一种与龙岩山麻鸭蛋产量性状相关的基因及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种与龙岩山麻鸭蛋产量性状相关的基因及其筛选方法和应用。

背景技术

龙岩山麻鸭为福建省龙岩市新罗区特产，体型较小，但产蛋量高，且具有较高的药用价值，因此有很大的研究潜力。从先前关于鸭的研究中，已经运用全基因组关联分析的方法确定了雷州黑鸭繁殖性状以及黑羽番鸭产蛋和体重性状的关键候选基因，运用该技术同时还揭示了龙岩山麻鸭蛋重、蛋壳厚、蛋白高度、蛋型指数、蛋黄颜色等性状相关候选区域和潜在关联的SNPs位点。Sun等人通过GWAS分析，记录329只母鸭的体重和蛋产量性状，分析得出FZD6基因上的27个SNPs位点与母鸭17周、18周和19周产蛋量以及59周龄蛋重密切相关。鉴于当前对于龙岩山麻鸭蛋产量性状的潜在候选基因信息较少，因此对于发掘相关的分子标记具有很大意义。

基于此提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与龙岩山麻鸭蛋产量性状相关的基因及其筛选方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种与龙岩山麻鸭蛋产量性状相关的基因，包括如下基因中的任意一种：

RPTOR基因、IRS1基因和WNT7A基因。

作为优选，所述RPTOR基因位于龙岩山麻鸭19号染色体上，所在的通路包括AMPK信号通路和PI3K-Akt信号通路；

所述IRS1基因位于龙岩山麻鸭8号染色体上，所在的通路包括AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和mTOR信号通路；

所述WNT7A基因位于龙岩山麻鸭13号染色体上，所在的通路包括mTOR信号通路和Wnt信号通路。

本发明还提供了所述的基因在制备检测与龙岩山麻鸭蛋产量性状相关的产品中的应用。

本发明还提供了所述的基因的筛选方法，包括如下步骤：

(1)记录龙岩山麻鸭蛋开产日龄、初生蛋重、33周龄蛋重、43周龄蛋重、43周龄产蛋数、平均蛋重和43周总蛋重的数据，得到龙岩山麻鸭的产蛋性状数据；

(2)取产蛋初期至43周龄期间龙岩山麻鸭翼下静脉血，得到血液样本；提取所述血液样本的DNA，检验合格后，得到合格DNA；利用合格DNA构建DNA文库，选取文库有效浓度>2nM的进行Illumina Novaseq6000 platform测序，得到原始测序数据，对所述原始测序数据进行过滤，得到Clean Data，将所述的Clean Data比对到参考基因组，排除重复项，进行SNP检测，对检测得到的SNP进行注释，初步得到SNPs；

(3)数据处理

排除龙岩山麻鸭的产蛋性状数据的异常值后与初步得到的SNPs进行关联性分析，筛选与产蛋性状显著相关的SNP标记基因，作为候选基因；

对所述的候选基因进行KEGG通路富集和GO功能分析，筛选出与龙岩山麻鸭蛋产量性状的关键候选基因，得到与龙岩山麻鸭蛋产量性状相关的基因。

作为优选，所述开产日龄为龙岩山麻鸭产下第一枚蛋的时间减去出雏的时间后得到的天数；

所述初生蛋重为龙岩山麻鸭产下的第一批蛋的重量；

所述33周龄蛋重为龙岩山麻鸭33周龄前后3d每只麻鸭的平均蛋重；

所述43周龄蛋重为龙岩山麻鸭43周龄前后3d每只麻鸭的平均蛋重；

所述43周龄产蛋数为龙岩山麻鸭43周龄时每只麻鸭的平均产蛋数；

所述平均蛋重为龙岩山麻鸭43周龄时产蛋重量统计值的平均数；

所述43周总蛋重为龙岩山麻鸭43周龄时产蛋总重量。

作为优选，步骤(2)所述检验的指标为DNA的浓度和纯度；

所述合格DNA的浓度>2.0ng/μL；

所述合格DNA的纯度OD260/OD280>1.8。

作为优选，步骤(2)所述比对的软件为BWA软件；

所述参考基因组为Anasplatyrhynchos ZJU1.0；

所述排除重复项的软件为SAMTOOLS；

所述SNP检测的工具为SAMTOOLS；

步骤(2)所述注释的工具为ANNOVAR软件。

作为优选，所述排除龙岩山麻鸭的产蛋性状数据的异常值的工具为Minitab软件；

所述关联性分析为全基因组关联性分析，所述全基因组关联性分析的工具为GEMMA软件；

所述全基因组关联性分析用到的模型为多性状线性混合模型；

所述多性状线性混合模型的计算方法为：

y＝Xα+Zβ+Wμ+e+B

y是表型值，Xα为固定效应，Zβ为标记效应，Wμ为随机效应，e是随机误差，B是批次效应。

本发明还提供了所述的筛选方法在筛选与龙岩山麻鸭的产蛋性状相关的基因中的应用。

本发明还提供了一种与龙岩山麻鸭蛋产量性状相关的基因及其筛选方法和应用。

本研究通过追踪记录第6世代龙岩山麻鸭的产蛋性状，包括开产日龄、初生蛋重、33周龄蛋重、43周龄蛋重和产蛋数、平均蛋重及43周总蛋重，并利用质控后的SNPs位点进行全基因组关联分析，筛选出与产蛋性状显著相关的候选基因，根据GO功能分析和KEGG通路富集分析进一步确定与山麻鸭蛋产量性状有关的基因，对各关键候选基因的功能做深入调查和总结，最终得到4种关键候选基因，作为与龙岩山麻鸭产蛋性状相关的基因，从而为龙岩山麻鸭的蛋产量性状改良做出贡献。

附图说明

图1为群体结构组成分分析图。

图2为关联分析结果曼哈顿图和QQ图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例选用龙岩山麻鸭高产系第6世代，总数299只进行下述实验。

本发明实施例中所述的开产日龄(AF)、初生蛋重(EWF)、33周龄蛋重(EW33)、43周龄蛋重(EW43)、43周龄产蛋数(EN43)、平均蛋重(EWA)和43周总蛋重(EWT)表示如下：

所述开产日龄为龙岩山麻鸭产下第一枚蛋的时间减去出雏的时间后得到的天数(d)；

所述初生蛋重为龙岩山麻鸭产下的第一批蛋的重量(g)；

所述33周龄蛋重为龙岩山麻鸭33周龄前后3d每只麻鸭的平均蛋重(g)；

所述43周龄蛋重为龙岩山麻鸭43周龄前后3d每只麻鸭的平均蛋重(g)；

所述43周龄产蛋数为龙岩山麻鸭43周龄时每只麻鸭的平均产蛋数；

所述平均蛋重为龙岩山麻鸭43周龄时产蛋重量统计值的平均数(g)；

所述43周总蛋重为龙岩山麻鸭43周龄时产蛋总重量(kg)。

实施例1

利用电子天平测量龙岩山麻鸭的初生蛋重、33周龄蛋重、43周龄蛋重、计算平均蛋重和43周龄蛋重的数据，数据精确到0.01，记录上述所述的数据，将开产日龄和43周龄产蛋数的数据也进行记录，得到龙岩山麻鸭产蛋性状数据。

将产蛋性状数据利用Minitab17.1软件进行统计，利用Minitab软件排除异常数据，计算得到各性状表型值的最大、最小、标准差以及变异系数。结果如表1所示。

表1产蛋性状表型值的描述统计

表1可知，第6世代龙岩山麻鸭的开产日龄平均在108d，最早为90d，最迟为136d，变异系数较小。龙岩山麻鸭的初生蛋重平均为43.56g，最小值为30.22g，最重可达65.5g，数值变异较大，变异系数为14.29％，但在33周以及43周龄时趋于稳定，变异系数在5.95～5.98％之间。43周龄蛋重最大为83.2g，平均重量为68.94g，总蛋重平均为10.65kg，这个时期内龙岩山麻鸭的平均产蛋量为180枚，最多可达202枚，最少为147枚，产蛋数与总蛋重数值均稳定，变异系数分别为5.57％和7.10％。

实施例2

取产蛋初期至43周龄期间龙岩山麻鸭翼下静脉血，得到299份血液样本；采用离心柱法对299份血液样本使用传统的酚氯仿法进行DNA提取，提取的DNA用琼脂糖凝胶电泳法和紫外光分光光度计检测其浓度与纯度是否达标，选取浓度>2.0ng/μL，纯度OD260/OD280>1.8的DNA作为合格DNA。合格DNA溶液置于-20℃冰箱中保存。

对合格DNA进行DNA文库的构建，共299份样品送往诺禾致源科技股份有限公司建库、测序，使用Covaris超声波破碎仪，对DNA样品进行随机的打断，再通过碱基末端修复、加ployA尾和测序接头、纯化以及PCR扩增，最终完成整个文库的制备。使用Qubit3.0对文库进行初步的定量，将文库稀释至1ng/μL，运用Agilent2100对文库的insert size功能进行检测，insert size结果达标后，利用QT-PCR法准确测定文库的有效浓度，选取有效浓度>2nM的文库进行Illumina Novaseq6000platform测序，测序之后得到原始的图像数据文件，将其转化成为原始测序序列，即原始测序数据(Raw Data)，其中包含的碱基接头信息在之后会造成数据分析的干扰，因此要使用过滤的方法进一步得到有效的数据，最后得到CleanData，通过BWA软件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对到参考基因组(Anasplatyrhynchos ZJU1.0)，再用SAMTOOLS排除重复项，利用SAMTOOLS进行群体SNP检测，筛选单个样本最小测序深度为3、miss(缺失)比例小于0.1、最小等位基因频率(Minimunallele frequency,maf)大于0.05的SNP，为初步得到的SNPs。再利用ANNOVAR软件对初步得到的SNPs进行注释，统计其位点在23条染色体上的分布以及变异类型。

对299份样本根据多维度尺度分析(MDS)，以群体主成分1为横坐标，以群体主成分2为纵坐标，观察群体结构的稳定性。检测结果如图1所示。

图1可知，龙岩山麻鸭群体的299个血液样本无明显的分簇线性，表明群体结构对后续全基因组关联分析结果没有影响。

实施例3

使用GEMMA软件对排除异常数据的产蛋性状与初步筛选得到的SNPs进行全基因组关联分析。筛选得到与龙岩麻鸭产蛋性状显著关联的SNP标记基因216个，作为候选基因。结果如表2所示。利用GEMMA软件的多性状线性混合模型，对目标常染色体中的SNPs进行产蛋量性状的GWAS分析，运用的模型如下：

y＝Xα+Zβ+Wμ+e+B

式中，y是表型值，Xα为固定效应，Zβ为标记效应，Wμ为随机效应，e是随机误差，B是批次效应。P值<1.0×10

表2 216个SNPs与产蛋量性状关联

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注：A0，等位基因；A1，次要的等位基因；BETA，回归系数，正值表示次要等位基因提高性状值。

表2显示，23条染色体上一共得到191个基因水平潜在关联的SNP标记。这说明遗传变异主要发生的区域是内含子区，并且以纯和突变居多。

以红色虚线为基因组水平阈值，结合SNP基础分析曼哈顿图与QQ图的结果(图2)，共有216个SNPs和68个indels与产蛋量显著关联，表3。与开产日龄(AF)相关的4个SNPs与3个indels标记位于18号染色体上。这些标记大多数位于MIGA2基因内部或附近。与初生蛋重(EWF)关联的SNPs和indels位于5号染色体10.03Mb(570.46～580.50Mb)范围内。与平均蛋重(EWA)相关的184个SNPs和58个indels位于多条染色体上。

表368个Indels与产蛋量性状关联

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实施例4

利用KOBAS数据库，将龙岩山麻鸭蛋品质性状关联分析得到的显著性SNPs位点的候选基因进行KEGG通路富集分析和GO功能分析。结果如表4～5所示。

49个基因富集于26条信号通路，其中AMPK信号通路、mTOR信号通路、PI3K-Akt信号通路与Wnt信号通路与产蛋量密切相关。其中RPTOR、IRS1、WNT7A基因可作为产蛋量性状重要的候选基因。

表449个关联基因富集于26条KEGG通路

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表5GO分析结果

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由以上实施例可知，本发明提供了一种与龙岩山麻鸭蛋产量性状相关的基因及其筛选方法和应用。本发明通过对龙岩山麻鸭的产蛋性状和SNP进行全基因组分析，最终得出3个与龙岩山麻鸭产蛋性状相关的关键候选基因，为RPTOR、IRS1、WNT7A，为深入研究提高鸭蛋产量提供参考。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。