二苯硫醚化合物、抗菌药物及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及抗菌领域，特别是涉及一种二苯硫醚化合物、抗菌药物及制备方法与应用。

背景技术

近年来，由于对抗菌药物的广泛使用和误用，导致抗菌药物的耐药性急剧增加，基本上所有的抗菌药物都已出现细菌耐药现象，已对21世纪的全球公共卫生安全构成了严重威胁。抗菌药物的耐药性一般会延长病人的住院时间并且增加医疗费用，让越来越多的严重感染病，如结核病、脑膜炎、肺炎和败血症等变得更加难以治疗，甚至面临无药可治的局面，导致死亡率急剧上升，给全球医疗体系带来严重的负担。据估计，每年有70万名患者因耐药性细菌感染而死亡。大多数批准上市的抗菌药物仍然基于传统的抗菌分子骨架，容易导致交叉耐药，并且传统的抗菌药物的作用靶点单一，缺乏新型作用机制，容易产生耐药性。因此，设计开发一种具有强抗菌活性、毒性低、作用机制新颖、不易产生耐药性的基于新分子实体的抗菌药物就显得极其重要。

发明内容

基于此，本发明提供了一种二苯硫醚化合物，其具有优异的抗菌功效，可有效避免细菌耐药性的产生，高效低毒。

本发明通过如下技术方案实现。

一种二苯硫醚化合物，其结构如通式(1)所示：

其中：

R

L

W

R

R

在其中一个实施例中，R

在其中一个实施例中，其结构如通式(2-1)或(2-2)所示：

在其中一个实施例中，其结构如通式(3-1)～(3-4)任一种所示：

在其中一个实施例中，R

在其中一个实施例中，R

在其中一个实施例中，所述二苯硫醚化合物选自如下结构：

本发明还提供一种如上所述的二苯硫醚化合物的制备方法，包括如下步骤：

将化合物

将所述中间体A进行取代反应，制备所述二苯硫醚化合物。

本发明还提供如上所述的二苯硫醚化合物及其药学上可接受的盐在制备抗菌药物中的应用。

本发明还提供一种抗菌药物，其组分包括如上所述的二苯硫醚化合物。

与现有技术相比较，本发明的二苯硫醚化合物具有如下有益效果：

本发明所述的二苯硫醚化合物引入碱性阳离子基团，使其可通过静电相互作用增强与带负电荷的细菌细胞膜之间的相互作用，同时二苯硫醚化合物中的烷烃链和苯环作为疏水模块可以插入细菌细胞膜的磷脂双层中，破坏细菌细胞膜的完整性，导致细菌胞内容物的泄漏使细菌死亡。二苯硫醚化合物中的疏水模块和阳离子基团使得化合物靶向细菌膜，而细菌膜具有多种组分，包含多种靶点，细菌若要产生耐药性，需要同时完成多重突变，最终有利于有效克服细菌耐药性的产生。此外，本发明所述的二苯硫醚化合物还可以避免和传统抗菌分子骨架产生交叉耐药现象。

进一步地，本发明所述的二苯硫醚化合物高效低毒，所需原料廉价易得，利于工业化生产。

附图说明

图1为本发明提供的化合物的杀菌性能；其中，横坐标代表时间，纵坐标代表细菌数量；

图2为本发明提供的化合物对细菌细胞膜的作用机制；其中，横坐标代表时间，纵坐标代表荧光强度；

图3为本发明提供的化合物和万古霉素分别对革兰氏阳性菌的体内抗菌活性；其中，横坐标从左至右依次代表阴性对照、0.5％的化合物TO20与5％的万古霉素，纵坐标代表细菌数量。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本发明所述基团和化合物中所涉及的元素碳、氢、氧、硫、氮或卤素均包括它们的同位素情况，及本发明所述基团和化合物中所涉及的元素碳、氢、氧、硫或氮任选进一步被一个或多个它们对应的同位素所替代，其中碳的同位素包括

“酯基”是指包含-C(O)O-X结构的基团，其中“X”是烷基；酯基的非限制性类型包括：-C(O)OCH

“酰胺基”是指包含-C(O)N(X)

术语“烷基”是指包含伯(正)碳原子、或仲碳原子、或叔碳原子、或季碳原子、或其组合的饱和烃。包含该术语的短语，例如，“C

术语“环烷基”是指包含环碳原子的非芳香族烃，可以为单环烷基、或螺环烷基、或桥环烷基。包含该术语的短语，例如，“C

术语“烷氧基”是指具有-O-烷基的基团，即如上所定义的烷基经由氧原子连接至母核结构。包含该术语的短语，例如，“C

“杂烷基”是指在烷基的基础上至少一个碳原子被非碳原子所替代，非碳原子可以为N原子、O原子、S原子等。例如，如果烷基中连接至母核结构的碳原子被非碳原子代替，则所得到的杂烷基分别是烷氧基(例如，-OCH

“氨基”是指氨的衍生物，具有式-N(X)

本发明提供了一种二苯硫醚化合物，其结构如通式(1)所示：

其中：

R

L

W

R

R

在一个具体的示例中，R

在一个具体的示例中，其结构如通式(2-1)或(2-2)所示：

在一个具体的示例中，L

在一个具体的示例中，其结构如通式(3-1)～(3-4)任一种所示：

在一个具体的示例中，R

在一个具体的示例中，R

在一个具体的示例中，二苯硫醚化合物选自如下结构：

可以理解地，氨基酸与氨基酸的连接位点默认是酰胺键。

在一个具体的示例中，二苯硫醚化合物选自如下结构：

本发明还提供一种上述二苯硫醚化合物的制备方法，包括如下步骤：

将化合物

将中间体A进行取代反应，制备二苯硫醚化合物。

本发明还提供上述二苯硫醚化合物及其药学上可接受的盐在制备抗菌药物中的应用。

本发明还提供一种抗菌药物，其组分包括上述二苯硫醚化合物。

以下结合具体实施例对本发明的二苯硫醚化合物及其制备方法做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特别说明，均为市售产品。

实施例1

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO02及其制备方法，合成路线如下：

中间体TO01：

将2,2′-硫代双(4-特辛基苯酚)(400.00mg,0.90mmol)溶于DMF(6mL)中，然后加入碳酸钾(749mg,5.42mmol)，碘化钾(300.00mg,1.81mmol)以及1,4-二溴丁烷(862μL,7.23mmol)。将混合物在室温下搅拌5小时。反应完成后，将反应混合物用乙酸乙酯稀释并用水萃取两次。将上层有机相在真空条件下浓缩。粗产物通过硅胶色谱法纯化，得到化合物TO01为淡黄色油状物(446.48mg,69％)。

产物TO02：

将化合物TO01(80.00mg,0.11mmol)溶于DMF(6mL)中，然后加入二乙胺(500μL,4.83mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用正丁醇稀释并用水萃取两次。将上层有机相在真空条件下浓缩。所得粗产物通过RP-HPLC纯化，获得化合物TO02为淡黄色油状物(31.60mg,40％)。

实施例2

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO04及其制备方法，合成路线如下：

产物TO04：

将化合物TO01(80.00mg,0.11mmol)溶于DMF(6mL)中，然后加入3mL氨水。将混合物在65℃下反应过夜。反应完成后，直接在真空条件下浓缩的到中间体。将所得中间体溶于DMF(6mL)中，然后加入1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(160.37mg,1.09mmol)和DIPEA(190μL,1.09mmol)，将混合物在常温下反应搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用正丁醇稀释并用水萃取两次。将上层有机相在真空条件下浓缩。所得粗产物通过RP-HPLC纯化，获得化合物TO04为淡黄色粉末(3.40mg,4％)。

实施例3

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO06及其制备方法，合成路线如下：

中间体TO05：

以2,2′-硫代双(4-特辛基苯酚)(400.00mg,0.90mmol)，碳酸钾(749mg,5.42mmol)，碘化钾(300.00mg,1.81mmol)以及溴代乙酸乙酯(800μL,7.23mmol)为起始原料，根据合成化合物TO01的方法，制备得到化合物TO05为淡黄色油状物(452.20mg,81％)。

产物TO06：

将化合物TO05(130.00mg,0.21mmol)溶于四氢呋喃(4mL)中，然后将氢氧化锂(25.31mg,1.06mmol)溶于水(2mL)。将它们混合后，在室温下搅拌2小时。反应完成后，加入冰乙酸(1.5mL)于常温搅拌2分钟，然后将混合物用正丁醇稀释并用水萃取一次。将上层有机相在真空条件下浓缩。将所得粗产物溶于DMF(6mL)，然后加入H-Arg-OMe·2HCl(243.03mg,0.93mmol)，HATU(265.39mg,0.70mmol)，EDC·HCl(133.80mg,0.70mmol)，HOBT(106.89mg,0.70mmol)和DIPEA(405μL,2.33mmol)。将混合物在常温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用正丁醇稀释并用水萃取两次。将上层有机相在真空条件下浓缩得到粗产物。所得粗产物通过RP-HPLC纯化，获得化合物TO06为淡黄色油状物(84.50mg,40％)。

实施例4

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO07及其制备方法，合成路线如下：

产物TO07：

以化合物TO05(85.00mg,0.14mmol)，H-Arg-Arg-NH

实施例5

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO10及其制备方法，合成路线如下：

产物TO10：

以化合物TO01(80.00mg,0.11mmol)，二甲胺(500μL,9.87mmol)为原始原料，根据合成化合物TO02的方法，制备得到化合物TO10为淡黄色油状物(37.9mg,52％)。

实施例6

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO11及其制备方法，合成路线如下：

产物TO11：

以化合物TO01(80.00mg,0.11mmol)，二丙胺(500μL,3.65mmol)为原始原料，根据合成化合物TO02的方法，制备得到化合物TO11为淡黄色油状物(24.30mg,28％)。

实施例7

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO12及其制备方法，合成路线如下：

产物TO12：

以化合物TO01(80.00mg,0.11mmol)，二丁胺(500μL,2.97mmol)为原始原料，根据合成化合物TO02的方法，制备得到化合物TO12为淡黄色油状物(31.6mg,35％)。

实施例8

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO13及其制备方法，合成路线如下：

产物TO13：

以化合物TO01(80.00mg,0.11mmol)，乙胺(500μL,8.98mmol)为原始原料，根据合成化合物TO02的方法，制备得到化合物TO13为淡黄色油状物(47.7mg,66％)。

实施例9

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO14及其制备方法，合成路线如下：

产物TO14：

以化合物TO01(80.00mg,0.11mmol)，正丁胺(500μL,5.06mmol)为原始原料，根据合成化合物TO02的方法，制备得到化合物TO14为淡黄色油状物(36.5mg,46％)。

实施例10

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO15及其制备方法，合成路线如下：

产物TO15：

以化合物TO01(80.00mg,0.11mmol)，己胺(500μL,3.78mmol)为原始原料，根据合成化合物TO02的方法，制备得到化合物TO15为淡黄色油状物(48.7mg,57％)。

实施例11

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO16及其制备方法，合成路线如下：

产物TO16：

以化合物TO01(80.00mg,0.11mmol)，哌啶(500μL,5.05mmol)为原始原料，根据合成化合物TO02的方法，制备得到化合物TO16为淡黄色油状物(63.6mg,78％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.31(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),7.03(d,J＝2.4Hz,2H),6.99(s,1H),6.97(s,1H),4.08(t,J＝5.5Hz,4H),3.20–2.93(m,12H),1.92–1.77(m,16H),1.64(s,8H),1.24(s,12H),0.69(s,18H).13C NMR(100MHz,CD3OD)δ156.11,144.40,130.84,127.51,122.99,112.70,69.32,58.09,57.65,54.06,38.99,33.17,32.44,32.33,27.47,24.29,22.91,22.53.HRMS(ESI+):calculated for C46H76N2O2S[M+H]+721.5700,found 721.5688.

实施例12

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO17及其制备方法，合成路线如下：

产物TO17：

以化合物TO01(80.00mg,0.11mmol)，N-甲基哌嗪(500μL,4.51mmol)为原始原料，根据合成化合物TO02的方法，制备得到化合物TO17为淡黄色油状物(53.6mg,63％)。

实施例13

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO20及其制备方法，合成路线如下：

产物TO20：

以化合物TO05(160mg,0.26mmol)，H-Arg-Arg-OMe·3HCl(394.49mg,0.87mmol)，HATU(326.63mg,0.86mmol)，HOBT(131.55mg,0.86mmol)，EDC·HCl(164.68mg,0.86mmol)和DIPEA(598μL,3.44mmol)为起始原料，根据合成化合物TO06的方法，制备得到化合物TO20，为淡黄色油状物(89.5mg,26％)。

实施例14

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO22及其制备方法，合成路线如下：

产物TO22：

以化合物TO06(30.00mg,0.03mmol)，H-Arg-Arg-OMe·3HCl(47.44mg,0.10mmol)，HATU(39.28mg,0.10mmol)，HOBT(15.82mg,0.10mmol)，EDC·HCl(19.81mg,0.10mmol)和DIPEA(60μL,0.34mmol)为起始原料，根据合成化合物TO06的方法，制备得到化合物TO22为淡黄色油状物(12.8mg,24％)。

实施例15

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO23及其制备方法，合成路线如下：

产物TO23：

以化合物TO01(80.00mg,0.11mmol)，硫代吗啉(120μL,1.12mmol)为原始原料，根据合成化合物TO02的方法，制备得到化合物TO23为淡黄色油状物(57.1mg,67％)。

实施例16

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO26及其制备方法，合成路线如下：

中间体TO24：

以2,2′-硫代双(4-特辛基苯酚)(100.00mg,0.22mmol)，甲醇钠(48.81mg,0.90mmol)以及溴代乙酸乙酯(50μL,0.45mmol)为起始原料，根据合成化合物TO01的方法，制备得到化合物TO24为淡黄色油状物(52.3mg,43％)。

产物TO26：

以化合物TO24(100.00mg,0.19mmol)，H-Arg-NH

实施例17

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO27及其制备方法，合成路线如下：

产物TO27：

以化合物TO05(85.00mg,0.14mmol)，H-Arg-NH

实施例18

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO29及其制备方法，合成路线如下：

产物TO29：

以化合物TO05(260.00mg,0.47mmol)，H-Lys(BOC)-OMe

实施例19

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO30及其制备方法，合成路线如下：

产物TO30：

以化合物TO24(50.00mg,0.09mmol))，H-Arg-OMe

实施例20

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO39及其制备方法，合成路线如下：

中间体TO37：

以2,2'-硫代双(4-甲基-6-特丁基苯酚)(100.00mg,0.28mmol)，碳酸钾(149.00mg,1.08mmol)，碘化钾(59.00mg,0.36mmol)以及溴代乙酸乙酯(247μL,2.23mmol)为起始原料，根据合成化合物TO01的方法，制备得到化合物TO37，为白色粉末(49.7mg,33％)。

产物TO39：

以化合物TO37(130.00mg,0.24mmol)，H-Arg-OMe

实施例21

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO43及其制备方法，合成路线如下：

产物TO43：

以化合物TO37(50.00mg,0.09mmol)，H-Arg-Arg-OMe

实施例22

本实施例提供一种二苯硫醚化合物TO44及其制备方法，合成路线如下：

产物TO44：

以化合物TO37(50.00mg,0.09mmol)，H-Arg-NH

生物实验评估方法

1、抗菌活性测定

评估合成的二苯硫醚衍生物对一系列革兰氏阳性菌(含MRSA)和革兰氏阴性菌(含大肠埃希菌)的体外抗菌活性。体外抗菌活性用最低抑菌浓度(MIC，抑制细菌生长所需化合物的最低浓度)来表征。根据临床实验室标准化协会(CLSI)制定的标准方法，通过微量肉汤稀释法测定化合物的抗细菌活性。所有受试细菌首先在MH琼脂(MHA)平板上于37℃中培养过夜，然后调整其浓度至大约1×10

2、溶血活性测定

用HC

3、时间杀菌曲线

金黄色葡萄球菌ATCC29213首先在MHA平板上于37℃中培养过夜，然后用PBS调整其浓度使得OD 600为0.1，然后用MHB稀释100倍。将样品首先溶解在DMSO/H

4、抗菌作用机制研究(SYTOX Green试验)

金黄色葡萄球菌ATCC29213首先在MHA平板上生长以达到指数期。然后将这些细菌细胞用PBS缓冲液洗涤三次并重新悬浮于PBS中，调节细菌悬浮液浓度，使得OD600值为0.2。将细菌悬浮液与0.3μM SYTOX Green染料在黑暗的条件下混合。各种浓度的待测化合物(1×、2×和4×MIC)溶于DMSO中。使用酶标仪(激发波长：504nm，发射波长：523nm)监测SYTOXGreen染料的荧光强度的变化情况。待荧光信号稳定，立即将溶于DMSO的测试样品加入到SYTOX Green处理的细菌悬浮液中，并开始记录荧光强度的变化。背景组经PBS处理，阴性对照组经DMSO和PBS处理，阳性对照经Triton X-100处理。

5、动物体内抗菌功效评估

动物体内抗菌功效评估实验已获得华南农业大学实验动物中心的批准，并按照中国卫生部的政策进行，使用6至8周龄的C57BL6小鼠。金黄色葡萄球菌ATCC29213在MHA平板上于37℃下培养过夜后，然后调整其浓度使得OD600为0.6，留待小鼠角膜感染使用。在实验中筛选角膜清晰度良好，在感染前5天腹腔注射环磷酰胺(100mg/kg)3次来制备免疫抑制的小鼠模型。将小鼠麻醉后使用无菌的小型刀片对小鼠右眼角膜划痕，确保右眼表面基质没有破裂，并且左眼保持不变。将细菌悬浮液(15μL)局部应用于损伤的角膜表面。感染一天后，将这些小鼠随机分为三组(每组5只小鼠)，并开始局部应用抗菌化合物(5％万古霉素，0.5％TO20或5％葡萄糖)溶液四次，持续应用三天。最终将小鼠安乐死，解剖感染的角膜，将其用PBS稀释，并通过MHA平板计数法以定量活细菌数量。P值通过GraphPad Prism8.0软件计算获得，P≤0.05被视为具备统计学显著性。

抗菌和溶血活性结果如表1所示。其中化合物TO06、TO20、TO39、TO43对革兰氏阳性菌表现出非常优异的抗菌活性，MIC值为0.78-3.125μg/mL；同时对兔红细胞展示出非常低的溶血活性，HC

表1基于二苯硫醚衍生物的体外抗菌和溶血活性(μg/mL)

时间杀菌动力学研究结果如图1所示，化合物TO20对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌ATCC29213表现出快速的杀菌性能，在4×和8×MIC浓度下在0.5小时内可以使细菌数量分别减少3.22log和4.18log。快速地杀菌性能可以有效缩短治疗时间，并降低细菌耐药性产生的概率。

化合物TO20表现出的快速杀菌作用可能是基于阳离子两亲性的TO20与带负电荷的细菌细胞膜之间的静电相互作用所导致的膜靶向的作用模式。我们使用SYTOX Green法研究化合物TO20对细菌细胞膜的作用情况。抗菌机制初步研究结果如图2所示，当用TO20处理金黄色葡萄球菌ATCC29213时，发现混合液中的SYTOX Green的荧光强度明显增强，并呈浓度依赖的方式。表明化合物TO20能够通过增加革兰氏阳性菌细胞膜的通透性，从而破坏细菌膜的完整性，并最终导致细菌细胞的死亡。

化合物TO20对革兰氏阳性菌表现出优异的体外抗菌活性，很低的溶血活性和细胞毒性，具备较高的膜选择性，并能快速杀死细菌。因此，我们进一步评估其在动物体内的抗菌活性。在本研究中，通过腹腔注射环磷酰胺来制备免疫抑制的小鼠模型，然后用金黄色葡萄球菌ATCC29213感染小鼠角膜。感染后两天，将小鼠随机分为三组(每组五只小鼠)，每组小鼠分别用0.5％的化合物TO20、5％的万古霉素(阳性对照)或5％的葡萄糖(阴性对照)进行局部处理。每天对小鼠进行4次治疗，共3天。如图3所示，化合物TO20和万古霉素分别使感染的角膜中的金黄色葡萄球菌数量减少5.47log(p＜0.05)和5.77log(p＜0.05)。化合物TO20的浓度虽然比万古霉素低十倍，但其显示出可与万古霉素相互比拟的体内抗菌活性。这些结果表明，化合物TO20能够治愈由金黄色葡萄球菌引起的小鼠角膜感染。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。