一种制备褐藻提取物的方法、提取液及应用

技术领域

本发明涉及农用肥料领域，具体地涉及公开了一种制备褐藻提取物的方法、提取液及应用。

背景技术

褐藻提取物已广泛应用于国内外的肥料、饲料等行业，其生产制备技术以化学法、物理法和生物酶法等为主。其中化学法高温高压酸碱提取是目前生产中主要的技术形式，虽然化学法对海藻中活性成分有一定破坏作用，其提取率也低于生物酶法等其他技术，但其成本较低。物理法主要包括机械破碎、低温爆破，该方法可很好的保留海藻中天然活性成分，环保无污染，但设备投入较高，仅有南非Kelpak等少数公司采用此方法。生物酶解技术近年来是业界的热点，专利及论文披露使用褐藻胶裂解酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等可有效降解褐藻获得褐藻提取物，但目前商品化的褐藻胶裂解酶或褐藻降解酶并不多见且价格昂贵，导致生物酶法制备褐藻提取物成本难于被实际生产接受。

等离子体技术是一种较新颖的技术，通过等离子体放电，会产生大量的活性氢，与材料表面接触可赋予材料表面各种优异性能，而不改变基体材料本身的性质，在众多材料表面加工处理工艺中得到广泛应用，诸如汽车制造、数码打印、半导体技术、医药与化妆品、纺织品等等。等离子体技术使生产制造过程省去了许多昂贵、复杂且对环境有害的化学处理步骤，更加高效以及环保。近年来，等离子体技术应用范围进一步扩大，发现其可促进聚合物分子的裂解和状态改变，并进一步赋予其新的生物活性，如抗氧化、抗菌等特性，方法简单，且绿色环保无污染，是适合大规模推广的技术方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种制备褐藻提取物的方法、提取液及应用，所述方法通过等离子体技术和生物酶解的结合，降低褐藻提取的生物酶使用量，降低酶解成本，更有利于生产推广，彻底替代传统强酸强碱化学法，同时将获得的褐藻提取液直接应用到水培生菜的培育过程，有效提高了水培生菜的品质，并可有效缓解低温胁迫对生菜的影响。

本发明所采用的的技术方案是：

一种制备褐藻提取物的方法，所述方法步骤如下：

(1)原料的预处理：将干海藻粉碎为40-80目的粒度，加入6-12倍重量水；

(2)低温等离子体处理：使用输出电压为0-2KV的直流脉冲电源，占空比5-50％，频率50-300Hz脉冲波；将反应体系置于电极下方，电极间距10-30mm，电极与反应体系液面间距2-10mm，处理时间5-30分钟；

(3)酶解处理：调节步骤(2)处理后的反应体系pH6.0-7.5，温度40-45℃，加入酶活为10-20万U/g的纤维素酶0.5-1％(质量比)和20-30万U/g的褐藻胶裂解酶0.01％-0.05％(质量比)，保温搅拌条件下酶解3-5h；

(4)分离获得海藻提取液：通过离心或过滤等方式进行固液分离，获得固形物含量7-12％的海藻提取液；

本发明还提供所述方法获得的褐藻提取液。

本发明还提供所述褐藻提取液的应用，应用方法包括：

使用稀释200-1000倍的褐藻提取液，通过叶面喷施用于生菜培养，可显著促进生菜根系生长，提高生菜品质，其硝酸盐含量的降低，同时，能有效缓解低温胁迫对生菜生长发育的影响。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明方法通过等离子体处理的辅助，有效降低褐藻降解的酶用量以及酶解时间而获得高提取率的褐藻提取液。进一步通过叶面喷施应用在生菜培养上，可有效提高生菜的品质和抗逆性，生菜中硝酸盐含量显著降低，抵抗低温胁迫效果明显。

附图说明

图1不同处理组生菜中硝酸盐含量的变化。

图2不同处理组生菜低温胁迫后超氧化物歧化酶含量的变化

具体实施方式

下面结合实施例和附图来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例中纤维素酶来自夏盛(北京)生物科技开发有限公司，褐藻胶裂解酶为本实验室自主开发(见专利202010170519.X)。

实施例1

(1)将干海带粉碎为50目左右10g，加入其重量8倍的自来水，混合均匀；

(2)低温等离子体处理：使用输出电压为2KV的直流脉冲电压，占空比30％，频率200Hz，将电极置于反应体系上方，2个电极间距20mm，电极与反应体系液面间距2mm，处理30min。

(3)酶解处理：用氢氧化钾调节体系pH为7.0，温度40℃，加入酶活20万U/g的纤维素酶0.7％，30万U/g褐藻胶裂解酶0.01％，保温搅拌条件下酶解3h。

(4)离心获得海藻提取液：离心机4000rpm离心5min，除去未酶解的海藻渣，获得固定物含量约为10％的上清液即海藻提取液。

另外：与上述相同条件下单纯酶解：以上50目的干海带加入重量8倍的自来水，混合均匀，40℃预热并溶胀30min代替低温等离子体处理过程，在pH7.0，温度40℃下，加入酶活20万U/g的纤维素酶0.7％，30万U/g褐藻胶裂解酶0.01％，保温搅拌条件下酶解3h，4000rpm离心5min分离制备海带提取液。

在实验中发现，单纯用等离子体处理高黏度的海藻浆，短时间内(30min-60min)只能部分降低体系黏度，无法彻底降解海带，长时间1-2h及以上的处理会引起海带成分过度氧化，颜色变为黑色，失去了海带本身的特色和活性。

实施例2

(1)将干海带粉碎为80目左右10g，加入其重量10倍的自来水，混合均匀；

(2)低温等离子体处理：使用输出电压为1KV的直流脉冲电压，占空比20％，频率300Hz，将电极置于反应体系上方，2个电极间距15mm，电极与反应体系液面间距3mm，处理20min。

(3)酶解处理：用氢氧化钾调节体系pH为6.5，温度45℃，加入酶活20万U/g的纤维素酶0.5％，30万U/g褐藻胶裂解酶0.02％，保温搅拌条件下酶解4h。

(4)离心获得海藻提取液：离心机5000rpm离心3min，除去未酶解的海藻渣，获得固定物含量约为8％的上清液即海藻提取液。

另外：与上述相同条件下单纯酶解：以上80目的干海带加入重量10倍的自来水，混合均匀，45℃预热并溶胀30min代替低温等离子体处理过程，在pH6.5，温度45℃下，加入酶活20万U/g的纤维素酶0.5％，30万U/g褐藻胶裂解酶0.02％，保温搅拌条件下酶解4h，5000rpm离心3min分离制备海带提取液。

实施例3

(1)将干海带粉碎为40目左右10g，加入其重量12倍的自来水，混合均匀；

(2)低温等离子体处理：使用输出电压为1.5KV的直流脉冲电压，占空比15％，频率150Hz，将电极置于反应体系上方，2个电极间距10mm，电极与反应体系液面间距1mm，处理25min。

(3)酶解处理：用氢氧化钾调节体系pH为7.5，温度42℃，加入酶活10万U/g的纤维素酶0.7％，20万U/g褐藻胶裂解酶0.02％，保温搅拌条件下酶解4h。

(4)离心获得海藻提取液：离心机4000rpm离心3min，除去未酶解的海藻渣，获得固定物含量约为7％的上清液即海藻提取液。

与上述相同条件下单纯酶解：以上40目的干海带加入重量12倍的自来水，混合均匀，42℃预热并溶胀25min代替低温等离子体处理过程，在pH7.5，温度42℃下，加入酶活10万U/g的纤维素酶0.7％，20万U/g褐藻胶裂解酶0.02％，保温搅拌条件下酶解4h，4000rpm离心3min分离制备海带提取液。

实施例4

单纯酶解制备海带提取液：粉碎为50目的干海带10g加入到重量10倍的自来水中，KOH调节pH为7.0，45℃预热溶胀2h，加入20万U/g的纤维素酶2.0％，30万U/g褐藻胶裂解酶0.1％，保温搅拌条件下酶解10h，5000rpm离心3min获得海带提取液。

实施例5海藻提取液在水培生菜上的应用

将实施例3和4中的海藻提取液分别稀释300倍、500倍、800倍，通过叶面喷施用于水培生菜。定植当天施用1次，以后每隔10天施用1次，共施用4次，喷施量以叶面下滴为宜。以清水为对照组，所有处理培养至采收期(定植35天)进行硝酸盐含量及货架期的检测。

施用海藻提取液的生菜定植2周后，人工降温至5℃保持12h，然后恢复18℃正常培育并检测其中超氧化物歧化酶的含量。

生菜采收后硝酸盐含量的检测结果表明，海藻提取液的施用都可有效地降低生菜中硝酸盐含量，而等离子体联合酶解处理组各个稀释度的效果，均比单纯酶解组的效果好，联合处理组稀释500倍的海藻提取液施用组，生菜中硝酸盐的含量比对照组下降了约41.6％，有效提高了生菜的食用安全性。

生菜在遭受冷胁迫后对其超氧化物歧化酶SOD的检测结果表明，施用海藻提取液的生菜中SOD的含量明显高于对照组，且施用等离子体联合酶解处理工艺的海藻提取液的生菜SOD含量高于相应的单纯酶解海藻提取液，两种工艺海藻提取液均在稀释度500倍时获得最好的SOD促进效果，而离子体联合酶解工艺的提取液在高800倍稀释度时仍能显著促进SOD的提高，有效缓解冷胁迫，增强植物抗逆性。

表1等离子体联合酶解处理海带及单纯酶解处理海带的体系对比

注：实施例1、2、3中单纯酶解体系因粘度过大，均无法顺利分离上清与残渣。