔板中，每孔加入1mLPBS，收集到离心管中，4℃冷藏15min，离心(1000rpm，5min)，去除上清，得到肺癌类器官沉淀；

步骤2、加入Tryple E酶解8min，消化成单细胞后离心(1000rpm，5min)，去除上清，加入PBS再次离心(1000rpm，5min)，去除多余酶液，得到沉淀，加入混合培养基重悬，进行细胞计数，得到肺癌类器官悬液的细胞浓度；

步骤3、取人原代肺癌相关成纤维细胞，消化成单细胞，用混合培养基重悬，计数；

步骤4、取人脐静脉内皮细胞HUVEC，消化成单细胞，用混合培养基重悬，计数；

步骤5、将肺癌类器官细胞、人原代肺癌相关成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞的细胞数目比为1:0.75:0.25进行混合(每孔总细胞数为5000个，肺癌类器官细胞的细胞数为2500个/孔，人原代肺癌相关成纤维细胞的细胞数为1875个/孔，人脐静脉内皮细胞的细胞数为625个/孔)，得到混合悬液；

步骤6、将上述混合悬液加入低吸附U型96孔板中，以1000rpm离心5min；

步骤7、放入37℃、5％CO

步骤8、培养2天后，吸除孔板中的原有培养基，加入5uL基质胶，将球聚体转移至药敏芯片的中间培养腔，成胶后，再向药敏芯片的中间培养腔内加入30μL混合培养基，其两侧储液腔内各加入50μL混合培养基。将药敏芯片放入摇摆灌注仪，设置条件3。/120min，将摇摆灌注仪放入37℃、5％CO

实施例2制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型的直径为400μm。

(二)药物测试：

(1)配制合适浓度的含药培养基：奥希替尼+贝伐珠单抗(奥希替尼1μM，贝伐珠单抗1μg/mL)、多西他赛(3μM)；

(2)观察并记录药敏芯片培养腔内的血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态，吸除培养腔中的原有培养基；

(3)将药敏芯片的两侧储液腔内分别加入50μL含药培养基，中间培养腔内加入30μL含药培养基；

(4)将加药后的药敏芯片放入摇摆灌注仪，设置条件为3°/120min，将摇摆灌注仪放入37℃、5％CO

(5)第3天观察并记录血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态，往其中间培养腔内继续补充30μL含药培养基；

(6)第5天观察并记录血管化肺癌类器官球聚体模型的生长状态，用CTG检测试剂盒进行活性检测；

(7)两侧储液腔内弃掉全部含药培养基，加入20μL CTG稀释液(CTG试剂原液与混合培养基的1∶1稀释)；

(8)中间培养腔内的含药培养基不弃，直接加入50μL CTG原液，吹打混匀；

(9)在定轨摇床上振动60分钟使球聚体充分裂解；

(10)将所有裂解液取出，放入四周和底部完全不透明的96孔板，使用化学发光酶标仪进行检测。

图6为本申请实施例2制备得到的血管化肺癌类器官球聚体模型在药敏测试过程中，添加含药培养基后培养第3天和第5天的状态。图7为将图6中三组实验的裂解液采用化学发光酶标仪进行检测的结果图。结合图6以及图7，可以看出，运用药敏芯片进行动态培养，球聚体模型能生长出丰富的血管。奥希替尼+贝伐珠单抗(另一种混合药物)对于本申请实施例2构建得到的血管化肺癌类器官球聚体模型有明显的血管抑制作用，多西他赛对于该例样本的血管抑制作用不明显。同时，奥希替尼+贝伐珠单抗的组合药物对该例样本的敏感性更强。

本申请采用的药敏芯片例如采用申请号为CN2023105307566、CN2023211335836、CN2023105302350、CN202310530706.8所示细胞培养装置。示例性地，以申请号为CN202310530706.8中所示的细胞培养装置为例，参见图8所示，本申请所述药敏芯片的中间培养腔是指该细胞培养装置中的10a培养腔，本申请所述药敏芯片的两侧储液腔是指该细胞培养装置中的10b储液腔，储液腔10b的数量为两个，在储液腔10b至培养腔10a的流动方向上，两个储液腔10b呈对称设置，且培养腔10a位于两个储液腔10b之间。这样设置下，可以对细胞培养装置进行摆动，此时在摆动下，培养基可以在两个储液腔10b之间进行来回移动，通过产生流体剪切力、机械应力、生化浓度梯度等理化刺激实现动态培养，展现更真实的生理学功能的同时，可以更好地实现培养基与生物样本之间的物质交换，且可以将生物样本的排泄物带走，更能模拟出真实的细胞环境。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。