一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法

技术领域：

本发明涉及微生物发酵培养技术领域，具体涉及一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法。

背景技术：

在水产加工过程中会产生20％-40％的废弃物即鱼头、内脏、鱼皮、鱼骨等水产品加工下脚料或深海低值鱼虾下角料等组织，这些组织中含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质等，如果不加以利用，将造成资源极大浪费，因此，充分利用水产加工下脚料，不仅提高其附加值，而且在减少加工业污染排放、保护环境等方面均具有重要的意义。饼粕是油制品的副产物。炼油厂不仅把饼粕当做动物饲料来处理，这就造成了一定程度的污染和浪费。以一定浓度的饼粕粉作为微生物氮源制作成发酵的培养基，不仅使饼粕这种廉价品得以充分利用，而且可以通过进一步微生物发酵处理得到有着良好功能性与营养特性的肥料产品。麸皮是小麦加工面粉过程中的主要副产品，成分主要含有蛋白质、脂肪、维生素及大量膳食纤维等。在生产面粉过程中，小麦加工量的20％为麸皮，我国小麦麸皮年产量可达3000万吨，因此把小麦麸皮作为微生物发酵营养，并充分开发利用，具有很高的经济效益和社会效益。糖蜜是制糖工业的副产品，其中含有大量可发酵糖，由于我国制糖业快速发展，糖蜜的产量也逐年大幅度增加，它为发酵工业提供了大量的廉价原料。由于上述物料中含有微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子等影响成分，因此若将上述物质处理后用于配置发酵培养基，可以减少对酵母粉、蛋白胨、葡萄糖等昂贵氮源、碳源的使用量，达到废弃物资源化利用，降低产品生产成本，并达到绿色、节能环保的社会效益。

本试验保存的芽孢杆菌菌株具有良好的开发前前景和研究价值。芽孢杆菌培养基配方与发酵水平密切相关，决定着产品的应用效果和企业的经济效益。近年来，一些研究人员相继采用正交设计的方法对培养基组分和培养条件进行优化筛选，取得了一定的成效。现阶段的工业化生产中，常存在着发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题，对此我们对发酵培养基进行了优化试验，以提高芽孢杆菌的产量并降低生产成本。本发明旨在以廉价农副产品为原料，对芽孢杆菌发酵条件和培养基组成进行优化，以提高芽孢率，为进一步大规模发酵生产提供廉价培养基。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供了广泛筛选了各种农副产品废弃物作为芽孢杆菌培养基的营养物质，并依据芽孢杆菌自身代谢特性及在发酵过程中易用简单碳源，在简单碳源缺乏的情况下菌体转向利用复杂碳源，控制氮源供应量，在发酵后期形成对芽孢杆菌的营养胁迫，促进产孢，促进芽孢杆菌很好生长繁殖，使得芽孢杆菌增殖速率显著提升，培养浓度高于常规配方40％以上，且菌剂在上述制备营养液中保存期1年，损耗率低于10％以下，高于国家标准，且节约资源，减少浪费，降低生产成本的一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法的具体步骤如下：①以重量份数计：30-40％水产品加工下脚料或深海低值鱼虾下角料、25-35％麸皮、15-20％饼粕、15-20％糖蜜、添加调节水分50％-60％，达到手握成团，一松即散，按上述物料每吨另加入上述物料重量比0.2-0.3％氢氧化钠和有机物料熟剂0.01％，混合均匀后进行好氧发酵；

②好氧发酵具体步骤为：将上述物料混合均匀后堆成高0.8m左右，宽1.5m左右等腰梯形条剁，当内部温度升至60度以后，每天早上、晚上翻抛一次，维持60度以上发酵3-5天；

③发酵结束，将堆肥原料加入重量比1∶3倍水进行搅拌，通过专用的高速胶体磨机，让未充分反应的固体材料更加充分的反应和细化于水溶液内，提高液体的养分含量和稳定性，可以使固体原料中含有的水溶养分溶解更加的完全、均匀，使微生物更加容易吸收，提高发酵的效果，80目以上进行固液分离，得到固形物浓度14-20％略带粘稠的深褐色培养液；

④以分离得到的液体作为培养基接种芽孢杆菌，进行发酵培养36-48h得到高含量发酵培养菌液，制得高浓度芽孢杆菌液体微生物肥产品。

所述的一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法的步骤①所述的水产品加工下脚料或深海低值鱼虾下角料清洗后粉碎打成浆，所用饼粕包括括豆粕、菜粕、芝麻粕、花生粕等粉碎20目以上，糖蜜为干物质含量45％以上浓缩糖蜜，有机物料腐熟剂为HB有机物料腐熟剂。

所述一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法步骤④的所述芽孢杆菌包括巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌含量为30-70亿/ml，巨大芽孢杆菌菌含量为10-30亿/g。

本发明的有益效果是：本发明通过实验手段广泛筛选了作为芽孢杆菌培养基的营养物质，依据芽孢杆菌自身代谢特性和实际使用效果确定了独特的配方，其成本较低、易于制备，因此具有突出的规模化应用前景。

1、芽孢杆菌繁殖速度快，在相同的适应生长条件下，应用本发明制备培养基可使芽孢杆菌生长繁殖快，产品菌数浓度高，较一般培养基培养菌数提高40％以上。且保存1年后液体菌剂含量损失不超过10％，高于国家规定6个月保存期。

2、培养基来源广泛，本发明芽孢杆菌培养原料简单普遍，以农副产品废弃物经综合处理后为原料，接种芽孢杆菌后进行发酵培养研制成高浓度菌剂产品。与相应以化学试剂为原料，制成培养基，接种、培养，降低生产成本，且培养液体菌剂产品其应用效果更为显著。

3、菌种适应性好，降低了生产成本。降低了芽孢杆菌对培养基营养成分要求，并且生产安全性好，对生态环境友好。

4、采用本法制备培养液除了含有大量的多肽、氨基酸、黄腐酸、维生素等小分子有机物质外，还含有许多中微量元素等矿质元素和生物活性物质，具有能够迅速补充作物养分，提高肥料利用率，改善作物品质等特点。可增强作物抗逆性，促进作物的生长，且有保花、保果等功能，增产增收效果明显。

本发明的菌种来源简要说明：

本发明所采用的菌种，均购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并附和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心签订的微生物遗传资源提供利用协议书。

具体实施方式：

为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明创造作进一步的描述，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例所述的范围。

实施例1：

一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法的具体步骤如下：①以重量份数计：30-40％水产品加工下脚料或深海低值鱼虾下角料、25-35％麸皮、15-20％饼粕、15-20％糖蜜、添加调节水分50％-60％，达到手握成团，一松即散，按上述物料每吨另加入上述物料重量比0.2-0.3％氢氧化钠和有机物料熟剂0.01％，混合均匀后进行好氧发酵；

②好氧发酵具体步骤为：将上述物料混合均匀后堆成高0.8m左右，宽1.5m左右等腰梯形条剁，当内部温度升至60度以后，每天早上、晚上翻抛一次，维持60度以上发酵3-5天；

③发酵结束，将堆肥原料加入重量比1∶3倍水进行搅拌，通过专用的高速胶体磨机，让未充分反应的固体材料更加充分的反应和细化于水溶液内，提高液体的养分含量和稳定性，可以使固体原料中含有的水溶养分溶解更加的完全、均匀，使微生物更加容易吸收，提高发酵的效果，80目以上进行固液分离，得到固形物浓度14-20％略带粘稠的深褐色培养液；

④以分离得到的液体作为培养基接种芽孢杆菌，进行发酵培养36-48h得到高含量发酵培养菌液，制得高浓度芽孢杆菌液体微生物肥产品。

实施例2：

所述一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法的具体步骤如下：

①以重量份数计：水产品加工下脚料或深海低值鱼虾下角料35％、麸皮30％、粉碎豆粕20％；干物质含量45％的糖蜜15％按重量比按上述重量比进行混合，加水调节水分百分比至56％，添加上述混合物重量比0.3％氢氧化钠调节pH至7.5，按上述物料每吨加入HB有机物料腐熟剂1kg，混合均匀后进行堆肥发酵，堆肥发酵具体步骤为，将上述物料混合均匀后堆成高0.8m左右，宽1.2m等腰梯形条剁，当内部温度升至60度以后，每天早上、晚上翻抛一次，维持60度以上发酵4天；

②发酵结束，将堆肥原料加入重量比1∶3倍水进行搅拌，搅拌浸提2个小时，经高速胶体磨均质处理后，离心机80目滤网固液分离，得到固形物浓度15％左右略带粘稠的黄褐色培养液，该培养基的pH为7.6；

③取分离上清液作为枯草芽孢杆菌培养基，121度灭菌30分钟，冷却后按5％接种量接种枯草芽孢杆菌种子，维持通风量1∶0.8，发酵温度控制在36度，搅拌转速180r/min，进行发酵培养36h得到高含量发酵培养菌液，经平板活菌计数，所述枯草芽孢杆菌含量为61亿/ml，将制备的液体活菌制剂室温放置1年后，经平板活菌计数为58亿/ml，损失率5％，可见按本工艺制备营养液非常适合枯草芽孢杆菌生长繁殖及存活。

实施例3：

所述一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法的具体步骤如下：

①以重量份数计：水产品加工下脚料或深海低值鱼虾下角料30％、麸皮35％、粉碎花生粕20％；糖蜜15％按重量比按上述重量比进行混合，加水调节水分百分比至54％，添加上述混合物重量比0.3％氢氧化钠调节pH至7.8，按上述物料每吨加入HB有机物料腐熟剂1kg，混合均匀后进行好氧发酵，好氧发酵具体步骤为，将上述物料混合均匀后堆成高0.8m左右，宽1.2m等腰梯形条剁。当内部温度升至60度以后，每天早上、晚上翻抛一次。维持60度以上发酵4天；

②发酵结束，将堆肥原料加入重量比1∶3倍水进行搅拌浸提2h，经高速胶体磨均质处理后，离心机80目滤网固液分离。得到固形物浓度16％左右略带粘稠的深褐色营养液，该培养基的pH为7.2；

③取营养液作为枯草芽孢杆菌培养基，121度灭菌30分钟，冷却后按5％接种量接种地衣芽孢杆菌种子，维持通风量1∶0.7，发酵温度控制在37度，搅拌转速180r/min，进行发酵培养48h得到高含量发酵培养菌液，经平板活菌计数，所述地衣芽孢杆菌含量为67亿/ml。将制备的液体活菌制剂室温放置1年后，经平板活菌计数为61亿/ml，损失率8.5％。可见按本工艺制备营养液非常适合地衣芽孢杆菌生长繁殖及存活。

实施例4：

所述一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法的具体步骤如下：

①以重量份数计：水产品加工下脚料或深海低值鱼虾下角料40％、麸皮30％、粉碎菜籽粕15％；糖蜜15％按重量比按上述重量比进行混合，加水调节水分百分比至52％，添加上述混合物重量比0.2％氢氧化钠调节pH至7.0，按上述物料每吨加入HB有机物料腐熟剂1kg，混合均匀后进行好氧发酵，好氧发酵具体步骤为，将上述物料混合均匀后堆成高0.8m左右，宽1.2m等腰梯形条剁。当内部温度升至60度以后，每天早上、晚上翻抛一次。维持60度以上发酵5天；

②发酵结束，将堆肥原料加入重量比1∶3倍水进行搅拌浸提2h，经高速胶体磨均质处理后，离心机80目滤网固液分离。得到固形物浓度17％左右略带粘稠的深褐色营养液，该培养基的pH为7.2；

③取营养液作为枯草芽孢杆菌培养基，121度灭菌30分钟，冷却后按5％接种量接种巨大芽孢杆菌种子，维持通风量1∶0.8，发酵温度控制在32度，搅拌转速180r/min，进行发酵培养37h得到高含量发酵培养菌液，经平板活菌计数，所述地衣芽孢杆菌含量为27亿/ml。将制备的液体活菌制剂室温放置1年后，经平板活菌计数为25亿/ml，损失率7.4％。可见按本工艺制备营养液非常适合巨大芽孢杆菌生长繁殖及存活。

实施例5：

所述的一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法的步骤①所述的水产品加工下脚料或深海低值鱼虾下角料清洗后粉碎打成浆，所用饼粕包括括豆粕、菜粕、芝麻粕、花生粕等粉碎20目以上，糖蜜为干物质含量45％以上浓缩糖蜜，有机物料腐熟剂为HB有机物料腐熟剂。

实施例6：

所述一种以农副产品废弃物制备芽孢杆菌发酵培养基的方法步骤④的所述芽孢杆菌包括巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌含量为30-70亿/ml，巨大芽孢杆菌菌含量为10-30亿/g。

实施例7：

本发明的适用范围、性能及田间试验结果：

本发明抓住微生物肥料的核心-水溶有机质和功能性芽孢杆菌，进行技术和工艺创新。本发明制备的水溶有机质营养再加上功能性芽孢杆菌结合在一起使用，可以强化这些生物制剂的作用，可以促进功能性微生物的解钾解磷作用，可以提高功能微生物分泌抗菌物质的能力。经大田试验证实：这是一种实用的、具有微生物肥料功能而用量仅为普通商品有机肥5％左右的含水溶有机质微生物菌剂。这种肥料水溶有机质营养含量丰富、功能性芽孢杆菌含量丰富，用量少，施用方便，具有叶面喷施、土壤施用、种子浸泡等使用方式。适用于一切作物及一切场地，是一种方便施用推广的浓缩型微生物肥料品种。可促进根系发达、茎秆粗壮和增强抗病性。在重茬、土传病害的土地使用，或出现旱、涝、冻等灾害，同比增产30％以上，可明显起到改良土壤、提高化肥利用率、增加产量和提升作物品质的作用。本发明所述的芽孢杆菌发酵培养液为纯天然液体有机营养，营养成分含量高，所述营养液富含多肽、氨基酸、维生素等有机物质，含有丰富的中微量元素，营养成分比例齐全且浓度适当，可以满足芽孢杆菌生长所需，可促进芽孢杆菌快速繁殖，产品菌数浓度高，较一般培养基培养菌数提高40％以上，且延长芽孢杆菌保存期，一年内损耗率低于10％，高于国家规定液体菌剂6个月保存期。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。