浮萍硝酸盐转运蛋白基因SpNRT1.1及其编码蛋白在调控植物开花和生物量中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及浮萍硝酸盐转运蛋白基因SpNRT1.1及其编码蛋白的应用，尤其涉及浮萍硝酸盐转运蛋白基因SpNRT1.1及其编码蛋白在调控植物开花时间和生物量(提高植株产量)中的应用。

背景技术

氮素是植物体中最广泛存在的矿质元素，也是氨基酸、核酸、叶绿素等生物分子的重要组成元素。通常氮素也是植物生长的限制营养因子，因此对植物外源施加化肥主要是氮肥。植物通过氮素同化作用将氮素固定在植物体形成氨基酸、核酸、叶绿素等生物分子，因此植物是地球氮循环系统中氮素同化固定的重要一环。工业革命以后，随着氮肥的推广使农作物的产量有了明显的提高。但是，化肥的使用量增长速度明显快于作物产量的增长速度。这主要是因为植物有限的氮素同化效率，植物并不能固定所有的氮肥。这不仅导致了化肥的浪费，同时过量使用的化肥也通过地表径流导致水体富营养化；另一方面也通过反硝化作用释放温室气体二氧化氮、形成酸雨等造成环境污染。要解决这一问题，在同时保证作物不断增产的前提下减少化肥使用降低污染，一个有效的解决方案是提高植物的氮素同化效率，适度施用化肥。

自然界中存在大量的氮，主要以氮气形式存在，不能被植物直接利用。植物主要通过根系从土壤中吸收无机氮，包括硝态氮和铵态氮，最普遍的是硝态氮。硝酸根转运蛋白通过主动运输方式将土壤中的硝酸根转运至植物细胞内，细胞内的硝酸根还原酶将硝酸根还原为亚硝酸根，这时亚硝酸还原酶再将其还原为铵根离子。铵根离子进入谷氨酸-谷氨酰胺循环，在谷氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶的作用下，利用α酮戊二酸与铵根离子产生谷氨酸，再通过转氨酶的作用合成植物体内的其他氨基酸。

植物根系是植物吸收矿质营养的主要器官。有研究表明，侧根数目和植物氮素吸收效率密切相关。土壤中的氮素进入植物体内首先是通过根系的硝酸根转运蛋白(NRT)运输。植物中有两类NRT蛋白，NRT1和NRT2，拟南芥中共有53个NRT1类，7个NRT2类。NRT2类为高亲和性氮硝酸根转运蛋白，NRT1类为低亲和性硝酸根转运蛋白(其中AtNRT1.1为双亲和性)，这些NRT蛋白在拟南芥的不同组织部位表达量不同。起到主要硝酸根转运作用的NRT1.1和NRT2.1等多在植物根系中表达。因此研究调控植物中NRT蛋白的功能提高植物氮素吸收效率调控植物营养生长和生物量具有重要意义。

发明内容

本发明提供了浮萍硝酸盐转运蛋白基因SpNRT1.1及其编码蛋白在调控植物开花和生物量中的应用。

本发明首先保护硝酸盐转运蛋白SpNRT1.1的应用，包括下列的一种或几种：

S1、SpNRT1.1基因及其编码蛋白调控植物开花时间；

S2、SpNRT1.1基因及其编码蛋白调控植物生物量；

S3、利用SpNRT1.1基因及其编码蛋白培育晚花植物；

S4、利用SpNRT1.1基因及其编码蛋白培育高生物量植物；

所述应用中浮萍硝酸盐转运蛋白SPNRT1.1的氨基酸序列为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO.3所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO.3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物开花时间推迟和生物量提高相关的蛋白质；

其次本发明还保护硝酸盐转运蛋白SpNRT1.1的编码基因SpNRT1.1的应用，包括下列的一种或几种：

S1、SpNRT1.1基因及其编码蛋白调控植物开花时间；

S2、SpNRT1.1基因及其编码蛋白调控植物生物量；

S3、利用SpNRT1.1基因及其编码蛋白培育晚花植物；

S4、利用SpNRT1.1基因及其编码蛋白培育高生物量植物；

所述应用中浮萍硝酸盐转运蛋白SpNRT1.1的编码基因SpNRT1.1的核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：

b1、核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

b2、核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

b3、编码区是SEQ ID NO：1或/和SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

b4、与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码前述NRT1.1蛋白的DNA分子；

b5、在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码前述SpNRT1.1蛋白的DNA分子；

本发明还保护一种构建转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入浮萍硝酸盐转运蛋白SpNRT1.1的编码蛋白基因序列，使硝酸盐转运蛋白SpNRT1.1在受体植物中表达，得到转基因植物。转基因植物和受体植物相比，开花时间推迟或生物量增加。

其中，所述受体植物包括拟南芥。

浮萍硝酸盐转运蛋白SpNRT1.1的编码蛋白基因序列为SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2。

所述浮萍硝酸盐转运蛋白SpNRT1.1的序列如SEQ ID NO.3所示。

所得转基因植物的开花时间推迟或植物生物量增加。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)浮萍硝酸盐转运蛋白SpNRT1.1在模式植物拟南芥中过表达时，导致了在开花时间明显晚于对照组，植株生物量相较于对照组提高约60％；表明了浮萍硝酸盐转运蛋白SpNRT1.1及其编码基因在调控植物开花时间和产量方面应用潜能。

2)本发明为培育晚花和高产植物提供一种新途径。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为NRT家族氨基酸序列系统进化树；

图2为SpNRT1.1-101在烟草中瞬时表达情况；

图3为转基因T3代株系PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳；

图4为转基因T3代株系和对照组Col-0一月大植株生长状态和莲座叶数目统计、生物量测量结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：SpNRT1.1基因的获得

SpNRT1.1基因的获得步骤包括

1.浮萍SpNRT1.1基因序列的获得，从NCBI、Tair、Enzyme等网站下载已报道的水稻、玉米、拟南芥NRT家族氨基酸序列。对浮萍所有氨基酸序列建立本地Blast数据库，利用Gene Edit软件本地Blast功能，检索所有浮萍中的NRT蛋白。对所获得的水稻、玉米、拟南芥、浮萍NRT家族氨基酸序列，利用Mega X软件绘制系统进化树(图1)。获得与拟南芥AtNRT1.1关系最近的浮萍SpNRT1.1蛋白为Spipo1G0085300，发现其序列5’端存在缺失。通过Tair-PCR方法获得SpNRT1.1基因5’端序列，最终获得SpNRT1.1全长序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3，其核酸序列为SEQ ID NO.1。

2.SpNRT1.1核酸序列优化：考虑到浮萍和拟南芥物种计划关系较远，核酸的密码子偏好性有较大的差异，我们根据拟南芥的密码子偏好性对浮萍SpNRT1.1基因的核酸序列进行密码子优化，所得优化后核酸序列为SEQ ID NO.2.

3.合成全长SpNRT1.1序列SEQ ID NO.2，连接于PUC19载体，转化Top10菌株保存。

实施例2：重组载体的获得

1.合成引物SpNRT1.1-attBF和SpNRT1.1-attBR；

SpNRT1.1-attBF：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-ATGGCCACTCTGCCGGAG，SEQ ID NO.4；

SpNRT1.1-attBR：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-GACGTGGTGGGCCGTTTC，SEQ ID NO.5。

2.以合成的基因SpNRT1.1-PUC19为模板，PCR扩增SpNRT1.1基因。PCR体系为ddH2O:32uL，Fast Pfu Buffer:10uL，dNTPs Mix:4uL，SpNRT1.3-attBF(10mM)：1uL，SpNRT1.3-attBR(10mM)：1uL，SpNRT1.3-PUC19质粒：1uL，Fast Pfu:1uL。PCR程序为：95℃5min；95℃30s，55℃30min，72℃1min，35个循环后，72℃延伸10min。

3.对获得的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得单一明亮的2130bp条带，对该条带进行切胶回收(Axygen DNA胶回收试剂盒，离心柱法)。

4.纯化后的DNA:SpNRT1.1-attB进行BP克隆反应连入中间载体pDONR，反应体系为：SpNRT1.1-attB:3uL，pDONR质粒：1uL，BP克隆酶：1uL。25℃反应1小时后全部转化大肠杆菌DH5α，37℃倒置平板培养14小时后挑去单克隆摇菌液体半盐LB(博来霉素25mg/L)培养4-6h后PCR检测，阳性克隆进行测序验证。

5.已测序验证的SpNRT1.1-pDONR质粒进行LR克隆反应，连接入植物表达载体pEarlyGate101。反应体系为SpNRT1.3-pDONR:3uL，pEarlyGate101质粒：1uL，LR克隆酶：1uL。25℃反应1小时后全部转化大肠杆菌DH5α，37℃倒置平板培养14小时后挑去单克隆摇菌液体LB(卡那霉素100mg/L)培养4-6h后PCR检测，阳性克隆进行测序验证。

6.已测序验证的SpNRT1.1-101质粒转化农杆菌GV3101，28℃倒置平板培养48小时后挑单克隆摇菌液体LB(卡那霉素100mg/L，庆大霉素50mg/L，利福平50mg/L)培养4-6h后PCR检测，阳性克隆扩大培养，10uL菌液，10mL液体LB(卡那霉素100mg/L，庆大霉素50mg/L，利福平50mg/L)培养，28℃，220rpm培养过夜后，5000rpm离心菌体，10mM MgCl2重悬菌体，OD600约0.6-0.8，10mM MES，200uM AS，黑暗诱导3小时，注射烟草。注射后的烟草黑暗培养24h，正常光照24h后荧光显微镜下观察SpNRT1.1-101表达情况(图2)。

实施例3：SpNRT1.1转基因拟南芥的获得

1.实施例2中的阳性农杆菌100uL，100mL液体LB(卡那霉素100mg/L，庆大霉素50mg/L，利福平50mg/L)过夜培养，5000rpm离心菌体，转化Buffer重悬菌体(转化Buffer：50g/L蔗糖，2.2g/L MS，PH调至5.8，400uL/L silweet-77)至OD600 0.6～0.8。

2.准备生长状态良好、花序丰富的拟南芥苗，准备好的转化Buffer重悬菌液进行花序浸染30秒，保鲜膜包裹保湿，黑暗平置24小时后正常光照培养。种子成熟后收集种子。

3.收集到的T0代种子播种一周后使用除草剂Basta筛选，能够正常生长的为阳性转基因T1代苗。筛选至T3代得到纯系转基因种子，T3代纯系转基因苗DNA进行PCR鉴定结果如图3。

实施例4：SpNRT1.1转基因拟南芥开花时间延迟生物量增加

1.随机选择2个SpNRT1.1转基因株系，命名为SpNRT1.1-6、SpNRT1.1-10，种子用10％安替福民消毒后播种于的1/2MS培养基，4℃，黑暗放置3天，转入光照培养(光周期：16h光照，8h黑暗，18-23℃)，7天后观察表型移栽至蛭石：基质(3:1)的培养基中，一月后观察表型发现转基因株系晚花且生物量提高(图4A)。

2.培养好的拟南芥苗进行拍照，统计莲座叶数目和鲜重，Office Excel 2010和Prism8进行数据分析和绘图(图4B，4C)。

图4表明SpNRT1.1三个不同株系的转基因拟南芥在不同氮素浓度下相比于对照组表现出侧根数目明显增加的表型，图4B，4C统计结果表明了SpNRT1.1转基因拟南芥在本实施例培养条件下开花时间晚于对照组，生物量显著多于对照组。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 浮萍硝酸盐转运蛋白基因SpNRT1.1及其编码蛋白在调控植物开花和生物量中的应用

<130> KAG48540

<141> 2022-04-01

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1782

<212> DNA

<213> Lemna minor Linn

<400> 1

atggccactc tgccggagac agatggcggc aggatcctaa ccgatgcttg ggactacaag 60

gggcgccccg ccatccgctc acagaccggg ggctggacta gcgccgccac cattcttgtg 120

gtggagctga acgagcggct gacatcgctg gggatcgcag tgaacctagt gacctacatg 180

acgggcacga tgcacctcgg caatgccgtg gccgcgaaca ccgtcaccaa ctttctcggc 240

agctccttca ttctctgcct cctcggcggt ttcatcgccg ataccttcct cggcaggtat 300

ctcaccatcg ccatcttcgc cgccgtccaa gcgacaggag tgactatcct gacaatctca 360

acggccgttc ccggcctccg tccgccaagt tgcgcccctt cctccgcctc ctgcatccca 420

gctagcggta tacagcttgc ggtgctgtat ctcgccctct acatgacggc cctcggcacg 480

ggcggcctca agtccagcgt ctccggcttc ggatcggacc agttcgacga gtcgaacccg 540

tgggagaaga accggatgat gaagttcttc aactatttct tcttcctcat cagcttcggc 600

tccctgatcg cggtgacggt cctcgtctac gtccaggaca acctgggtag gcggtggggc 660

tacggcatat gcgccacctc catcttggct ggcctgctag tgttcctctc cggtactcgc 720

cgctaccgct tcaagaagct ggtgggaagc cccctgaccc agatcttctc cgtcgtcgtg 780

gcggcttgga gaaaccggcg gctttccctg ccgtcggagg cggtgctgct ctacgatgtc 840

ggcgaggagg ccaagctgga cgggaggcgg ggcaacacaa agcagccctt gccccattcc 900

aaacagttcc gcttcctgga ccgtgccgcc attaagagag aggacgtgtc gccgccgagc 960

aggtggctgc tgaacacact gacggacgtg gaggaggtga agatggtggt gcggatgcta 1020

cccatctggg ccaccaccat catgttctgg actgtctacg ctcagatgac caccttctcg 1080

gtgtcccagg ccaccaccat ggaccgcagc gttgggggct ccttcgagat cccaccgggc 1140

tccctgactg tcttcttcgt cctttccatc ctcctcacgg tgcccttcta cgaccgcctg 1200

gtcgttcccg tctcccgccg cttcaccggc aacccgcagg gcctgacgcc cctccagcgc 1260

atcggcgtgg gactggtcct ctccgccatg gccatgaccg ccgctgcact aaccgagatc 1320

aagcgccagc gggtggccgc cgccatggtc gacccccacg ggccggtgcc catgagcgtc 1380

ttctggctgg tgccgcaatt ctttctcgtg ggggcggggg aggccttcgc gtacattggc 1440

cagctggact tcttcctcag ggagtgcccc agcgggatga agaccatgag cacggggctg 1500

ttcctcagca cgctggccct cggcttcttc ctcagctccg cgctggtgac tgtcgtcgac 1560

cgcgtgacgg ggcacggcgg gcacggctcg tggctggccg acgatctcaa ccaggggagg 1620

ctctacgact tctactggct cctggcggtg ctcagcgtgc tcaacctcgc cgtctatttg 1680

gcctccgctc ggtggtacgt ctacagggaa cgaggggagc cgccaacgga cgacggcaac 1740

ctcggagtcg agctcaggga cgccgaaacg gcccaccacg tc 1782

<210> 2

<211> 1782

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggcgacgc tccctgaaac tgatggtgga agaatcctca ccgatgcctg ggattataag 60

ggacgtcctg ctatcagatc tcagactggt ggatggactt ctgctgctac tatcctcgtg 120

gttgagctta acgagagact cacctctctc ggaatcgctg ttaacctcgt gacttacatg 180

accggaacta tgcaccttgg aaacgctgtg gctgctaaca ccgtgactaa ctttctcggg 240

tcgagcttca tcctttgcct tctcggagga ttcattgccg acacattcct cggacgttac 300

ctcacgattg ctatcttcgc tgctgttcag gctactggtg tgactatcct cactatctct 360

actgctgtgc ctggactcag acctccttct tgtgctccat cttctgcctc ttgtatcccg 420

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ggtggactca agtcctctgt tagcggattc ggatctgatc agttcgacga gtctaacccg 540

tgggagaaga acaggatgat gaagttcttc aactacttct tcttcctcat ctcgttcggc 600

agccttatcg ctgtgactgt tctcgtttac gtgcaggaca acctcggtag aagatgggga 660

tacggaatct gcgctacttc tatccttgct ggactcctcg tgttcctgtc tggaactaga 720

aggtacaggt tcaagaagct cgtcggatct ccactcacgc agatcttctc tgttgttgtt 780

gctgcttgga ggaaccgtag gttgtcactt ccttcagagg ctgtgctcct ctacgatgtt 840

ggagaagagg ctaagctcga tggaagaagg ggaaatacca agcagcctct tccacactct 900

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cgttggcttc tcaacaccct cactgatgtc gaagaggtga agatggtggt gaggatgctc 1020

cctatttggg ctaccactat catgttctgg accgtgtacg ctcagatgac caccttctca 1080

gtttctcagg ctaccaccat ggaccgttct gttggaggat ctttcgagat ccctcctgga 1140

tctctcactg tgttcttcgt gctttctatc ctcctcacgg tgcctttcta cgatagactc 1200

gttgtgcctg tgtctaggcg tttcactgga aaccctcaag gacttacacc tctccagaga 1260

atcggagttg gactcgttct tagcgctatg gctatgactg ctgctgctct cactgagatc 1320

aagagacaaa gggttgcagc tgctatggtg gatcctcatg gacctgttcc tatgtctgtt 1380

ttctggctcg tgccgcagtt ctttcttgtt ggtgctggtg aagctttcgc ctacatcgga 1440

cagctcgatt tcttccttcg tgaatgcccg tctgggatga agactatgtc tactggactc 1500

ttcctcagca ctctcgctct tggtttcttc ctctcttctg ctctcgtgac cgttgtggat 1560

agagttactg gacatggtgg acacggatct tggcttgctg atgatcttaa ccaggggcga 1620

ctctacgatt tctactggct tcttgctgtg ctcagcgttc tcaaccttgc tgtgtatctc 1680

gcttccgcta gatggtacgt ttacagagaa agaggtgagc ctcctaccga tgatggaaac 1740

cttggagttg agcttcgtga cgctgagact gctcatcatg tt 1782

<210> 3

<211> 594

<212> PRT

<213> Lemna minor Linn

<400> 3

Met Ala Thr Leu Pro Glu Thr Asp Gly Gly Arg Ile Leu Thr Asp Ala

1 5 10 15

Trp Asp Tyr Lys Gly Arg Pro Ala Ile Arg Ser Gln Thr Gly Gly Trp

20 25 30

Thr Ser Ala Ala Thr Ile Leu Val Val Glu Leu Asn Glu Arg Leu Thr

35 40 45

Ser Leu Gly Ile Ala Val Asn Leu Val Thr Tyr Met Thr Gly Thr Met

50 55 60

His Leu Gly Asn Ala Val Ala Ala Asn Thr Val Thr Asn Phe Leu Gly

65 70 75 80

Ser Ser Phe Ile Leu Cys Leu Leu Gly Gly Phe Ile Ala Asp Thr Phe

85 90 95

Leu Gly Arg Tyr Leu Thr Ile Ala Ile Phe Ala Ala Val Gln Ala Thr

100 105 110

Gly Val Thr Ile Leu Thr Ile Ser Thr Ala Val Pro Gly Leu Arg Pro

115 120 125

Pro Ser Cys Ala Pro Ser Ser Ala Ser Cys Ile Pro Ala Ser Gly Ile

130 135 140

Gln Leu Ala Val Leu Tyr Leu Ala Leu Tyr Met Thr Ala Leu Gly Thr

145 150 155 160

Gly Gly Leu Lys Ser Ser Val Ser Gly Phe Gly Ser Asp Gln Phe Asp

165 170 175

Glu Ser Asn Pro Trp Glu Lys Asn Arg Met Met Lys Phe Phe Asn Tyr

180 185 190

Phe Phe Phe Leu Ile Ser Phe Gly Ser Leu Ile Ala Val Thr Val Leu

195 200 205

Val Tyr Val Gln Asp Asn Leu Gly Arg Arg Trp Gly Tyr Gly Ile Cys

210 215 220

Ala Thr Ser Ile Leu Ala Gly Leu Leu Val Phe Leu Ser Gly Thr Arg

225 230 235 240

Arg Tyr Arg Phe Lys Lys Leu Val Gly Ser Pro Leu Thr Gln Ile Phe

245 250 255

Ser Val Val Val Ala Ala Trp Arg Asn Arg Arg Leu Ser Leu Pro Ser

260 265 270

Glu Ala Val Leu Leu Tyr Asp Val Gly Glu Glu Ala Lys Leu Asp Gly

275 280 285

Arg Arg Gly Asn Thr Lys Gln Pro Leu Pro His Ser Lys Gln Phe Arg

290 295 300

Phe Leu Asp Arg Ala Ala Ile Lys Arg Glu Asp Val Ser Pro Pro Ser

305 310 315 320

Arg Trp Leu Leu Asn Thr Leu Thr Asp Val Glu Glu Val Lys Met Val

325 330 335

Val Arg Met Leu Pro Ile Trp Ala Thr Thr Ile Met Phe Trp Thr Val

340 345 350

Tyr Ala Gln Met Thr Thr Phe Ser Val Ser Gln Ala Thr Thr Met Asp

355 360 365

Arg Ser Val Gly Gly Ser Phe Glu Ile Pro Pro Gly Ser Leu Thr Val

370 375 380

Phe Phe Val Leu Ser Ile Leu Leu Thr Val Pro Phe Tyr Asp Arg Leu

385 390 395 400

Val Val Pro Val Ser Arg Arg Phe Thr Gly Asn Pro Gln Gly Leu Thr

405 410 415

Pro Leu Gln Arg Ile Gly Val Gly Leu Val Leu Ser Ala Met Ala Met

420 425 430

Thr Ala Ala Ala Leu Thr Glu Ile Lys Arg Gln Arg Val Ala Ala Ala

435 440 445

Met Val Asp Pro His Gly Pro Val Pro Met Ser Val Phe Trp Leu Val

450 455 460

Pro Gln Phe Phe Leu Val Gly Ala Gly Glu Ala Phe Ala Tyr Ile Gly

465 470 475 480

Gln Leu Asp Phe Phe Leu Arg Glu Cys Pro Ser Gly Met Lys Thr Met

485 490 495

Ser Thr Gly Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ala Leu Gly Phe Phe Leu Ser

500 505 510

Ser Ala Leu Val Thr Val Val Asp Arg Val Thr Gly His Gly Gly His

515 520 525

Gly Ser Trp Leu Ala Asp Asp Leu Asn Gln Gly Arg Leu Tyr Asp Phe

530 535 540

Tyr Trp Leu Leu Ala Val Leu Ser Val Leu Asn Leu Ala Val Tyr Leu

545 550 555 560

Ala Ser Ala Arg Trp Tyr Val Tyr Arg Glu Arg Gly Glu Pro Pro Thr

565 570 575

Asp Asp Gly Asn Leu Gly Val Glu Leu Arg Asp Ala Glu Thr Ala His

580 585 590

His Val

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggccact ctgccggag 49

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gacgtggtgg gccgtttc 48