一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及猕猴桃病毒的脱除方法。

背景技术

猕猴桃属于猕猴桃科(Actinidiaceae)，猕猴桃属(Actinidia)，中国是猕猴桃的起源与分布中心。猕猴桃的营养价值高，其果实和根部广泛应用于食品和医疗领域，栽培地遍布世界各地。近年来，中国的猕猴桃产业发展迅速，在猕猴桃种植面积和产量上都有着极大的提升。陕西省作为中国猕猴桃的主要生产省份，为中国和世界猕猴桃产量作出了巨大的贡献，分别占中国猕猴桃总产量的60％和世界猕猴桃总产量的40％。近年来，随着猕猴桃种植面积的不断扩大以及猕猴桃的大范围连片种植，造成猕猴桃易于发生多种病害。猕猴桃是多年生果树，一旦被病毒侵染便会终生带毒，并且会通过不同的途径向周围的植株传播病毒。多年来，人们常常关注溃疡病对猕猴桃的危害，确忽略了病毒病对猕猴桃的潜在危害，造成田间大量猕猴桃植株被多种病毒混合侵染，严重影响了猕猴桃的产量和品质。

猕猴桃一旦被病毒感染便会终生带毒，没有较好的治疗方法，推广使用脱毒苗是解决猕猴桃病毒危害最经济有效的方法。然而，目前没有关于猕猴桃脱毒方法的报道，市场上也缺乏猕猴桃脱毒苗。

发明内容

本研究针对我国猕猴桃病毒病害发生的现状，发明了一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法。

本发明可通过如下技术方案实现：一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：

剥离2mm左右的猕猴桃茎尖在继代培养基上培养1天后转入含有甘油和蔗糖的液体培养基上再培养1天，将茎尖转入PVS2中在冰上处理40分钟后转到灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻处理1h，再将铝箔条快速取出并浸入液体蔗糖培养基中进行解冻。解冻20min后取出茎尖，用滤纸吸干表面的水分，移入继代培养基中进行再生培养，前3天黑暗处理，第4天开始10μmol s

所述的继代培养基成为：MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA，pH5.8。

所述的含有甘油和蔗糖的培养基配方为：MS+2.0M甘油+0.8M蔗糖。

所述的液体蔗糖培养基配方为：MS+1.2M蔗糖。

本发明小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法具有操作简单、耗时短、脱毒率高、再生率高的优点，具有较好的技术效果和应用前景。

附图说明

图1是4种病毒的RT-PCR检测结果：A-D分别为猕猴桃病毒2(AcV2)、猕猴桃黄化病毒1(AcYV1)、猕猴桃黄化病毒2(AcYV2)和猕猴桃黄化环斑病毒(AYRSpV)的检测结果；M：DNA分子量标准；1-10分别为10个茎尖超低温脱毒后再生的猕猴桃苗；其中对于AcV2，2-5、9和10号样品均脱除了该病毒；对于AcYV1，1-5和8-10号样品均脱除了该病毒；对于AcYV2，2-6、9和10号样品均脱除了该病毒；对于AYRSpV，1、2、5、6和8-10号样品均脱除了该病毒。

图2是经过茎尖超低温脱毒后再生的徐香猕猴桃组培苗。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但下述实施例并不限制本发明。

本发明提供了一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：剥离2mm左右的猕猴桃茎尖50个，在继代培养基(MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L NAA，pH5.8)上培养1天后转入MS+2.0M甘油+0.8M蔗糖培养基上再培养1天，将茎尖转入PVS2中在冰上处理40分钟后转到灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻处理1h，再将铝箔条快速取出并浸入液MS+1.2M蔗糖培养基中进行解冻。解冻20min后取出茎尖，用滤纸吸干表面的水分，移入继代培养基中进行再生培养，前3天黑暗处理，第4天开始10μmol s

对成活的幼苗继续进行光照培养，3周后需要继代培养一次，继代后再培养4周，进行AcV2、AcYV1、AcYV2和AYRSpV4种猕候桃病毒的RT-PCR检测。检测引物由北京奥科生物科技有限公司合成，具体引物名称和序列见表1。

表1 4中猕猴桃病毒的检测引物

具体检测步骤包括样品总RNA的提取，RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测。检测后统计以上4种病毒的脱毒率，结果AcV2的脱毒率为67.6％，AcYV1的脱毒率为76.5％，AcYV2的脱毒率为73.5％，AYRSpV的脱毒率为64.7％。