一种仿生小肠绒毛电化学细胞传感器及其应用

技术领域

本发明涉及一种仿生小肠绒毛电化学细胞传感器及其应用，属于电化学传感器和食品检测技术领域。

背景技术

由于新的材料和设备的发展，3D打印作为一个快速发展的新兴技术，已成为近几年的研究热点，在各领域得到了广泛应用：药物分析、细胞组织培养、环境领域等。该技术有着独特的优势，有着多层次快速制备样品模型的能力，主要在生物医学方面广泛的应用，如自体骨颗粒3D打印支架，血管软化组织的生物3D打印，三维共培养肿瘤模型用于药物毒性分析等，然而在生物传感领域应用的较少，尤其在细胞电化学传感方向的应用。目前细胞的固定化方案和高通量制备是构建基于细胞传感器的关键，而生物打印这一技术有效的解决了这些问题，可为细胞负载和高通量制备提供手段，灵活的打印设计给了研究者提供了更多的可能性用于传感方向，若利用该技术快速精确地制备一批上百个传感元件，不仅可以大幅缩短细胞传感器构建的时间和降低制备成本，更加扩宽了细胞传感的应用范围，提高传感器不同批次间的稳定性，高通量也可便于统计分析数据进一步用于危害物的评价和检测。

目前常用的是挤出式的打印方法，挤出式打印是较成熟的生物3D打印方式，普遍采用的是温敏成型工艺，通过喷头挤出丝状材料逐层打印为三维实体，适用性广，可对大多数打印墨水良好匹配，形成范围广阔的材料应用领域，但是对一些微小器件无法形成精确打印且打印过程中往往会造成打印材料出料不可控，喷头堵塞，浪费。投影式光固化生物3D打印利用光的波长和热作用可使光敏生物墨水发生聚合反应，对墨水进行有选择地固化，就可以在不接触的情况下打印所需的三维实体原形，与其他3D打印技术的工艺相比，光固化原位点打印技术的突出优点就是精度高，成型快、原材料利用率高（接近100%），构建相对形状复杂、特征精细的打印体，因其高精度的打印特点，可实现最小打印精度为25微米(μm)的打印结构，已在体外组织构建、组织修复、药物筛选、人工假体等相关领域有所应用，所以本次生物打印选用投影式光固化生物3D设备。

在打印墨水的选择上，选用以甲基丙烯酰化明胶（GelMA水凝胶）为主打印墨水，因其GelMA为双键改性明胶，其溶液可通过光固化成胶，GelMA分子中含有RGD细胞黏附序列，其形成的三维网络结构具有优异的生物相容性，可以制造载细胞的具有微-纳米多孔的水凝胶支架，但对于单纯的 GelMA 不具有导电性，无法更好地模拟生物组织内微弱的导电环境，细胞之间无法进行电信号交流。因此，需要导电以提高检测灵敏度且并不影响细胞活性的新材料。目前有几种方法可以提高电导率，例如添加导电材料，包括金属纳米粒子、氧化石墨烯、碳纳米管、导电聚合物等。在电化学传感器制备中，氧化石墨烯为主的碳纳米材料是最常用的导电材料，但其因为分散性较差和较大的颗粒尺寸无法在微米级别的光固化打印中使用，而聚苯胺(PANi)和聚吡咯(PPy)具有良好的应用前景，但它们的主要缺点是不溶于水。因此，迫切需要能够分散于水中并与细胞相容的导电材料。碳纳米管由于其良好的生物相容性和优异的电化学特性而被许多作者关注。然而，对于多壁碳纳米管而言，缺乏稳定性和均匀性，很容易造成沉积是必须考虑的问题。因此，如何制备一种导电且水溶性的打印墨水是目前亟需解决的问题。

近年来，食物过敏患者日益增多，过敏症发病率也呈逐年上升趋势，食物过敏已成为重要的食品安全问题。日常生活中，牛奶、花生、小麦、鱼类是最常见的食物过敏原，到目前为止，食物过敏还没有有效的治疗方法，唯一预防方法是避免食用含有特定过敏原的食物。小麦为原料制作的面筋可引起过敏反应，而醇溶蛋白是其主要成分，作为一个食物中极少量的过敏原可引起严重免疫反应，最终导致小肠上部的慢性炎症和损伤。因此，醇溶蛋白的灵敏定量检测变得十分重要，急需开发一种高灵敏的定量检测小麦中的过敏原的方法。目前最成熟的过敏原检测的方法通常基于免疫识别（如ELISA法），但其存在一定的缺陷，如操作过程要求严格，试剂成本高，耗费时间，因此寻找替代方法就变得十分重要，电化学细胞传感器作为近年来生物传感器研究和发展的一个新方向，随着微电子技术和体外培养技术在近些年来的发展迅速，以活细胞为传感介质构建细胞传感器，已经被广泛应用于食品安全、环境毒性和其他有毒物质的检测，以及药物评价等诸多领域。

发明内容

[技术问题]

在普通的细胞传感器中，主要依赖于二维的细胞固定化方案，但是二维的细胞培养环境只是简单的细胞堆积形成空间上的错位，与人体微环境有很大区别，而且体外组织模型存在着代价高，周期长，重复率低等缺点。之前研究均单纯以肥大细胞2D状态或与凝胶混合后的3D状态固定于传感界面（电极）的表面，细胞只是单纯的聚集在一起没有形成模拟组织的立体结构，无法全面真实的模拟体内过敏原反应机理，且缺乏原生器官的建筑特征，从而无法产生更高层次的功能特征，而真实体内过敏反应发生时肥大细胞是游离附着于组织和器官表面发生脱颗粒效应的。过敏原蛋白被摄食消化后首先进入肠道进行吸收，因此小肠是过敏反应发生第一效应器官。但由于现有的技术仍然存在挑战，生物打印无法真正的模拟组织或器官的天然生理功能。

[技术方案]

为了解决上述至少一个问题，本发明提供了一种基于3D光固化原位点打印方法构建小肠绒毛微组织模型的电化学细胞传感器及其在小麦过敏原蛋白醇溶蛋白评价中的应用。本发明利用3D光固化原位点打印技术和电化学细胞传感器结合，构建一种新颖、打印简单、打印重复性高的小肠绒毛微组织模型，之后将细胞接种于微组织模型上，成功模拟机体受到过敏原刺激，检测通过电化学交流阻抗法测定其阻抗值判断细胞受毒素刺激后的受损情况，从而快速、有效地评价小麦醇溶蛋白浓度。

本发明采用的打印墨水中使用的酰肼化改性的多壁碳纳米管，可以稳定分散在水中，可以与凝胶一起使用；铜纳米材料价格低廉且容易合成，具有良好的抗菌性和高的电催化能力。而且本发明用3D打印宏观尺度上打印小肠微绒毛结构，通过调控组织尺寸和结构，在其负载肥大细胞，模拟体内真实过敏环境，又进一步实现3D立体式检测，实现了单一成分细胞检测到组织工程检测的跨步，使三维组织检测成为可能，实现更真实更全面的生物传感模拟。

本发明的第一个目的是提供一种制备小肠绒毛状结构的3D打印墨水，其组分包括自组装花状氧化铜纳米片、酰肼化多壁碳纳米管和光敏型甲基丙烯酰化明胶GelMA，其中3D打印墨水中自组装花状氧化铜纳米片的终浓度为0.1～0.4 mg/mL；酰肼化多壁碳纳米管的浓度为0.5～0.9 mg/mL；光敏型甲基丙烯酰化明胶GelMA的终浓度为10%（w/w）。

在本发明的一种实施方式中，所述的3D打印墨水中自组装花状氧化铜纳米片的大小为4-8μm。

在本发明的一种实施方式中，所述的3D打印墨水中花状氧化铜纳米片的浓度为0.3 mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述的3D打印墨水中酰肼化多壁碳纳米管的浓度0.8 mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述的3D打印墨水中酰肼化多壁碳纳米管的直径为4-6 nm，长度为0.5-2 μm。

在本发明的一种实施方式中，所述的3D打印墨水中酰肼化多壁碳纳米管的制备方法为：

（1）100g羧酸化的多壁碳纳米管（COOH-MWCNT）溶于50 mL蒸馏水中，超声分散30 min，得到COOH-MWCNT溶液；

（2）将0.44 mM的碳二肼和0.11 mM的羟苯并三唑溶于50 mL蒸馏水中，混合均匀得到碳二肼和羟苯并三唑的混合溶液；

（3）在步骤（2）的碳二肼和羟苯并三唑的混合溶液加入步骤（1）的COOH-MWCNT溶液，混合均匀，得到混合溶液；之后将混合溶液的pH调整至4.7；

（4）在步骤（3）得到的溶液中加入15.5 μL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸（EDC），室温下搅拌过夜；之后在HCL（pH=3）、0.1M NaCl缓冲液中透析一天，在二次蒸馏水中透析两天，每隔4小时换水一次，透析后收集样品并冻干三天得到。

在本发明的一种实施方式中，所述的光敏型甲基丙烯酰化明胶GelMA溶液的制备方法为：在1 g GelMA中加入10mL 0.25%(w/v)引发剂LAP标准溶液，充分浸湿；之后在40~50℃水浴避光加热溶解30min，得到光敏型甲基丙烯酰化明胶GelMA溶液；其中0.25%(w/v)引发剂LAP标准溶液的制备方法为：将0.05g白色粉末状LAP光引发剂加入到装有20mLPBS溶液的离心管中，避光处理，之后放在40~50℃水浴加热溶解15min得到。

本发明的第二个目的是提供一种制备本发明所述3D打印墨水的方法，包括如下步骤：

将自组装花状氧化铜纳米片、酰肼化多壁碳纳米管和光敏型甲基丙烯酰化明胶GelMA溶液按照比例混合均匀，即得到3D打印墨水。

本发明的第三个目的是一种制备小肠绒毛结构微组织模型的方法，所述的方法是采用本发明所述的3D打印墨水通过3D打印的方法制备得到。

在本发明的一种实施方式中，所述的方法中3D打印的参数为：基层参数为3，打印层高为100微米，光强为8 mW/cm

在本发明的一种实施方式中，所述的小肠绒毛结构微组织模型的参数为：绒毛数量为19个，绒毛直径为600微米，基底底座直径为4.5mm，模型高度为3mm，基底底座高度为1mm，绒毛高度为2mm。

本发明的第四个目的是本发明所述的方法制备得到的小肠绒毛结构微组织模型。

本发明的第五个目的是提供一种基于本发明所述的小肠绒毛结构微组织模型制备电化学细胞传感器的方法，包括如下步骤：

将本发明所述的小肠绒毛结构微组织模型固定在丝网印刷电极的工作区域部分，得到电化学传感器；之后在小肠绒毛结构微组织模型表面固定细胞，得到电化学细胞传感器。

在本发明的一种实施方式中，所述的细胞包括肥大细胞（RBL-2H3）。

在本发明的一种实施方式中，所述的细胞是通过细胞悬浮液滴加在电化学细胞传感器，其中细胞悬浮液的浓度为1×10

在本发明的一种实施方式中，所述的小肠绒毛表面积约为4π，负载细胞悬浮液的量为30 μL。

本发明的第六个目的是本发明所述的方法制备得到的电化学细胞传感器。

本发明的第七个目的是本发明所述的电化学细胞传感器在食品检测领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述的应用是在小麦过敏原蛋白中醇溶蛋白定量检测。

[有益效果]

（1）本发明突破以往2D检测方法和一些3D培养环境，构建了一种小肠绒毛微组织模型，在一定程度上模拟了体内真实环境，将细胞和组织组合起来，能够以微组织模型来进行电化学检测。

（2）本发明在考虑水凝胶本身导电性能不足无法进行灵敏检测的基础上，以自组装花状氧化铜纳米片和酰肼化碳纳米管(MWCNT-CDH)为导电复合材料，进而制备强可导电性生物复合水凝胶墨水进行3D打印。

（3）本发明将小肠绒毛结构与丝网印刷电极组合起来制备电化学传感器。由于光固化打印具有标准化、高通量的优点，结合丝网印刷电极可实现批量制备，大幅缩短了检测前传感器的构建时间，更能够进行多次同时间检测，也避免了检测过程中出现的污染情况。

（4）本发明所述的电化学细胞传感器采用的GelMA为双键改性明胶，其溶液可通过光固化成胶，GelMA分子中含有RGD细胞黏附序列，具有微-纳米孔隙，其形成的三维网络结构具有优异的生物相容性，可以制造载细胞的具有微米多孔的水凝胶支架。

（5）本发明将3D光固化打印机与电化学细胞传感领域结合起来，提供了一种基于3D光固化生物打印的仿生小肠绒毛结构的电化学生物传感器方案，在一定程度上填补了对食物过敏原的真实性检测，而且大幅度减少了传感器的制备时间，降低手工修饰电极所带来的误差，并有望运用于实际生产中满足快检需求。

（6）目前对过敏原蛋白的常规检测方法无法满足人们使用需求，迫切的需要一种灵敏便捷的检测方法来有效避免食品过敏情况的发生。本发明的电化学细胞传感器可以实现对小麦中的过敏原小麦醇溶蛋白进行定量检测。本发明因其灵活构建方案，长的货架期可以在一定程度上弥补了以往检测技术，对小麦醇溶蛋白的定量测定具有重大意义。

附图说明

图1为实施例1的小肠绒毛结构的设计模型图。

图2为实施例1中的打印示意图；其中左侧为侧视图，右侧为俯视图。

图3为实施例1中3D生物打印制备小肠绒毛结构流程示意图。

图4为合成纳米材料表征图；其中A是自组装花状氧化铜纳米片扫描电镜图；B是自组装花状氧化铜纳米片X射线衍射图(XRD)；C是碳纳米管的X射线光电子谱图(XPS)，B中a：CuO的标准谱图（JCPDS卡号：48-1548）；b：自组装花状氧化铜纳米片X射线衍射图；C中a：酰肼化多壁碳纳米管(WMCNT-CDH)，b：羧基化多壁碳纳米管(MWCNT-COOH)。

图5为电化学细胞传感器构建过程中的电化学表征图；其中，A、C是通过循坏伏安法CV得到的电化学信号；B、D是通过示差脉冲伏安法DPV得到的电化学信号；A、B中a：BareSPCE；b：MWCNT/CuO/GelMA；c：Cell/MWCNT/CuO/GelMA,；d：GelMA；C、D中a：MWCNT/CuO/GelMA，b：MWCNT/ GelMA，c：GelMA。

图6为电化学细胞传感器构建过程中细胞负载的共聚焦显微镜图；其中A是暗场下细胞负载图；B是局部放大图，C是三维细胞负载图。

图7为电化学细胞传感器构建过程中打印结构的整体稳定性表征图；其中A为不同天数下同一小肠绒毛结构的DPV电流值；B为同一批次5个不同小肠绒毛结构的DPV电流值。

图8为酰肼化碳纳米管(WMCNT-CDH)纳米的电化学表征图；其中a~e依次为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/mL。

图9为氧化铜纳米材料优化的电化学表征图；其中，a~d依次为0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL。

图10为电化学细胞传感器中小肠绒毛结构固定细胞不同时间梯度的电化学阻抗图；其中，a~e时间优化梯度为0 min、5 min、10 min、15 min、20 min。

图11为电化学细胞传感器中不同浓度梯度肥大细胞RBL-2H3的电化学阻抗图；其中，f~a的细胞悬浮液的浓度范围分别为：1×10

图12为电化学细胞传感器检测小麦醇溶蛋白原理示意图。

图13为电化学细胞传感器评价小麦醇溶蛋白电化学定量检测图和拟合曲线图；其中，A、B是不同梯度浓度蛋白的电化学阻抗检测结果图；其中：a~h为0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.4 ng/mL、0.6 ng/mL、0.8 ng/mL、1.0 ng/mL、1.2 ng/mL、1.4 ng/mL；C是拟合标准曲线图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。实施例1-5中的原材料及设备为国家重点研发计划（2020YFC1606801）资助项目。

实施例1

一种制备小肠绒毛结构微组织模型的方法，包括如下步骤：

（1）3D打印墨水的制备：

①甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液的制备：

将1 g白色海绵状GelMA放入50 mL离心管，之后加入10 mL0.25%(w/v)引发剂标准溶液，振荡使GelMA充分浸湿；之后在40~50℃水浴避光加热溶解30 min，期间振荡数次，得到甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液（使用之前要放置37℃水浴中保存，为了避免低温凝胶化）；其中0.25%(w/v)引发剂LAP标准溶液的制备方法为：在50 mL离心管中倒入20 mLPBS溶液，然后加入0.05 g LAP的白色粉末状光引发剂LAP，避光处理，之后放在40-50℃水浴加热溶解15 min，期间震荡数次，得到LAP标准溶液（可放置在4℃避光条件下保存12 个月）；

②酰肼化多壁碳纳米管的制备：

将100 g羧酸化的多壁碳纳米管（COOH-MWCNT）溶于50 mL蒸馏水中，超声分散30 min，得到COOH-MWCNT溶液；将0.44 mM的碳二肼和0.11 mM的羟苯并三唑溶于50 mL蒸馏水中，混合均匀，得到碳二肼和羟苯并三唑的混合溶液；之后在碳二肼和羟苯并三唑的混合溶液中加入COOH-MWCNT溶液混合均匀得到混合溶液；之后将混合溶液的pH调整至4.7；随后将15.5μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸（EDC）加入混合溶液中，室温下搅拌过夜；最后在HCL（pH=3）、0.1M NaCl缓冲液中透析一天，在二次蒸馏水中透析两天，每隔4小时换水一次，透析后收集样品并冻干三天，得到酰肼化多壁碳纳米管。

③自组装花状氧化铜纳米片的制备：

取0.17 g CuCL

④将上述制备得到的自组装花状氧化铜纳米片、酰肼化多壁碳纳米管和光敏型甲基丙烯酰化明胶GelMA溶液按照比例混合均匀，即得到3D打印墨水；其中光敏型甲基丙烯酰化明胶GelMA的终浓度为10%（w/w）；酰肼化多壁碳纳米管的浓度0.8 mg/mL；自组装花状氧化铜纳米片的浓度为0.3 mg/mL。

（2）打印制备小肠绒毛结构微组织模型

①设计尺寸：建立小肠绒毛状结构模型；绒毛直径为600 μm，绒毛数量为19个，绒毛高度为2 mm，基底圆高度为1 mm，基底圆直径为4.5 mm，模型高度为3 mm；设计模型图如图1；

②3D打印具体参数：基层参数为3，打印层高为100 μm，光强为8 mW/cm

③将步骤（1）得到的3D打印墨水加入倒入打印料槽中，盖上打印隔离罩，根据尺寸和打印参数进行打印；打印示意图如图2；一次性打印16 个模型，打印时间为10 min ；得到小肠绒毛结构微组织模型（图3），打印结束之后放置在PBS溶液中储存，可保存3个月。

将得到的自组装花状氧化铜纳米片、碳纳米管进行形貌表征，具体如图4：

图4为合成纳米材料表征图；其中A是自组装花状氧化铜纳米片扫描电镜图；B是自组装花状氧化铜纳米片的X射线衍射图(XRD)；C是碳纳米管的X射线光电子谱图(XPS)，B中a：CuO的标准谱图（JCPDS卡号：48-1548）；b：自组装花状氧化铜纳米片X射线衍射图；C中a：酰肼化多壁碳纳米管(WMCNT-CDH)，b：羧基化多壁碳纳米管(MWCNT-COOH)。从图4可以看出：所有衍射峰均与CuO的标准谱图（JCPDS卡号：48-1548）一致说明合成的氧化铜纳米材料纯度较高且形成了三维花状结构，具有更高的电催化活性 X射线光电子能谱显示氮元素含量增加，酰肼化多壁碳纳米管改性成功。

对照例1 原料的调整：

调整1：

将实施例1中的酰肼化多壁碳纳米管替换为石墨烯，其他和实施例1保持一致，进行打印。

结果发现：在打印过程中会因为石墨烯发生团聚现象导致原本打印位点被占据凝聚无法被光固化凝固，进而无法打印得到小肠绒毛结构。

调整2：

将实施例1中的酰肼化多壁碳纳米管替换为普通碳纳米管，其他和实施例1保持一致，进行打印。

结果发现：在打印过程中低浓度的碳纳米管会打印成功但是满足不了检测灵敏度需求，当浓度增加时，团聚现象严重，导致原本打印位点被占据凝聚无法被光固化凝固，进而无法打印得到小肠绒毛结构。

调整3：

调整实施例1中的酰肼化多壁碳纳米管替换为导电离子盐LiCL，其他与实施例1保持一致；进行打印。

结果发现：会在一定程度上增加水凝胶的导电性但同时在电化学反应中容易电解出刺激性气味的剧毒气体。

调整4：

省略实施例1中的自组装花状氧化铜纳米片材料，其他与实施例1保持一致；进行打印。

结果发现：电化学传感器的电化学信号会降低，满足不了检测灵敏度需求。

对照例2 打印参数的选择

调整1：

调整实施例1中的打印参数绒毛数量为20~35，其他和实施例1保持一致，进行打印。

结果发现：打印时绒毛间距离过近会发生粘连，导致打印失败。

调整2：

调整实施例1中的打印参数绒毛数量为15以下，其他和实施例1保持一致，进行打印。

结果发现：打印时绒毛间距离过远会导致其力学性能不够支撑不起来。

调整3：

调整实施例1中的打印参数基底底座高度小于1 mm，其他和实施例1保持一致，进行打印。

结果发现：打印后底座会发生弯曲，无法有效固定在工作电极上。

实施例2

一种基于实施例1的小肠绒毛结构微组织模型制备电化学细胞传感器的方法，包括如下步骤：

将实施例1的小肠绒毛结构微组织模型固定在丝网印刷电极的工作电极区域（由于GelMA水凝胶具有一定粘弹性，可以稳固放置在工作电极区域）；之后在小肠绒毛结构微组织模型表面滴加30 μL浓度为1×10

电化学细胞传感器构建过程中的电化学表征图如图5；图中A、C是通过循坏伏安法CV得到的电化学信号；B、D是通过示差脉冲伏安法DPV得到的电化学信号；A、B中a：BareSPWE；b：MWCNT/CuO/GelMA；c：Cell/MWCNT/CuO/GelMA,；d：GelMA; C、D中a：MWCNT/CuO/GelMA，b：MWCNT/ GelMA，c：GelMA。从图5可以看出：当工作电极上放置小肠绒毛状结构的微组织模型时（曲线d）这说明此结构会阻碍氧化还原反应发生，因此随着导电材料MWCNT-CDH/CuO的添加，工作电流显著增加，显示出了优异的导电性和高的电催化活性（曲线b），证明了纳米复合材料具备显著的信号放大的功能。当固定细胞后，可以看到峰值电流明显下降（曲线c），这一现象可能是由于细胞的黏附从而电阻增加，阻碍电子传递。

负载细胞的共聚焦显微镜如图6所示，其中A是暗场下细胞负载图；B是局部放大图；C是三维细胞负载图。从图6可以看出：细胞可以粘附在小肠绒毛结构上，共同组成三维小肠微绒毛过敏环境，进一步实现3D立体式检测。

整体稳定性和制备再现性是构建传感器中重要环节，也是衡量一个检测方法重要指标，用同一打印料槽中的墨水进行不同批次电流稳定性测量，及其在存储4周后进行检测，检测结果如图7；其中A为不同天数下同一小肠绒毛结构的DPV电流值；B为同一批次不同小肠绒毛结构的DPV电流值。从图7可以看出：电化学传感器的DPV峰值电流并没有明显变化，保持了一个偏稳定的范围，因此具有长的货架期和具备高通量检测的潜力，便于统计分析数据进一步用于过敏原评价。

实施例3 电化学细胞传感器的参数优化

（1）3D打印墨水中酰肼化碳纳米管(MWCNT-CDH)添加量的优化

调整实施例1的3D打印墨水中酰肼化碳纳米管(WMCNT-CDH)的添加量为0.5 mg/mL、0.6mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL，制备了含有不同碳纳米管浓度的3D打印墨水；之后进行打印得到小肠绒毛结构微组织模型；之后放置在丝网印刷电极的工作电极区域，滴加150 μL 3 mM的Fe(CN)

测试结果如图8所示，从图8可以看出：电化学传感器中的循环伏安电流峰值会随着酰肼化碳纳米管(WMCNT-CDH)添加浓度从0.5 mg/mL~0.8 mg/mL而增加，在0.8 mg/mL的碳纳米管浓度时达到极值，0.9 mg/mL浓度时循环伏安电流峰值会下降，因此确定0.8 mg/mL酰肼化碳纳米管(WMCNT-CDH)为最优添加浓度，因此以此浓度用于之后的电化学细胞传感器构建和检测中。

（2）3D打印墨水中花状氧化铜纳米片添加量的优化

调整实施例1的3D打印墨水中花状氧化铜纳米片的添加量为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL，制备了含有不同花状氧化铜纳米片浓度的3D打印墨水；之后进行打印得到小肠绒毛结构微组织模型；之后放置在丝网印刷电极的工作电极区域，滴加150 μL3 mM的Fe(CN)

测试结果如图9，从图9可以看出：电化学传感器中的循环伏安电流峰值会随着自组装花状氧化铜纳米片添加浓度从0.1 mg/mL~0.3 mg/mL而增加，在0.3 mg/mL的浓度时达到极值，0.4 mg/mL浓度时循环伏安电流峰值会下降。因此确定0.3 mg/mL氧化铜纳米片为最优添加浓度，因此以此浓度用于之后的电化学细胞传感器构建和检测中。

（3）小肠绒毛结构微组织模型上细胞固定时间的优化

调整实施例2的孵育时间为0 min、5 min、10 min、15 min、20 min，其他与实施例2保持一致，得到电化学细胞传感器；之后滴加150 μL 3 mM 的Fe(CN)

测试结果如图10所示，从图10可以看出：随着孵育时间从5min到10min的增加，细胞固定值增加，导致传感器的阻抗值增大，当孵育时间为10-20min时阻抗值变化不大，在10min之后阻抗值趋于稳定，没有显著的增加，为了同时缩短构建时间，因此以10min细胞孵育时间为最佳固定时间，用于之后电化学细胞传感器检测中。

（4）小肠绒毛结构微组织模型上细胞浓度的优化

调整实施例2的细胞浓度为1×10

测试结果如图11所示，从图11可以看出：随着细胞浓度的依次增加会使细胞的固定量增加，导致电化学细胞传感器的阻抗值增加，可以基本确定细胞浓度范围为1×10

实施例4

将实施例2得到的电化学细胞传感器对小麦醇溶蛋白的定量检测（流程如图12所示），包括如下步骤：

将实施例2得到的电化学细胞传感器进行小麦醇溶蛋白加药刺激，具体为：醇溶蛋白用PBS缓冲液稀释成梯度浓度溶液，分别取0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.4 ng/mL、0.6 ng/mL、0.8ng/mL、1.0 ng/mL、1.2 ng/mL、1.4 ng/mL浓度范围的100 μL醇溶蛋白溶液滴于实施例2的电化学细胞传感器上，放于37.5℃和5%CO

电化学阻抗检测的方法为：采用150 μL 3 mM的 Fe(CN)

测试结果如图13所示，从图13可以看出：随着醇溶蛋白浓度0.1 ng/mL~0.8 ng/mL时，尼奎斯特图上半圆的直径增加，在1.0 ng/mL的醇溶蛋白浓度时，显示半圆的直径达到最大，当浓度继续增大时，电化学细胞传感器的阻抗不断减小，对其阻抗曲线进行等效电路拟合，可以看到其线性回归方程如图13中C所示，R