干细胞定向分化心肌细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及干细胞定向分化心肌细胞的方法。

背景技术

心血管疾病目前是威胁人类健康的头号杀手。目前的研究发现，成体心脏中并不存在能够再生为心肌细胞的心脏干细胞。因此，心脏损伤后导致数以万计的心肌细胞的死亡具有不可逆性，引起心脏结构重塑和心功能的下降。

人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(human embryonic stemcell,hESC)和人诱导多潜能干细胞(human induced pluripotent stemcell,hiPSC)具有自我更新和多分化的潜能。近年来的研究发现，多能干细胞在体外能够定向分化成心肌细胞。2012年，美国威斯康辛大学Sean P.Paleceka团队发现通过阶段性激活和抑制WNT信号通路，在不含胰岛素的B27体系中，能够高效诱导心肌细胞的分化，相关研究结果发表于PNAS(10.1073/pnas.1200250109)。但该分化体系中的主要成分B27-ins(A1895601，Gibco)以及B27(17504044，Gibco)中含有大量的牛血清白蛋白(BSA)和其他蛋白成分，且成分不明确，并且该分化体系前期(中胚层)使用B27-ins，而后才换成B27完全添加剂。2014年，美国斯坦福大学Joseph C Wu团队开发出了仅含有基础培养基(RPMI1640)抗坏血酸以及人白蛋白的化学成分明确的分化系统(CDM3)，利用两种化学小分子CHIR-99021和Wnt-C59成功地将11种人诱导多能干细胞系分化成心肌细胞，相关研究成果发表于Nature Methods(10.1038/nmMeth.2999)。但CDM3分化系统中的人白蛋白不仅价格昂贵，且同样无法做到化学成分明确。对于本领域而言，化学成分不明确的培养基，不仅容易造成异源蛋白的排异反应，更重要的是，化学成分不明确的组分在不同批次中表现出较大的差异，往往不能够稳定的实现预期培养效果。目前现存的两种广泛用于人多能干细胞定向分化心肌细胞的体系存在化学成分不明确且分化成本高的问题，无法适用于细胞治疗的临床级标准。而如何在维持良好的分化效果的前提下，避免不能明确化学成分的动物源成分的添加，仍是本领域研究的热点。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供不采用蛋白的干细胞定向分化心肌细胞的方法。

本发明提供的干细胞定向分化心肌细胞的方法，包括：

第0天起，将密度为70％～90％的干细胞以培养基I培养40～50h，每24h更换新鲜培养基I；

第2天起，以培养基II继续培养40～50h，每24h更换新鲜培养基II；

第4天起，以培养基III继续培养40～50h，每24h更换新鲜培养基III；

第6天起，以培养基II继续培养，每24h更换新鲜培养基II，直至分化为心肌细胞。

本发明研究表明，采用适宜的培养基配合合理的培养方案，能够提高干细胞分化为心肌细胞的效率，相对于培养基中有效成分配比不佳，或者更换培养液方案不当的对照组，本发明提供的培养方法能够更有效的促进干细胞向心肌细胞分化。

一些实施例中，本发明所述的方法包括：

第0天起，将密度为80％的干细胞以培养基I培养48h，每24h更换新鲜培养基I；

第2天起，以培养基II继续培养48h，每24h更换新鲜培养基II；

第4天起，以培养基III继续培养48h，每24h更换新鲜培养基III；

第6天起，以培养基II继续培养48～120h，每24h更换新鲜培养基II，直至分化为心肌细胞。

本发明中，所述培养基I为含有CHIR-99021的抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基(命名为PFCDM培养基)；

所述培养基II为含有抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基，即PFCDM；

所述培养基III为含有Wnt-C59的抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基(命名为PFCDM培养基)。

本发明实施例中，

所述培养基I为含有4～6μmol/L CHIR-99021的PFCDM培养基；

所述培养基II为含有200μg/ml～250μg/ml抗坏血酸、1vol％～2vol％化学成分明确的脂类添加物和1wt％双抗的RPMI1640培养基，即PFCDM；

所述培养基III为含有2μmol/L Wnt-C59的PFCDM培养基。

本发明中，所述干细胞为胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞。

本发明中，所述培养的条件为37℃，饱和湿度，5％CO

判断分化为心肌细胞的标准为：细胞出现自发跳动；表达心肌细胞特异基因TNNT2、MYL2、TNNI3等关键基因。

一些实施例中，所述干细胞为3～4代的干细胞，其培养方法包括：

将干细胞依次以DPBS溶液润洗两遍，0.5mM的EDTA溶液润洗一遍，培养基V润洗一遍；然后接种于含有6μmol/L～10μmol/L Y27632培养基V进行培养至密度为80％传代；

所述接种的密度为0.4×10

所述培养基V为mTeSR完全培养基(Stemcell公司)。

本发明还提供了一种培养基组合，其包括培养基I、培养基II和培养基III；

所述培养基I为含有CHIR-99021的PFCDM培养基；

所述培养基II为含有抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基；

所述培养基III为含有Wnt-C59、抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基。

一些实施例中，所述培养基组合中，

所述培养基I为含有4～6μmol/L CHIR-99021的PFCDM培养基；

所述培养基II为含有200μg/ml～250μg/ml抗坏血酸、1vol％～2vol％化学成分明确的脂类添加物和1wt％双抗的RPMI1640培养基，即PFCDM培养基；

所述培养基III为含有2μmol/L Wnt-C59的PFCDM培养基。

一些具体实施例中，所述培养基组合中，

所述培养基I为含有5μmol/L CHIR-99021的PFCDM培养基；

所述培养基II为含有225μg/ml抗坏血酸、1.5vol％化学成分明确的脂类添加物和1wt％双抗的RPMI1640培养基，即PFCDM培养基；

所述培养基III为含有2μmol/L Wnt-C59的PFCDM培养基。

(mTeSR培养基不属于本发明)本发明所述的培养基组合中，各培养基中的组分，例如抗坏血酸、CHIR-99021、Wnt-C59、化学成分明确的脂类添加物、双抗等因在培养基中表现不稳定，因此在进行细胞培养前，现用现配。

本发明所述的培养基组合的配制方法，包括：

以水为溶剂，配制浓度为64mg/ml的抗坏血酸母液；

以DMSO为溶剂，配制浓度为20mmol/L的CHIR-99021母液；

以DMSO为溶剂，配制浓度为10mmol/L的Wnt-C59母液；

使用前：

将CHIR-99021母液加入PFCDM培养基获得培养基I；

将抗坏血酸母液、化学成分明确的脂类添加物、双抗加入RPMI1640培养基获得培养基II；

将Wnt-C59母液、抗坏血酸母液、化学成分明确的脂类添加物、双抗加入RPMI1640培养基获得培养基III。

本发明提供了将干细胞定向分化为心肌细胞的方法，该方法利用合理的培养基，在不添加蛋白成分的情况下，配合适宜的培养方案能够促进干细胞向心肌细胞分化，8～10天即可获得自发跳动的心肌细胞，培养15天后，Cardiac troponin T阳性的心肌细胞可达84.31％，且降低了排异反应发生的可能性。

附图说明

图1示分化培养方案；

图2示实施例4培养细胞的免疫荧光染色结果，其中心肌细胞标志分子Cardiactroponin T(cTNT，绿色)和alpha-Actinin(α-actinin，粉红色)，蓝色为细胞核，图中可见，cTNT和α-actinin镶嵌平行有序排列，且cTNT较粗，而α-actinin肌丝较细，是心肌细胞典型的细胞骨架形态；

图3示实施例4和对比例1培养所得细胞的流式细胞检测结果；

图4示培养获得细胞的关键基因的表达水平，其中，B27示对比例1或2的表达水平，RL2示实施例3或4的表达水平。

具体实施方式

本发明提供了干细胞定向分化心肌细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中部分组分的商品名和购买来源为：mTeSR培养基(85851；85850，Stemcell)、RPMI1640(61870036，Gibco)、抗坏血酸(L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesiumsalt hydrate，A8960，Sigma)、化学成分明确的脂类添加物(Chemically Defined LipidConcentrate，11905031，Gibco)和青霉素/链霉素(Penicillin-Streptomycin，15070063，Gibco)，CHIR-99021(S2924，Selleck)，Wnt-C59(S7037，Selleck)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1培养基配制

抗坏血酸母液：称取3.2g的L-AA溶于40mL的无菌蒸馏水中，充分溶解后定容至50mL，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后保存于-80℃。

CHIR-99021母液：将10mg的粉末完全溶解于0.9964mL的二甲基亚砜(DMSO)中，浓度为20mmol/L，分装后保存于-80℃。

Wnt-C59母液：将5mg的粉末完全溶解于1.3177mL的DMSO中，浓度为10mmol/L，工作浓度1-2μmol/L。

以上述母液配制：

培养基I配制方法为：在PFCDM培养基中加入CHIR-99021母液至CHIR-99021的浓度为5μmol/L CHIR-99021；

培养基II为配制方法为：在RPMI1640培养基中加入抗坏血酸母液、化学成分明确的脂类添加物和青霉素、链霉素。至各组分的浓度为：抗坏血酸225μg/ml、化学成分明确的脂类添加物1.5vol％和青霉素1wt％、链霉素1wt％；

培养基III为含有2μmol/L Wnt-C59、225μg/ml抗坏血酸、1.5vol％化学成分明确的脂类添加物和1wt％双抗的RPMI1640培养基。

实施例2胚胎干细胞和诱导多潜能干细胞的培养和传代

胚胎干细胞和诱导多潜能干细胞的培养及传代过程一致，以胚胎干细胞为例，其培养和传代方法包括：

显微镜下观察细胞克隆形态，未分化的细胞呈现出典型的立体感，并且细胞的核质比较大，单个克隆中细胞紧凑，且克隆周围折光率较高。当两个细胞克隆开始汇集时即可进行传代。传代过程如下：将细胞培养基吸尽，用平衡到室温的DPBS溶液润洗两遍，加入0.5mM的EDTA超净台静置5-7分钟，将多余的液体吸除，加入mTeSR培养基重悬细胞离心后收集细胞沉淀，按照适当的传代比例(1:6～1:10或0.8～1.2×10

实施例3心肌细胞的定向分化

取实施例2培养获得的细胞密度达到80％左右的诱导多潜能干细胞，分化步骤如图1，具体的：

Day 0，将培养基更换为含有5μM GSK3抑制剂CHIR-99021的PFCDM培养基(实施例I配制的培养基I)处理48小时，每24小时更换新鲜培养基；

从Day 2开始继续用实施例1配制的培养基II培养48小时，每24小时更换新鲜培养基，

于Day 4开始用实施例1配制的培养III培养，每24小时更换新鲜培养基；

Day 6之后一直使用实施例1配制的培养基II培养，每24小时更换新鲜培养基通常在Day 8-11可以看到自发跳动的心肌细胞，继续培养至D15进行检测。

实施例4心肌细胞的定向分化

取实施例2培养获得的细胞密度达到80％左右的胚胎干细胞，分化步骤如图1，具体的：

Day 0，将培养基更换为含有5μM GSK3抑制剂CHIR-99021的PFCDM培养基(实施例1配制的培养基I)处理48小时，每24小时更换新鲜培养基；

从Day 2开始继续用实施例1配制的培养基II培养48小时，每24小时更换新鲜培养基，

于Day 4开始用实施例1配制的培养III培养，每24小时更换新鲜培养基；

Day 6之后一直使用实施例1配制的培养基II培养，每24小时更换新鲜培养基通常在Day 8-11可以看到自发跳动的心肌细胞，继续培养至D15进行检测。

对比例1

取实施例2培养获得的细胞密度达到80％左右的诱导多潜能干细胞，采用B27培养基的培养方法。

B27的分化过程时间点与实施例3一致，主要区别在于，Day0-2，培养基为含有5μMGSK3抑制剂CHIR-99021、2％的B27-ins和双抗的1640培养基；Day2-4，培养基为含有2μmol/L Wnt-C59、2％B27和1wt％双抗的RPMI1640培养基；之后的培养一直为含有2％B27和1wt％双抗的RPMI1640培养基。

对比例2

取实施例2培养获得的细胞密度达到80％左右的胚胎干细胞，采用B27培养基的培养方法。

B27的分化过程时间点与实施例4一致，主要区别在于，Day0-2，培养基为含有5μMGSK3抑制剂CHIR-99021、2％的B27-ins和双抗的1640培养基；Day2-4，培养基为含有2μmol/L Wnt-C59、2％B27和1wt％双抗的RPMI1640培养基；之后的培养一直为含有2％B27和1wt％双抗的RPMI1640培养基。

分化效果检测

对实施例3～4和对比例1～2诱导分化后的心肌样细胞进行检测：

免疫荧光检测

实验前，配新鲜的4％多聚甲醛(PFA)用于细胞固定。DPBS润洗细胞之后，加入平衡至室温的4％PFA静置10分钟后，用DPBS清洗3遍后，加入含0.5％Triton X 100的PBS透膜处理10分钟后，PBST(含0.1％Tween 20的PBS)洗3遍，每次5分钟。随后，用5％BSA室温固定1小时后再次用PBST洗涤。根据实验需要，用PBST稀释一抗，置于4℃孵育过夜。次日继续用PBST洗涤细胞，按照要求室温避光孵育荧光二抗1小时后再次洗涤细胞。最后，加入细胞核染料DAPI对细胞核进行标记，染色结束后即可进行观察拍照。其中，实施例4由胚胎干细胞分化而来的心肌细胞结构如图2。实施例3培养获得的心肌细胞结构与此相似。

流式细胞术检测

收集细胞，300g室温离心5分钟后，加入90％预冷甲醇4℃固定过夜。次日，用流式洗涤缓冲液洗涤细胞，加入对应的一抗(使用比例1：100～1：250)室温孵育1小时，离心收集细胞，用含有荧光二抗(使用比例1：200～1：500)的洗涤液重悬细胞，避光孵育1小时。将标记的细胞离心，重悬于缓冲液中即可上机检测。

收集实施例4和对比例1胞分化15天的心肌细胞，分别用Cardiac troponin T和alpha-Actinin标记心肌细胞，流式结果显示：实施例4中(RL2 System)，Cardiac troponinT阳性的心肌细胞为84.31％，而对比例1中(B27 system)Cardiac troponin T阳性的心肌细胞仅为68.75％，表明实施例4条件下，心肌细胞的分化效率较高。

荧光定量PCR检测

Trizol法收集细胞RNA，取500ng的RNA用于第一链cDNA的合成。利用SYBR荧光法进行定量PCR检测。实验中，以18S作为对照，检测不同条件下获得的心肌细胞中TNNT2、TNNI3、MYL7基因的表达情况。对检测基因的Ct值进行2

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。