一种抑制变异链球菌的益生菌组合物及其应用

技术领域

本发明属于益生菌技术领域，具体涉及一种抑制变异链球菌的益生菌组合物及其应用。

背景技术

益生菌是指对人体有益的，改善宿主微生态平衡、发挥有益作用而产生某些健康功效的一类活性微生物。随着对益生菌研究的不断发展和深入，益生菌的作用不再仅局限于食品领域，而是逐渐转向应用于包括肠道疾病、阴道炎、口腔疾病、便秘等在内的一些常见疾病的预防和治疗。甚至还在其他一些疾病中产生了巨大作用，比如干酪乳杆菌、LGG和BB12这些明星菌株，在多种疾病(肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和心脑血管等)中发挥了重要的作用，然而组合菌株的功能应用鲜有研究。

龋病俗称虫牙，是由细菌引起的慢性感染性疾病，是一个连续矿化和脱矿化交替变化的过程。龋病具有发病率高、分布广的特点，多发于儿童和老人。口腔中的常见致龋细菌有变异链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)、轻型链球菌(S.mitis)、唾液链球菌(S.salivarius)、粘性放线菌(Actinomycetes viscosus)以及内氏放线菌(A.naeslundii)等，S.mutans的龋损范围广泛，主要发生在牙齿的光滑面、窝沟点隙等部位。S.mutans作为人类口腔中公认的最主要致龋细菌，其致龋毒力因子主要表现为它的产酸耐酸能力、产水不溶性胞外多糖能力、对牙面的粘附能力和形成牙菌斑生物膜的能力。在适当的环境条件下，S.mutans能利用日常摄入的碳水化合物产生大量酸性物质，这是导致牙釉质脱矿化-再矿化过程失衡进而破坏牙体组织的主要原因。

现阶段防治龋病的常见方法有氟化物的使用、糖替代品取代传统含糖食物、养成正确的刷牙方式和规律、按时进行口腔保健和龋病风险性评估等。含氟牙膏能够在一定程度上增强牙釉质的抗酸溶钙能力，但是在使用的过程中必须注意氟素的过量摄入，儿童摄入过量会导致氟斑牙。因此有必要寻找一种简单有效的龋病防治手段。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抑制变异链球菌的益生菌组合物及其应用，所述益生菌组合物安全有效，可应用于食品、功能食品及膳食补充剂中，以降低龋齿、口臭等口腔疾病的风险。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抑制变异链球菌的益生菌组合物，所述益生菌组合物包括：鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌共培养形成的菌液、动物双歧杆菌乳亚种和干酪乳杆菌共培养形成的菌液和/或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌共培养形成的菌液；

所述共培养的接种培养基包括MRS肉汤培养基，所述共培养为37℃厌氧培养24h。

优选的，所述共培养时，菌种的接种体积比均为1:1。

优选的，所述鼠李糖乳杆菌包括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AI-11菌株，所述AI-11菌株的保藏编号为CGMCC No.21745；

所述发酵乳杆菌包括发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)AI-25菌株，所述AI-25菌株的保藏编号为CGMCC No.21746；

所述动物双歧杆菌乳亚种包括动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)AI-01菌株，所述AI-01菌株的保藏编号为CGMCC No.21747；

所述干酪乳杆菌包括干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)AI-12菌株，所述AI-12菌株的保藏编号为CGMCC No.21742；

所述婴儿双歧杆菌包括婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infants)AI-20菌株，所述菌株AI-20菌株的保藏编号为CGMCC No.21779；

所述副干酪乳杆菌包括副干酪乳杆菌AI-62(Lactobacillus paracasei)菌株，所述AI-62菌株的保藏编号为CGMCC No.21744。

本发明还提供了上所述益生菌组合物在制备体外抑制变异链球菌的试剂中的应用。

优选的，所述试剂包括功能食品。

本发明还提供了一种体外抑制变异链球菌的功能食品，所述功能食品中包含上述益生菌组合物。

本发明提供了一种抑制变异链球菌的益生菌组合物，将鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种和干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌分别两两共培养，形成的菌液均表现出比单个菌株更高的抑制龋齿生成菌(变异链球菌)的抑菌效果。在本发明实施例中，对共培养菌株的发酵上清中的抑菌活性物质进行分析，发现在菌生长过程中抑菌活性物质被分泌至上清中，且16～20h抑菌活性达到最高；而且所述抑菌活性物质可耐受高温，在100℃高温下仍保有较高抑菌活性；同时所述抑菌活性物质，低pH是产生抑菌效果的一个必要条件，对某些蛋白酶敏感，抑菌活性物质可能是小分子的多肽或细菌素等。本发明上述益生菌组合物经过安全性评价，可广泛应用于益生菌保健食品中。

生物保藏信息

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AI-11菌株，于2021年01月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21745；

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)AI-25菌株，于2021年01月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21746；

动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)AI-01菌株，于2021年01月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.21747；

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)AI-12菌株，于2021年01月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21742；

婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infants)AI-20菌株，于2021年02月01日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21779；

副干酪乳杆菌AI-62(Lactobacillus paracasei)菌株，于2021年01月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21744。

附图说明

图1为动物双歧杆菌乳亚种AI-01(A)和干酪乳杆菌AI-12(B)的革兰氏染色后菌体形态图；

图2为鼠李糖乳杆菌AI-11(A)和发酵乳杆菌AI-25(B)的革兰氏染色后菌体形态图；

图3为婴儿双歧杆菌AI-20(A)和副干酪乳杆菌AI-62(B)的革兰氏染色后菌体形态图；

图4为共培养菌株及单菌株对变异链球菌的抑菌实验；其中a：鼠李糖乳杆菌AI-11※发酵乳杆菌AI-25抑菌图；b：婴儿双歧杆菌AI-20※副干酪乳杆菌AI-62抑菌图；c：干酪乳杆菌AI-12※动物双歧杆菌乳亚种AI-01抑菌图；a、b和c中，A：鼠李糖乳杆菌AI-11；B：发酵乳杆菌AI-25；C：鼠李糖乳杆菌AI-11※发酵乳杆菌AI-25；D：MRS空白对照；E：副干酪乳杆菌AI-62；F：婴儿双歧杆菌AI-20；G：婴儿双歧杆菌AI-20※副干酪乳杆菌AI-62；H：动物双歧杆菌乳亚种AI-01；I：干酪乳杆菌AI-12；J：干酪乳杆菌AI-12※动物双歧杆菌乳亚种AI-01；

图5为发酵过程中共培养菌株的抑菌活性的变化。

具体实施方式

本发明提供了一种抑制变异链球菌的益生菌组合物，所述益生菌组合物包括：鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌共培养形成的菌液、动物双歧杆菌乳亚种和干酪乳杆菌共培养形成的菌液和/或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌共培养形成的菌液；

所述共培养的接种培养基包括MRS肉汤培养基，所述共培养为37℃厌氧培养24h。

本发明利用上述菌种进行共培养时，各菌种的接种体积比优选均为1:1，即将等体积的鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种和干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌两两接种于MRS肉汤培养基上进行厌氧培养。

本发明所述鼠李糖乳杆菌优选包括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AI-11菌株，所述AI-11菌株的保藏编号为CGMCC No.21745；所述发酵乳杆菌优选包括发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)AI-25菌株，所述AI-25菌株的保藏编号为CGMCCNo.21746；所述动物双歧杆菌乳亚种优选包括动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis)AI-01菌株，所述AI-01菌株的保藏编号为CGMCC No.21747；所述干酪乳杆菌优选包括干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)AI-12菌株，所述AI-12菌株的保藏编号为CGMCC No.21742；所述婴儿双歧杆菌优选包括婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfants)AI-20菌株，所述菌株AI-20菌株的保藏编号为CGMCC No.21779；所述副干酪乳杆菌优选包括副干酪乳杆菌AI-62(Lactobacillus paracasei)菌株，所述AI-62菌株的保藏编号为CGMCC No.21744。

在本发明中，上述菌种分别进行共培养，在37℃厌氧培养20～24h时，抑菌活性达到最高，且显著优于单一菌株。本发明上述各菌种优选筛选分离自健康成人肠道。

本发明还提供了上所述益生菌组合物在制备体外抑制变异链球菌的试剂中的应用。

在本发明实施例中，通过牛津杯法对所述益生菌组合物的抑菌活性进行验证，发现抑菌效果显著优于单一菌株，证实所述益生菌组合物具有显著的体外抑制龋齿生成菌(变异链球菌)的活性，可用于制备体外抑制变异链球菌的试剂，所述试剂优选包括功能食品。

本发明还提供了一种体外抑制变异链球菌的功能食品，所述功能食品中包含上述益生菌组合物。

本发明所述功能食品优选包括咀嚼片、口崩片或口香糖，可将上述功能食品应用于改善龋齿，清新口气等。

下面结合实施例对本发明提供的一种抑制变异链球菌的益生菌组合物及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

菌株的筛选与鉴定

采用选择性培养基(双歧杆菌：TPY琼脂；乳杆菌：改良MC琼脂)从健康青年人和儿童肠道分离得到菌株，具体方法如下：用无菌竹棒挑取自然排出的粪便2～3克，置于无菌采集管中，1小时内加入50ml无菌水，振荡制成匀浆。用无菌水连续稀释10倍浓度到10

鼠李糖乳杆菌菌株AI-11单菌落形态为白色至半透明，表面凸起，边缘规则呈圆形；菌株形态为短直杆状，排列规则；发酵乳杆菌菌株AI-25单菌落形态为透明色，表面凸起，边缘呈规则圆形；菌株形态为直杆，长短不一，排列规则(图2)；

动物双歧杆菌乳亚种菌株AI-01的单菌落形态为白色至半透明色，表面凸起，边缘规则，呈圆形；菌株形态为短直杆，一端有时呈分叉状，排列规则；干酪乳杆菌菌株AI-12的单菌落形态为白色至半透明，菌落表面扁平无凸起，边缘毛糙，呈不规则星状；菌株形态为直杆，长短不一，排列规则(图1)；

婴儿双歧杆菌菌株AI-20的单菌落形态为白色至半透明、表面凸起、湿润、边缘规则、呈圆形；菌株形态为短棒状、长短不一、排列规则；副干酪乳杆菌菌株AI-62的单菌落形态为白色至半透明、表面凸起、湿润、边缘规则、呈圆形；菌株形态为短直杆状、排列规则(图3)。

经过16S rDNA分子鉴定，发现AI-11(SEQ ID NO.1)、AI-25(SEQ ID NO.2)、AI-20(SEQ ID NO.3)、AI-62(SEQ ID NO.4)、AI-01(SEQ ID NO.5)和AI-12(SEQ ID NO.6)菌株的16S rDNA序列分别同源性最高的为鼠李糖乳杆菌属(Lactobacillus rhamnosus)、发酵乳杆菌属(Lactobacillus fermentum)、婴儿双歧杆菌属(Bifidobacterium infants)、副干酪乳杆菌属(Lactobacillus paracasei)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis)和干酪乳杆菌属(Lactobacillus casei)，序列相似性高达100％。因此结合形态和分子鉴定，确定AI-11、AI-25、AI-20、AI-62、AI-01和AI-12菌株分别属于鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、婴儿双歧杆菌、副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种和干酪乳杆菌，并分别对其进行生物保藏。

吸取静置培养24h的菌混悬液按1％接种量接种至MRS肉汤培养基中，放置37℃培养箱静置培养24h，作传代操作，重复传代3次；于无菌冻存管中加入40％甘油与传代3次的益生菌菌液，体积比例为1:1。放置-20℃储存。

实施例2

菌株的安全性评价

将实施例1中得到的-20℃冻存甘油管菌株，接种复苏于正常MRS肉汤培养基中，进行3次转接活化培养(37℃厌氧培养24h)，活化后的培养液用于抗生素敏感性实验。

将活化后的各菌株分别取0.5mL，均匀涂布于MRS琼脂平皿表面，待吹干，将庆大霉素、万古霉素、卡那霉素、克林霉素、链霉素、氨苄西林、青霉素、红霉素、氯霉素的药敏纸片贴在琼脂表面，置于37℃培养箱培养24h，观察琼脂表面菌株的生长情况。若抗生素纸片周围出现明显的透明圈，则用直尺测量透明圈的直径以判断供试菌株是否具有药敏性。同时选用金黄色葡萄球菌作为药敏实验的质控菌株。供试菌株是否具有对各种抗生素的抗性依据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的相关标准(见表1)判断。

结果如表2所示，共培养以※表示，鼠李糖乳杆菌AI-11※发酵乳杆菌AI-25、婴儿双歧杆菌AI-20※副干酪乳杆菌AI-62、动物双歧杆菌乳亚种AI-01※干酪乳杆菌AI-12对九种抗生素的敏感性都很高，因此，组合益生菌是安全的。

表1药敏纸片含量及抗药性判断标准

表2 K-B纸片扩散的实验结果

表中“S”表示益生菌对抗生素表现出敏感S效果，“I”表示益生菌对抗生素表现出中介I效果，“R”表示益生菌对抗生素表现出耐药R效果，“/”表示益生菌无需进行此抗生素的安全性评估。

实施例3

采用通用牛津杯法测定共培养菌株对龋齿生成菌(变异链球菌)的抑制效果：于培养变异链球菌的固体脑心浸液琼脂BHI平皿上均匀放置4个牛津杯，每个牛津杯中加入200μL相应的益生菌菌液上清，放置37℃培养箱过夜培养后测量平皿抑菌圈。结果如表3和图4所示，单菌株均可抑制变异链球菌，但共培养菌株鼠李糖乳杆菌AI-11※发酵乳杆菌AI-25、干酪乳杆菌AI-12※动物双歧杆菌乳亚种AI-01、婴儿双歧杆菌AI-20※副干酪乳杆菌AI-62对变异链球菌的抑制效果优于单个菌株。

表3共培养菌株对变异链球菌的抑菌圈效果

实施例4

共培养菌株在发酵过程中抑菌活性的变化

将实施例1得到的-20℃冻存的甘油管菌株，接种复苏于正常MRS肉汤培养基中，进行3次转接活化培养(37℃厌氧培养24h)，活化后的培养液按1％接种量接种于6个MRS肉汤培养基中，37℃厌氧培养，每隔4h取出一管，测定pH，并离心取上清后做对变异链球菌的抑菌活性测定。

结果如图5所示，发酵过程中抑菌物质在16～20h分泌达到最大且随着发酵时间延长抑菌效果趋于稳定，同时发酵过程中前16h上清的pH变化幅度较大，后随着发酵时间的延长变化幅度较小，并逐渐趋于稳定。

实施例5

热处理对样品抑菌活性的影响

将实施例1得到的-20℃冻存得甘油管菌株，接种复苏于正常MRS肉汤培养基中，进行3次转接活化培养，活化后的培养液按1％接种量接种于6个MRS肉汤培养基中，37℃厌氧培养24h左右至平衡期，菌液离心取上清，分别置50℃、60℃、80℃、100℃水浴处理20min，进行对变异链球菌的抑菌实验。

结果如表4所示，50～100℃不同温度条件处理动物双歧杆菌乳亚种AI-01※干酪乳杆菌AI-12的上清后，菌液上清对变异链球菌的抑菌活性无明显差异。说明抑菌物质对热不敏感，可以排除大分子蛋白质作为抑菌物质的可能。

表4热处理对样品抑菌活性的影响(抑菌圈直径的单位mm)

实施例6

pH对样品抑菌活性的影响

将实施例1得到的-20℃冻存得甘油管菌株，接种复苏于正常MRS肉汤培养基中，进行3次转接活化培养，活化后的培养液接种至MRS肉汤培养基中，37℃厌氧培养24h左右至平衡期。菌液离心取上清，用浓盐酸和浓氢氧化钠调节上清pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0；同时设置磷酸缓冲液对照，pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，继续进行对变异链球菌的抑菌实验。

结果如表5所示，当上清的pH低于4.0时有抑菌活性且随pH的降低抑菌圈直径逐渐增大，当上清的pH高于4.0时均无抑菌活性。对照组磷酸-盐酸缓冲液仅当pH达到2.0时才出现较弱的抑菌作用。说明低pH是产生抑菌效果的一个必要条件，在低pH下，某些抑菌物质的效果增强。

表5 pH对样品抑菌活性的影响(抑菌圈直径的单位mm)

实施例7

蛋白酶预处理对样品抑菌活性的影响

将实施例1得到的-20℃冻存得甘油管菌株，接种复苏于正常MRS肉汤培养基中，进行3次转接活化培养，活化后的培养液接种至MRS肉汤培养基中，37℃厌氧培养24h左右至平衡期。菌液离心取上清，分别调节pH至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶最适处理pH(2.0、8.0、8.0、7.0)，加入相应酶调节酶浓度至0U/mL、100U/mL、200U/mL，过滤后放置于胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶最适处理温度(37℃、37℃、37℃、50℃)，过夜，将上清置100℃沸水浴5～10min，水浴冷却3min，进行抑菌实验。

结果如表6所示，动物双歧杆菌乳亚种AI-01※干酪乳杆菌AI-12在胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K处理后抑菌活性无明显变化，胰蛋白酶处理后抑菌活性稍有不同，表现为酶作用量越大，抑菌活性下降越多；此现象说明抑菌成分中含有某些对蛋白酶敏感的物质，可能是小分子多肽或细菌素等。

表6蛋白酶预处理对样品抑菌活性的影响(抑菌圈直径的单位mm)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 艾兰得生物科技研究泰州有限公司

<120> 一种抑制变异链球菌的益生菌组合物及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> Lactobacillus rhamnosus

<400> 1

gtatacatgc aagtcgaacg agttctgatt attgaaaggt gcttgcatct tgatttaatt 60

ttgaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcccttaag tgggggataa 120

catttggaaa cagatgctaa taccgcataa atccaagaac cgcatggttc ttggctgaaa 180

gatggcgtaa gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta ttagctagtt ggtgaggtaa 240

cggctcacca aggcaatgat acgtagccga actgagaggt tgatcggcca cattgggact 300

gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa 360

gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt 420

ggagaagaat ggtcggcaga gtaactgttg tcggcgtgac ggtatccaac cagaaagcca 480

cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta 540

ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagccc tcggcttaac 600

cgaggaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg 660

tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt 720

ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag 780

tccatgccgt aaacgatgaa tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca gtgccgcagc 840

taacgcatta agcattccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 900

acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960

accaggtctt gacatctttt gatcacctga gagatcaggt ttccccttcg ggggcaaaat 1020

gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080

cgagcgcaac ccttatgact agttgccagc atttagttgg gcactctagt aagactgccg 1140

gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200

tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaga ccgcgaggtc aagctaatct 1260

cttaaagcca ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa gtcggaatcg 1320

ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380

cgtcacacca tgagagtttg taacacccga agccggtggc gtaacccttt tagggagcga 1440

gccgtctaag gg 1452

<210> 2

<211> 1459

<212> DNA

<213> Lactobacillus fermentum

<400> 2

tgctatacat gcaagtcgaa cgcgttggcc caattgattg atggtgcttg cacctgattg 60

attttggtcg ccaacgagtg gcggacgggt gagtaacacg taggtaacct gcccagaagc 120

gggggacaac atttggaaac agatgctaat accgcataac aacgttgttc gcatgaacaa 180

cgcttaaaag atggcttctc gctatcactt ctggatggac ctgcggtgca ttagcttgtt 240

ggtggggtaa cggcctacca aggcgatgat gcatagccga gttgagagac tgatcggcca 300

caatgggact gagacacggc ccatactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca 360

atgggcgcaa gcctgatgga gcaacaccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag 420

ctctgttgtt aaagaagaac acgtatgaga gtaactgttc atacgttgac ggtatttaac 480

cagaaagtca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta 540

tccggattta ttgggcgtaa agagagtgca ggcggttttc taagtctgat gtgaaagcct 600

tcggcttaac cggagaagtg catcggaaac tggataactt gagtgcagaa gagggtagtg 660

gaactccatg tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg 720

gctacctggt ctgcaactga cgctgagact cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat 780

accctggtag tccatgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca 840

gtgccggagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc 900

aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc 960

gaagaacctt accaggtctt gacatcttgc gccaacccta gagatagggc gtttccttcg 1020

ggaacgcaat gacaggtggt gcatggtcgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080

agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgttact agttgccagc attaagttgg gcactctagt 1140

gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcagatcatc atgcccctta 1200

tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cggtacaacg agtcgcgaac tcgcgagggc 1260

aagcaaatct cttaaaaccg ttctcagttc ggactgcagg ctgcaactcg cctgcacgaa 1320

gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380

acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg gtaacctttt 1440

aggagccagc cgcctaagt 1459

<210> 3

<211> 890

<212> DNA

<213> Bifidobacterium infants

<400> 3

cccgcattta ccgcgacgtt gctgattcgc gattacttag cgacttccgc cttcacgcag 60

tcgagttgca gacttgcgat ccgaacttga gaccggtttt cagggatccg ctccgcgtcg 120

ccgcgtcgca tcccgttgta ccggccattg tagcatgcgt gaagccctgg acgtaagggg 180

catgatgatc tgacgtcatc cccaccttcc tccgagttaa ccccggcggt cccccgtgag 240

ttcccggcac aatccgctgg caacacgggg cgagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc 300

caacatctca cgacacgagc tgacgacgac catgcaccac ctgtgaaccc gccccgaagg 360

gaaaccccat ctctgggatc gtcgggaaca tgtcaagccc aggtaaggtt cttcgcgttg 420

catcgaatta atccgcatgc tccgccgctt gtgcgggccc ccgtcaattt ctttgagttt 480

tagccttgcg gccgtactcc ccaggcggga tgcttaacgc gttagctccg acacggaacc 540

cgtggaacgg gccccacatc cagcatccac cgtttacggc gtggactacc agggtatcta 600

atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct cagcgtcagt aacggcccag agacctgcct 660

tcgccattgg tgttcttccc gatatctaca cattccaccg ttacaccggg aattccagtc 720

tcccctaccg cactcaagcc cgcccgtacc cggcgcggat ccaccgttaa gcgatggact 780

ttcacaccgg acgcgacgaa ccgcctacga gccctttacg cccaataatt ccggataacg 840

cttgcaccct acgtatacgc gtgtgcgccc ccctattaaa aaaaaaaaaa 890

<210> 4

<211> 1473

<212> DNA

<213> Lactobacillus paracasei

<400> 4

actttgtcac ttagacggct cgctccctaa aagggttacg ccaccggctt cgggtgttac 60

aaactctcat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcgt 120

gctgatccgc gattactagc gattccgact tcgtgtaggc gagttgcagc ctacagtccg 180

aactgagaat ggctttaaga gattagcttg acctcgcggt ctcgcaactc gttgtaccat 240

ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca 300

ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctta ctagagtgcc caactaaatg ctggcaacta 360

gtcataaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga 420

caaccatgca ccacctgtca ttttgccccc gaaggggaaa cctgatctct caggtgatca 480

aaagatgtca agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac 540

cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcaacc ttgcggtcgt actccccagg 600

cggaatgctt aatgcgttag ctgcggcact gaagggcgga aaccctccaa cacctagcat 660

tcatcgttta cggcatggac taccagggta tctaatcctg ttcgctaccc atgctttcga 720

gcctcagcgt cagttacaga ccagacagcc gccttcgcca ctggtgttct tccatatatc 780

tacgcatttc accgctacac atggagttcc actgtcctct tctgcactca agtttcccag 840

tttccgatgc gcttcctcgg ttaagccgag ggctttcaca tcagacttaa aaaaccgcct 900

gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggat aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct 960

gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ttggataccg tcacgccgac aacagttact 1020

ctgccgacca ttcttctcca acaacagagt tttacgaccc gaaagccttc ttcactcacg 1080

cggcgttgct ccatcagact tgcgtccatt gtggaagatt ccctactgct gcctcccgta 1140

ggagtttggg ccgtgtctca gtcccaatgt ggccgatcaa cctctcagtt cggctacgta 1200

tcatcgcctt ggtgagccat tacctcacca actagctaat acgccgcggg tccatccaaa 1260

agcgatagct tacgccatct ttcagccaag aaccatgcgg ttcttggatc tatgcggtat 1320

tagcatctgt ttccaaatgt tatcccccac ttaagggcag gttacccacg tgttactcac 1380

ccgtccgcca ctcgttccat gttgaatctc ggtgcaagca ccgatcatca acgagaactc 1440

gttcgacttg catgtatagc acgccgcccc cac 1473

<210> 5

<211> 884

<212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis

<400> 5

gagcattcac cgcggcgttg ctgatccgcg attactagcg actccgcctt cacgcagtcg 60

agttgcagac tgcgatccga actgagaccg gttttcagcg atccgcccca cgtcaccgtg 120

tcgcaccgcg ttgtaccggc cattgtagca tgcgtgaagc cctggacgta aggggcatga 180

tgatctgacg tcatccccac cttcctccga gttgaccccg gcggtcccac atgagttccc 240

ggcatcaccc gctggcaaca tgcggcgagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca 300

tctcacgaca cgagctgacg acgaccatgc accacctgtg aaccggcccc gaagggaaac 360

cgtgtctcca cggcgatccg gcacatgtca agcccaggta aggttcttcg cgttgcatcg 420

aattaatccg catgctccgc cgcttgtgcg ggcccccgtc aatttctttg agttttagcc 480

ttgcggccgt actccccagg cgggatgctt aacgcgttgg ctccgacacg ggacccgtgg 540

aaagggcccc acatccagca tccaccgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct 600

gttcgctccc cacgctttcg ctcctcagcg tcagtgacgg cccagagacc tgccttcgcc 660

attggtgttc ttcccgatat ctacacattc caccgttaca ccgggaattc cagtctcccc 720

taccgcactc cagcccgccc gtacccggcg cagatccacc gttaggcgat ggactttcac 780

accggacgcg acgaaccgcc tacgagccct ttacgcccaa taaatccgga taacgctcgc 840

accctacgta ttaccgcggc tgctgcggcc ggccggtata ttaa 884

<210> 6

<211> 1479

<212> DNA

<213> Lactobacillus casei

<400> 6

atgggggtgg cgcgtgctat acatgcagtc gaacgagttt tggtcgatga acggtgcttg 60

cactgagatt cgacttaaaa cgagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc 120

ttaagtgggg gataacattt ggaaacagat gctaataccg cataaatcca agaaccgcat 180

ggttcttggc tgaaagatgg cgcaagctat cgcttttgga tggacccgcg gcgtattagc 240

tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg atgatacgta gccgaactga gaggttgatc 300

ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360

ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggc tttcgggtcg 420

taaaactctg ttgttggaga agaatggtcg gcagagtaac tgttgtcggc gtgacggtat 480

ccaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 540

cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 600

agccctcggc ttaaccgagg aagcgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga 660

cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 720

aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat 780

tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttggag ggtttccgcc 840

cttcagtgcc gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga 900

aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960

aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cttttgatca cctgagagat caggtttccc 1020

cttcgggggc aaaatgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080

ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgactagttg ccagcattga gttgggcact 1140

ctagtaagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200

ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgagaccgcg 1260

aggtcaagct aatctcttaa agccattctc agttcggact gtaggctgca actcgcctac 1320

acgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc 1380

cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccgaagccg gtggcgtaac 1440

ccttttaggg agcgagccgt ctaagtgaca aaagtttcg 1479