一种提高微生物在高无机养分肥中存活率的方法

技术领域

本发明涉及生物肥料领域，特别是涉及一种提高微生物在高无机养分肥中存活率的方法。

背景技术

农产品的产量取决于植物根际与微生物的相互作用，根际条件决定着植物的健康状况和生产力。微生物通过固氮、磷酸盐的溶解或矿化、释放植物生长调节因子、降解土壤中有机质，使土壤环境中各种微量和宏观营养物质保持丰富。微生物菌剂单施无法满足作物的生长需要，农业生产中主要依赖高无机养分化肥，将微生物与高无机养分肥结合，在植物生长过程中提供全面营养的同时防治植物病虫害的发生。微生物与高无机养分肥结合可以促进土壤养分转化，提高肥料养分利用率，减少土壤板结和环境污染问题，作物增产增收，极大提高了农业经济效益。

已有复合肥添加微生物的研究，将微生物菌剂与有机无机复合肥混合造粒，造粒完成后活菌存活率仅在35％-65％之间，且未监测菌株在生产完成后在货架储存期的存活率。当前将微生物添加至高无机养分肥中的技术难以突破，微生物有机无机复合肥中无机养分量含量只能达到15％左右。微生物与有机无机复合肥混合造粒的过程中，机器造粒的高温会造成大量菌株的死亡，在储存过程中无机盐分会形成高渗透压，给微生物带来致命的胁迫。因此，提供一种提高微生物在高无机养分肥中存活率的方法是十分有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高微生物在高无机养分肥中存活率的方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法可以有效提高微生物复合肥中菌株在生产与储存过程中的存活率，解决微生物高无机养分肥的制备和储藏问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种提高微生物在高无机养分肥中存活率的方法，包括以下步骤：

(1)将微生物与保护剂按1-4:1-5质量比混合后，制得微生物菌剂；

(2)将微生物菌剂以0.1-10wt％比例添加至高无机养分肥中，之后经干燥或混合造粒制得微生物复合肥。

进一步地，所述保护剂包括以下重量百分比组分：1-28％植物油、0.5-26％甘油、1-10％山梨醇和1-10％甘露醇，余量为水。

进一步地，所述高无机养分肥包括无机肥、有机肥和载体。

进一步地，所述无机肥在微生物复合肥中重量百分比为35-45％，所述有机肥在微生物复合肥中重量百分比为13-24％，所述载体在微生物复合肥中重量百分比为38-42％。

进一步地，所述干燥条件为20-55℃冷风干燥4-6h。

进一步地，所述微生物包括芽孢杆菌，所述芽孢杆菌以芽孢杆菌菌粉的形式与保护剂混合制得微生物菌剂。

本发明还提供一种利用上述的方法制备得到的微生物复合肥。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提出一种提高微生物在高无机养分肥中存活率的方法，优化了微生物添加至高无机养分肥中的生产方法，将微生物菌剂与高养分无机肥结合，最高可与45％无机养分复合肥混合，实现了高微生物活性高无机养分复合肥的制备。

本发明中的保护剂可以有效提高微生物复合肥中菌株在生产与储存过程中的存活率，一年货架期菌株的存活率在70-91％之间。突破了微生物复合肥的技术瓶颈，将微生物菌剂与高无机养分肥结合的同时保证了菌株的高活性，极大程度上解决微生物复合肥的制备和储藏问题。另外，大田试验结果表明，利用本发明方法制备的微生物复合肥可以有效促进作物生长，显著提高作物产量，减少化肥与农药施用量，降低经济成本，提高经济效益，为发展绿色农业提供技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为辣椒土壤中枯草芽孢杆菌基因拷贝数统计结果；

图2为番茄土壤中枯草芽孢杆菌基因拷贝数统计结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中所用方法若无特殊说明，均为常规方法；所用试剂若无特殊说明，均为普通市售可得。

1材料与方法

1.1试验材料

菌剂：芽孢杆菌类：下述实施例中虽选取枯草芽孢杆菌菌种制备微生物复合肥，但是其余芽孢杆菌生防菌株如：巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等等亦可采用本发明方法获得高存活率的微生物复合肥。

肥料：高无机养分肥：包括无机肥和有机肥，也称为有机无机复合肥(由湖北宜施壮农业科技有限公司提供)；

载体：黄腐酸；

保护剂：植物油、甘油、山梨醇、甘露醇；

1.2培养基的配制

Luria-Bertani液体培养基(细菌培养基)：在950ml去离子水中加入胰蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，氯化钠(NaCl)10g，用玻璃棒搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.2±0.2，用去离子水定容至1L。121℃灭菌20min。

Luria-Bertani固体培养基：成分同Luria-Bertani液体培养基，在其他成分溶解后加入15g-20g琼脂粉。121℃灭菌20min。

发酵罐培养基：豆粕40g/L、玉米粉20g/L、葡萄糖15g/L、磷酸氢二钾3g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、酵母浸粉0.2g/L。

1.3试验设计

1.3.1制备枯草芽孢杆菌菌粉

用固体LB平板活化菌株，然后接种至500ml三角瓶(装液量100ml)中培养16h。按接种量1％接种至50L发酵罐，发酵60h后放入喷雾干燥机中，所得即为枯草芽孢杆菌菌粉。

1.3.1保护剂包裹

称取适量芽孢杆菌菌粉，将菌粉与保护剂按1-4:1-5的质量比例混合，制得微生物菌剂。将微生物菌剂按0.1-10wt％添加量均匀包裹在复合微生物肥料表面，将包裹有微生物菌剂的复合肥放入冷风干燥机中20-55℃干燥4-6h，制成微生物复合肥，或将微生物菌剂与复合肥放入造粒机中混合造粒，制成微生物复合肥。以下实施例中制得的微生物复合肥中活菌数大于等于0.2亿cfu/g。

实施例1

一种微生物复合肥，包括以下重量份组分：微生物菌剂5份、无机肥40份、有机肥13份、载体42份。

所述微生物复合肥制备方法为：

(1)将芽孢杆菌菌粉与保护剂以固液质量比1:1混合均匀，制得微生物菌剂，待用；

所述保护剂包括11wt％植物油、8wt％甘油、8wt％山梨醇、1wt％甘露醇，其余为水。

(2)按照配比将微生物制剂均匀喷涂在有机无机复合肥表面。

(3)将包裹有微生物菌剂的复合肥放入冷风干燥机中40℃干燥5h，制成微生物复合肥。

实施例2

一种微生物复合肥，包括以下重量份组分：微生物菌剂4份、无机肥40份、有机肥15份、载体41份。

所述微生物复合肥制备方法为：

(1)将芽孢杆菌菌粉与保护剂以固液质量比1:2混合均匀，制得微生物菌剂，待用；

所述保护剂包括17wt％植物油、11wt％甘油、1.6wt％山梨醇、7.5wt％甘露醇，其余为水。

(2)按照配比将微生物制剂和有机肥、无机肥和载体放入造粒机中混合造粒，制成微生物复合肥。

实施例3

一种微生物复合肥，包括以下重量份组分：微生物菌剂5份、无机肥38份、有机肥18份、载体39份。

所述微生物复合肥制备方法为：

(1)将芽孢杆菌菌粉与保护剂以固液质量比2:3混合均匀，制得微生物菌剂，待用；

所述保护剂包括28wt％植物油、4wt％甘油、5.3wt％山梨醇、6.8wt％甘露醇，其余为水。

(2)按照配比将微生物制剂均匀喷涂在有机无机复合肥表面。

(3)将包裹有微生物菌剂的复合肥放入冷风干燥机中55℃干燥4h，制成微生物复合肥。

实施例4

一种微生物复合肥，包括以下重量份组分：微生物菌剂4份、无机肥45份、有机肥20份、载体31份。

所述微生物复合肥制备方法为：

(1)将芽孢杆菌菌粉与保护剂以固液质量比1:1混合均匀，制得微生物菌剂，待用；

所述保护剂包括1wt％植物油、26wt％甘油、10wt％山梨醇、1wt％甘露醇，其余为水。

(2)按照配比将微生物制剂均匀喷涂在有机无机复合肥表面。

(3)将包裹有微生物菌剂的复合肥放入冷风干燥机中20℃干燥6h，制成微生物复合肥。

实施例5

一种微生物复合肥，包括以下重量份组分：微生物菌剂10份、无机肥35份、有机肥16份、载体39份。

所述微生物复合肥制备方法为：

(1)将芽孢杆菌菌粉与保护剂以固液质量比4:5混合均匀，制得微生物菌剂，待用；

所述保护剂包括25wt％植物油、0.5wt％甘油、1wt％山梨醇、10wt％甘露醇，其余为水。

(2)按照配比将微生物制剂均匀喷涂在有机无机复合肥表面。

(3)将包裹有微生物菌剂的复合肥放入冷风干燥机中40℃干燥5h，制成微生物复合肥。

实施例6

一种微生物复合肥，包括以下重量份组分：微生物菌剂0.1份、无机肥37.9份、有机肥24份、载体38份。

所述微生物复合肥制备方法为：

(1)将芽孢杆菌菌粉与保护剂以固液质量比1:2混合均匀，制得微生物菌剂，待用；

所述保护剂包括10wt％植物油、11wt％甘油、4.3wt％山梨醇、5.6wt％甘露醇，其余为水。

(2)按照配比将微生物制剂和有机肥、无机肥及载体放入造粒机中混合造粒，制成微生物复合肥。

对比例1

与实施例1的区别在于，微生物菌剂是由每升芽孢杆菌发酵液中加入5g活性炭、5g硅藻土、30g可溶性淀粉、6g甘油制备而成，菌剂中活菌数不小于200亿/毫升。

对比例2

与实施例1的区别在于，所述保护剂缺少山梨醇。

效果例1

分别将实施例1-6制得的微生物复合肥置于常温环境储存一年，之后统计各个复合肥中菌株的存活率，结果见表1：

表1

效果例2大田试验

1材料与方法

1.1试验条件与材料

1.1.1试验条件

辣椒试验地点位于湖北省长阳土家族自治县文家坪村，番茄试验地点位于湖北省长阳土家族自治县将军坳，海拔均1200至1600米，为典型高山气候。

1.1.2试验品种

辣椒:金优

番茄:天喜F1

1.1.3试验肥料品种

40％(16-8-16)复合肥(由湖北宜施壮农业科技有限公司提供)。

1.2试验设计

按实施例4制备方法制备获得表2所述各处理组肥料。

试验时间为2021年5月至2021年10月，5月4日施肥，5月20日定植。设5个处理，两块试验地分别种植辣椒与番茄，共15小区，每个小区面积为60～70m

表2试验处理

1.3样品采集与测定

在7月12日，8月9日，9月12日，10月15日分别用五点取样法在各试验区采集0～20cm的耕层土壤样品，放置-80℃保存，提取DNA溶液。选取枯草芽孢杆菌特异性引物gyrB(参考Xie S,Yu H,Wang Q,et al文献)进行qPCR定量。统计土壤中枯草芽孢杆菌基因拷贝数。

1.4结果与分析

1.4.1各处理产物产量

表3辣椒产量、净利润

表4番茄产量、净利润

表3与表4表明本发明保护剂包裹的微生物有机无机复合肥可以有效促进作物生长，显著提高作物产量，减少化肥与农药施用量，发展绿色农业，降低经济成本，提高经济效益。

1.4.2土壤中枯草芽孢杆菌活菌数

根据图1各处理辣椒土壤中枯草芽孢杆菌基因拷贝数可知，本发明的保护剂可以有效提高菌株在施入土壤后的存活率，添加有保护剂处理的C-FBS-2可以将微生物菌剂在三个月前维持在一个数量级，C-FBS-1处理中未添加保护剂包裹微生物菌剂，菌数在60d与90d时连续下降，证明本发明产品与其他产品相比大大提高了菌株在土壤中的存活率。

根据图2各处理番茄土壤中枯草芽孢杆菌基因拷贝数结合图1可知，在两种作物中本发明的保护剂均可提高微生物菌剂在施入土壤中后菌株有效活菌数。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。