松属素二氢查耳酮及其组合物和它们作为农药的用途
文献发布时间：2023-06-19 16:08:01
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年12月2日提交的意大利专利申请第102019000022740号的优先权权益，该专利申请的内容通过引用以其全文并入本文中。
技术领域
本发明总体上涉及一种具有农业用途的杀真菌剂和杀菌特性的化合物。
背景技术
植物病虫害是现代农业生产力面临的主要挑战。
镰刀菌(Fusarium)属是丝状真菌(filamentous fungi)的大属，属于子囊菌(ascomycete)的系统发育谱系。许多物种的镰刀菌对植物是致病的，并导致严重的疾病，像对重要的经济植物(主要是蔬菜)造成严重的枯萎或‘腐烂’。另外，镰刀菌物种会感染谷物，导致玉米中的赤霉病和穗腐病，并导致毒菌毒素在一定条件下积累(J.E.E.Jenkins,Y.S.Clark和A.E.Buckle,1998)。
土壤传播的植物病原体对农作物造成了严重的损害。植物病原真菌丝核菌(Rhizoctonia)属，属于担子菌(Basidiomycetes)系统发育谱系，并且引起一系列具有商业意义的植物病害，诸如褐斑病、幼苗立枯病、根腐病和腹腐病。植物中的所有丝核菌病以及随后的二次感染都很难控制(Erlacher等人,2014)。适当的控制丝核菌属对诸如水稻等各种农作物和各种蔬菜的生产力至关重要。
腐霉菌(Pythium)属，是一种植物病原性真菌样生物，其属于被称为卵菌纲的真核微生物的系统发育谱系，会导致烟草、番茄、芥末、辣椒和水芹幼苗的广泛“立枯”疾病(Martin&Loper,2010)。
核盘菌(Sclerotinia)属，是一种植物病原真菌，属于子囊菌的系统发育谱系。核盘菌属，在许多植物寄主中引起一种叫做白绢病的疾病，这些寄主中的大多数为蔬菜(ANR出版社8042,“核盘菌属病(Sclerotinia diseases)”-ISBN 978-1-60107-220-7)。
胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)是一种细菌植物病原体，属于γ变形菌(Proteobacteria)的系统发育谱系，在许多蔬菜(卷心菜、马铃薯、洋葱、萝卜等)中引起软腐病，在培养、运输和储存期间，主要在收获后储存期间造成了相当大的经济损失(Lee等人,2013年)。
假单胞菌(
由于日益增强的抗虫性、不稳定的气候条件和不断增加的监管压力，可用于作物保护目的以对抗这些疾病的有效成分的数量逐年减少。以新型化学分子为基础的新型活性成分是作物保护解决方案的发展方向。
发明内容
一方面，本发明涉及一种包括松属素二氢查耳酮或其农业上可接受的盐作为活性农药成分的农药组合物。
在另一方面，本发明提供了一种用于控制、预防、减少或根除植物、植物器官、植物部分或植物繁殖材料上的植物病原体感染或其实例的方法，该方法包括：向植物、植物器官或植物繁殖材料或植物周围的土壤施用杀虫有效量的松属素二氢查耳酮或包括杀虫有效量的松属素二氢查耳酮的农药组合物，该松属素二氢查耳酮如下面提及的实施方案中任一实施方案所定义，其中植物病原体是选自以下的成员：选自镰刀菌和核盘菌的核盘菌科的属；腐霉菌科的霜霉菌；伞菌纲的担子菌门；和选自肠杆菌目和假单胞菌目的γ变形杆菌目。
附图说明
图1至图3展示出了松属素二氢查耳酮(PDC)在3个独立实验中对黄瓜幼苗存活的影响，以接种尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)后三周的存活百分比来确定。
具体实施方式
根据本发明已经发现，松属素二氢查耳酮是一种有效的农药，可对抗核盘菌科的两个属；腐霉菌科的霜霉菌；伞菌纲的担子菌门；和两种不同的γ变形菌目。
松属素二氢查耳酮是查耳酮C-糖苷的成员。CAS注册将松属素二氢查耳酮标识为3-苯基-1-(2,4,6-三羟基苯基)丙-1-酮，也具有以下同义词：1-丙酮、3-苯基-1-(2,4,6-三羟基苯基)、3-苯基-1-(2,4,6-三羟基苯基)-1-丙酮和2',4',6'-三羟基二氢查耳酮。CAS注册号为：1088-08-0。
因此，一方面，本发明涉及一种包括松属素二氢查耳酮或其农业上可接受的盐作为活性农药成分的农药组合物。
在某些实施例中，所述农药组合物还包括农业上合适或可接受的溶剂或增溶剂。
在某些实施例中，所述农业上可接受的溶剂或增溶剂是能够溶解或增溶松属素二氢查耳酮的水混溶性溶剂。
在某些实施例中，所述能够溶解或增溶松属素二氢查耳酮的水混溶性溶剂是极性溶剂，诸如醇、酮、内酯、酮醇、乙二醇、缩水甘油醚、酰胺、链烷醇胺、亚砜和吡咯烷酮。
在一些实施例中，所述组合物还包括非离子型表面活性剂。所述表面活性剂的非限制性实例是聚山梨醇酯型表面活性剂，诸如
在特定实施例中，所述组合物包括选自二甲基亚砜或乙醇的溶剂，和聚山梨醇酯型非离子型表面活性剂，即
另一方面，本发明提供了一种用于控制、预防、减少或根除植物、植物器官、植物部分或植物繁殖材料上的植物病原体感染或其实例的方法，所述方法包括：向植物、植物器官或植物繁殖材料或植物周围的土壤施用杀虫有效量的松属素二氢查耳酮或包括杀虫有效量的以上实施例中的任一实施例所述的松属素二氢查耳酮的农药组合物，其中所述植物病原体是选自以下的成员：选自镰刀菌和核盘菌的核盘菌科的属；腐霉菌科的霜霉菌；伞菌纲的担子菌门；和选自肠杆菌目和假单胞菌目的γ变形杆菌目。
本发明的治疗方法是有用的，例如对于抵抗枯萎或腐烂；玉米中的赤霉病和穗腐病；褐斑病；根腐病和腹腐病；烟草、番茄、芥菜、辣椒和水芹幼苗的“立枯”疾病；许多植物宿主中的白霉菌，诸如蔬菜；许多蔬菜(卷心菜、马铃薯、洋葱、萝卜等)的软腐病；防风草和番茄的髓坏死；水稻褐斑病和叶鞘褐腐病，杏仁细菌性溃疡病；以及橄榄结瘤病。
在某些实施例中，所述植物病原体是所述镰刀菌属的成员，诸如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、球茎状镰刀菌(Fusariumbubigeum)、松树脂溃疡病菌(Fusarium circinatum)、克地镰刀菌(Fusariumcrookwellense)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、朗氏镰刀菌(Fusarium langsethiae)、梨孢镰刀菌(Fusarium poae)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、腐皮镰刀菌(Fusarium proliferatum)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)、丝状镰刀菌(Fusarium venenatum)、拟轮生镰刀菌(Fusarium verticillioides)和大豆猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme)。
在某些实施例中，所述植物病原体是所述尖孢镰刀菌。
在某些实施例中，所述植物病原体是所述核盘菌属的成员，诸如核盘菌，北方核盘菌(Sclerotinia borealis)、球茎核盘菌(Sclerotinia bulborum)(Wakker)Sacc.、币斑病菌(clerotinia homoeocarpa)F.T.Benn.、小核盘菌(Sclerotinia minor Jagger)、蓖麻子核盘菌(Sclerotinia ricini)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)、三叶草盲种核盘菌(Sclerotinia spermophila)Noble、核盘菌(Sclerotinia sulcate)、三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum Erikss.)、藜芦碱核盘菌(Sclerotinia veratri)。
在某些实施例中，所述植物病原体是所述核盘菌。
在某些实施例中，所述植物病原体是所述腐霉菌科的成员。
在某些实施例中，其中所述腐霉菌科植物病原体是选自所述腐霉菌属的成员：瓜果腐霉菌、棘腐霉、刺器腐霉、顶生腐霉、粘腐霉、孤雌腐霉、安鼓腐霉、狭囊腐霉、卵悬腐霉、浮游腐霉、芒孢腐霉、强雄腐霉、引雄腐霉、二歧腐霉、北方腐霉、毕思曼腐霉、巴特勒腐霉、卡姆兰腐霉(Pythium camurandrum)、钟形腐霉、卡纳瑞恩腐霉、凯皮萨腐霉、卡波尼腐霉、卡地腐霉、链状腐霉、匍丝腐霉、康锥蔻拉、桔腐霉、色孢腐霉、菌丝状腐霉、康替瓜腐霉、密码畸雄腐霉、葫芦科腐霉、筒孢腐霉、蘣菁腐霉、德巴利腐霉、德里腐霉、毁坏性腐霉、异丝腐霉、异形腐霉、无明喻腐霉、宽雄腐霉、针棘腐霉、隆起腐霉(Pythium emineosum)、猬木腐霉、福来文斯腐霉、囊形腐霉、球序腐霉、禾生腐霉菌、囊腐霉、贵阳腐霉、旋雄腐霉、旋柄腐霉、异宗结合腐霉、齿孢腐霉、海波荄姆腐霉、木蓝腐霉、肿囊腐霉、苜蓿腐霉、闻型腐霉、畸雌腐霉、岩山腐霉、菑丝堥莥腐霉、昆明腐霉、莉陶锐腐霉、长雄腐霉、长囊腐霉、鲁塔瑞姆腐霉、大孢腐霉、突腐霉、海洋腐霉、袋囊腐霉、拟南芥与腐霉、阔叶腐霉、奇雄腐霉、小腐霉、简囊腐霉、山肉桂腐霉、多孢腐霉、群结腐霉、长井腐霉、结节腐霉、纳恩腐霉、肿雄腐霉、奥卡诺根恩瑟腐霉、寡雄腐霉、卵突腐霉、奥纳卡蒲腐霉、直生藏卵腐霉、介形类腐霉、粗缆腐霉、粗缆腐霉、褐色雪腐霉、侧雄腐霉、短小腐霉、果胶裂解腐霉、周雄腐霉、缠器腐霉、合欢腐霉、无序腐霉、芦根腐霉、卵塞腐霉、多卵腐霉、极地腐霉(Pythium polare)、棓乐马斯塔腐霉、紫菜腐霉、前扁平腐霉、层出腐霉、绚丽腐霉、琵瑞蒌柏腐霉、蒙栎盘腐霉、P辐射腐霉、分枝状腐霉、规则腐霉、稻根腐霉、根甘蔗腐霉、荛斯綽蒂菲腐霉、喙腐霉、角柄腐霉、硬腐霉、塞尼泰腐霉、针腐霉、刺腐霉、华丽腐霉、斯特林腐霉、密集腐霉、沟腐霉、土栖腐霉、簇囊腐霉、嗜管腐霉、终极腐霉、嗜管腐霉、弯柱腐霉、波状腐霉、范特腐霉、葡萄腐霉、紫菜腐霉、P卷旋腐霉、姜腐霉、以及生姜腐霉。
在某些实施例中，所述植物病原体是所述伞菌纲的成员。
在某些实施例中，所述伞菌纲植物病原体是鸡油菌(Cantharellales)目的成员。
在某些实施例中，所述鸡油菌目植物病原体是角担菌科的成员。
在某些实施例中，所述角担菌科植物病原体是丝核菌属的成员，诸如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、广生亚大茎点菌(Rhizoctonia bataticola)(也称为壳球孢菌(Macrophomina phaseolina))、胡萝卜丝核菌(Rhizoctonia carotae)(也称为胡萝卜丝核菌(Fibulorhizoctonia carotae))、谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、紫纹羽丝核菌(Rhizoctonia crocorum)(也称为紫纹羽丝核菌(Thanatophytum crocorum))、草莓花枯病菌(Rhizoctonia fragariae)、匍匐天鹅绒兰丝核菌(Rhizoctonia goodyerae-repentis)也称为小麦纹枯病菌(Ceratobasidium cornigerum)、稻枯斑丝核菌(Rhizoctoniaoryzae)，也称为旋卷似串担革菌(Waitea circinate)、以及多枝丝核菌(Rhizoctoniaramicola)，也称为Ceratorhiza ramicola。
在某些实施例中，所述植物病原体是立枯丝核菌。
在某些实施例中，所述植物病原体是所述肠杆菌目的成员。
在某些实施例中，所述肠杆菌目植物病原体是所述肠杆菌(Enterobacteriaceae)科的成员。
在某些实施方案中，所述肠杆菌科植物病原体是果胶杆菌(Pectobacterium)属的成员，诸如胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium caratovorum)和软腐病新病原菌(Pectobacterium aroidearum)。
在某些实施例中，所述植物病原体是所述假单胞菌目的成员。
在某些实施例中，所述假单胞菌目植物病原体是假单胞菌科的成员。
在某些实施例中，所述假单胞菌科植物病原体是诸如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeroginosa)和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)等假单胞菌属的成员。
本发明的农药组合物可以调配成调配物以促进活性农药成分的应用。
所述调配物的非限制性实例可以是悬浮剂(SC)、胶囊悬浮液(CS)、水分散粒剂(WG)、可乳化浓缩物(EC)、可湿性粉剂(WP)、可溶性(液体)浓缩物(SL)和可溶性粉剂(SP)。
所述调配物还可以包括至少一种溶剂或增溶剂、佐剂、载剂、稀释剂和/或表面活性剂。
所述佐剂的非限制性实例是活化剂佐剂，诸如阳离子、阴离子或非离子表面活性剂；能够提高农药产品活性的油和氮基肥料。油可以是植物油，诸如石蜡或萘基石油、基于可乳化石油基油的植物油浓缩物，以及衍生自种子油的植物油浓缩物，通常是棉花、亚麻子、大豆或向日葵油，用于控制杂草。氮基肥料可以是硫酸铵或尿素-硝酸铵。
所述增溶剂或溶剂的非限制性实例是石油基溶剂、上述油、脂肪酸的液体混合物、乙醇、甘油和二甲基亚砜。农业上可接受的溶剂或增溶剂可以是能够溶解或增溶松属素二氢查耳酮的水混溶性溶剂，诸如极性溶剂，例如，醇、酮、内酯、酮醇、乙二醇、乙二醇醚、酰胺、链烷醇胺、亚砜和吡咯烷酮。
所述载剂的非限制性实例是沉淀二氧化硅、胶态二氧化硅、绿坡缕石、瓷土、滑石、高岭土及它们的组合。
所述农药调配物还可以包括稀释剂，诸如乳糖、淀粉、尿素、水溶性无机盐及它们的组合。
所述农药调配物还可以包括一种或多种表面活性剂，诸如聚山梨醇酯型非离子型表面活性剂、苯乙烯丙烯酸分散剂聚合物、酸性树脂共聚物基分散剂、聚羧酸钾、烷基萘磺酸钠共混物、二异丙基萘磺酸钠、萘磺酸钠缩合物的钠盐、木质素磺酸盐及它们的组合。
所述松属素二氢查耳酮或包括所述松属素二氢查耳酮的组合物或所述调配物可以在上述实施例的任一实施例的方法中通过喷洒、浸泡、敷涂、包衣、造粒或浸渍施加至植物或其部分、器官或植物繁殖材料。
根据本发明的某些实施例，包括所述松属素二氢查耳酮的组合物或所述调配物中所述松属素二氢查耳酮的浓度可以在10百万分率至2000百万分率的范围内(ppm，1ppm等于当呈干燥形式时，每千克1mg的松属素二氢查耳酮或液态时1mg/L)。
在某些实施例中，包括所述松属素二氢查耳酮的组合物或所述调配物中所述松属素二氢查耳酮的浓度可以在10ppm至2000ppm、10ppm至1500ppm、10ppm至1000ppm、10ppm至900ppm、10ppm至800ppm、10ppm至700ppm、10ppm至600ppm、10ppm至500ppm、10ppm至400ppm、10ppm至300ppm、10ppm至200ppm、10ppm至100ppm、10ppm至90ppm、10ppm至80ppm、10ppm至70ppm、10ppm至60ppm、10ppm至50ppm、10ppm至40ppm、10ppm至30ppm、10ppm至20ppm、20ppm至2000ppm、20ppm至1500ppm、20ppm至1000ppm、20ppm至900ppm、20ppm至800ppm、20ppm至700ppm、20ppm至600ppm、20ppm至500ppm、20ppm至400ppm、20ppm至300ppm、20ppm至200ppm、20ppm至100ppm、20ppm至90ppm、20ppm至80ppm、20ppm至70ppm、20ppm至60ppm、20ppm至50ppm、20ppm至40ppm、20ppm至30ppm、20ppm至20ppm、30ppm至2000ppm、30ppm至1500ppm、30ppm至1000ppm、30ppm至900ppm、30ppm至800ppm、30ppm至700ppm、30ppm至600ppm、30ppm至500ppm、30ppm至400ppm、30ppm至300ppm、30ppm至200ppm、30ppm至100ppm、30ppm至0ppm、30ppm至100ppm、30ppm至90ppm、30ppm至80ppm、30ppm至70ppm、30ppm至60ppm、30ppm至50ppm、30ppm至40ppm、40ppm至2000ppm、40ppm至1500ppm、40ppm至1000ppm、40ppm至900ppm、40ppm至800ppm、40ppm至700ppm、40ppm至600ppm、40ppm至500ppm、40ppm至400ppm、40ppm至300ppm、40ppm至200ppm、40ppm至100ppm、40ppm至90ppm、40ppm至80ppm、40ppm至70ppm、40ppm至60ppm、40ppm至50ppm、50ppm至2000ppm、50ppm至1500ppm、50ppm至1000ppm、50ppm至900ppm、50ppm至800ppm、50ppm至700ppm、50ppm至600ppm、50ppm至500ppm、50ppm至400ppm、50ppm至300ppm、50ppm至200ppm、50ppm至100ppm、50ppm至90ppm、50ppm至80ppm、50ppm至70ppm、50ppm至60ppm、60ppm至2000ppm、60ppm至1500ppm、60ppm至1000ppm、60ppm至900ppm、60ppm至800ppm、60ppm至700ppm、60ppm至600ppm、60ppm至500ppm、60ppm至400ppm、60ppm至300ppm、60ppm至200ppm、60ppm至100ppm、60ppm至90ppm、60ppm至80ppm、60ppm至70ppm、70ppm至2000ppm、70ppm至1500ppm、70ppm至1000ppm、70ppm至900ppm、70ppm至800ppm、70ppm至700ppm、70ppm至600ppm、70ppm至500ppm、70ppm至400ppm、70ppm至300ppm、70ppm至200ppm、70ppm至100ppm、70ppm至90ppm、70ppm至80ppm、80ppm至2000ppm、80ppm至1500ppm、80ppm至1000ppm、80ppm至900ppm、80ppm至800ppm、80ppm至700ppm、80ppm至600ppm、80ppm至500ppm、80ppm至400ppm、80ppm至300ppm、80ppm至200ppm、80ppm至100ppm、80ppm至90ppm、90ppm至2000ppm、90ppm至1500ppm、90ppm至1000ppm、90ppm至900ppm、90ppm至800ppm、90ppm至700ppm、90ppm至600ppm、90ppm至500ppm、90ppm至400ppm、90ppm至300ppm、90ppm至200ppm、90ppm至100ppm、100ppm至2000ppm、100ppm至1500ppm、100ppm至1000ppm、100ppm至900ppm、100ppm至800ppm、100ppm至700ppm、100ppm至600ppm、100ppm至500ppm、100ppm至400ppm、100ppm至300ppm、100ppm至200ppm、200ppm至2000ppm、200ppm至1500ppm、200ppm至1000ppm、200ppm至900ppm、200ppm至800ppm、200ppm至700ppm、200ppm至600ppm、200ppm至500ppm、200ppm至400ppm、200ppm至300ppm、300ppm至2000ppm、300ppm至1500ppm、300ppm至1000ppm、300ppm至900ppm、300ppm至800ppm、300ppm至700ppm、300ppm至600ppm、300ppm至500ppm、300ppm至400ppm、400ppm至2000ppm、400ppm至1500ppm、400ppm至1000ppm、400ppm至900ppm、400ppm至800ppm、400ppm至700ppm、400ppm至600ppm、400ppm至500ppm、500ppm至2000ppm、500ppm至1500ppm、500ppm至1000ppm、500ppm至900ppm、500ppm至800ppm、500ppm至700ppm、500ppm至600ppm、600ppm至2000ppm、600ppm至1500ppm、600ppm至1000ppm、600ppm至900ppm、600ppm至800ppm、600ppm至700ppm、700ppm至2000ppm、700ppm至1500ppm、700ppm至1000ppm、700ppm至900ppm、700ppm至800ppm、800ppm至2000ppm、800ppm至1500ppm、800ppm至1000ppm、800ppm至900ppm、900ppm至2000ppm、900ppm至1500ppm、900ppm至1000ppm、1000ppm至2000ppm、或1000ppm至1500ppm。
具体地，包括所述松属素二氢查耳酮的组合物或所述调配物中所述松属素二氢查耳酮的浓度可以是10ppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm、60ppm、70ppm、80ppm、90ppm、100ppm、110ppm、120ppm、130ppm、140ppm、150ppm、160ppm、170ppm、180ppm、190ppm、200ppm、210ppm、220ppm、230ppm、240ppm、250ppm、260ppm、270ppm、280ppm、290ppm、300ppm、310ppm、320ppm、330ppm、340ppm、350ppm、360ppm、370ppm、380ppm、390ppm、400ppm、410ppm、420ppm、430ppm、440ppm、450ppm、460ppm、470ppm、480ppm、490ppm、500ppm、1000ppm、1500ppm或2000ppm。
如本文所使用的术语“农药”是指有效控制、预防、减少或根除植物、植物器官、植物部分、植物繁殖材料或植物周围土壤的植物病原体感染或其实例的化合物，并且包括抗菌剂、杀真菌剂、除草剂和杀虫剂。
如本文中的术语“活性农药成分”是指作为农药有效的化合物。
如本文所使用的术语“植物器官”是指叶结构、茎结构、根结构和生殖结构。
如本文所使用的术语“植物部分”是指营养植物材料；诸如插条或块茎；叶子、花、树皮或茎。
如本文所使用的术语“植物繁殖材料”是指种子、根、果实、块茎、球茎、根茎或植物的一部分。
如本文所使用的术语“杀虫有效量”是指有效控制、预防、减少或根除植物、植物器官、植物部分、植物繁殖材料或植物周围土壤的植物病原体感染或其实例的农药量。
根据《国际藻类、真菌和植物命名法规》第3.1条，术语“纲”、“目”、“科”、“属”和“种”是本文所使用的。
权利要求中所使用的术语“包括”是“开放式的”，并且意指所述元素，或者其结构或功能上的等效物，加上没有叙述的任何其他元素。其不应该被解释为限于其后列出的手段；其并不排除其他元素或步骤。其需要被解释为如指定所规定的特征、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤或组件或其组合的存在或添加。因此，表述“包括x和z的组合物”的范围不应被限于仅由化合物x和z组成的组合物。同样，表述“包括步骤x和z的方法”的范围不应被限于仅由这些步骤组成的方法。
如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有组合。除非另有定义，否则本文所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)均具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。还将理解的是，术语，例如在常用词典中定义的那些术语，应该被解释为具有与它们在说明书和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应该以理想化或过于正式的意义来解释，除非在此明确定义。为了简洁和/或清楚起见，可能不详细描述众所周知的功能或结构。
除非另有说明，本说明书中使用的所有数字应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。除非明确规定，否则如在本文所使用的，术语“约”被理解为在本领域的正常容差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。在一个实施例中，术语“约”意指正在使用的数字的数值的所报告的数值的10％以内，优选的在所报告的数值的5％以内。例如，术语“约”可以被立即理解为在所规定的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。在其他实施例中，术语“约”可以意指更高的变化容差，这取决于例如所使用的实验技术。指定值的所述变化是本领域技术人员所理解的，并且在本发明的上下文内。作为说明,“约1至约5”的数值范围应被解释为不仅包括明确列举的约1至约5的值，还包括指示范围内的单个值和子范围。因此，在此数值范围中单独地包括诸如2、3和4等单个值和子范围，例如1至3、2至4和3-5，以及1、2、3、4、5或6。此相同的原理适用于仅列举一个数值作为最小值或最大值的范围。除非另外从上下文清楚可见，否则本文所提供的所有数值被术语“约”修饰。其他类似的术语，诸如“基本上”、“一般地”、“高达”等应被解释为修饰术语或值，使得它不是绝对的。此类术语将由情况和它们所修饰的术语来定义，因为这些术语是本领域技术人员所理解的。这至少包括用于测量值的给定实验、技术或仪器的预期实验误差、技术误差和仪器误差的程度。
现在将通过以下非限制性实例来说明本发明。
实例
RPM-每分钟转动次数
RCF-相对离心力
CFUCFU-菌落形成单位菌落形成单位
PDBT-具有20ug/ml氯霉素的马铃薯葡萄糖培养液
PDAC-具有20ug/ml氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂
PDAC具有12ug/ml四环素的马铃薯葡萄糖琼脂
DMSO-二甲基亚砜
LB-溶原性培养液
LBA-具有琼脂的溶源性培养液
SCH-斯密特纳介质
2:PDBC-PDBC用无菌蒸馏水稀释2倍
PDA-马铃薯葡萄糖琼脂
PDBT-具有12ug/ml四环素的马铃薯葡萄糖培养液
实例1基于微孔板的松属素二氢查耳酮对尖孢镰刀菌生物活性的测定
将稀释后的已纯化的松属素二氢查耳酮添加至微孔板孔中，并与新鲜制备的孢子悬浮液混合，并通过读板器和目视观察监测从冷冻孢子开始的真菌生长。
镰刀菌是属于子囊菌的真菌，并且是一种土壤传播病原体。很容易产生大量的镰刀菌孢子，并且其在-20℃的60％甘油液体中存活，这导致决定在此筛选中使用冷冻孢子储备，而不是为每个实验制备新鲜孢子。
目的：
为了确定不同化合物对镰刀菌存活和生长的影响。
使用了以下材料、方法和设备：
镰刀菌孢子悬浮液制备：
1)将生长镰刀菌的琼脂块置于PDAC板中间的PDAC上，并在25℃下生长9天。
2)将板在冰箱中冷藏至少1小时。
3)向50ml管中添加30ml的冰箱冷却的60％无菌甘油溶液。
4)用手术刀将一个平板上带有菌丝和孢子的琼脂切割成小块，并将其插入装有30ml的60％甘油的50ml管中。
5)在3000RPM下震荡1分钟。
6)在整个过程期间将孢子保持在冰上。
7)将液体转移到新的50ml无菌管中-应该回收约25ml。
8)将孢子悬浮液通过16层纱布直接过滤到干净无菌的50ml管中，以除去菌丝。
9)计算孢子浓度(在40X10放大率下计数X10稀释度)，并通过冷却的无菌60％甘油溶液稀释，以得到2X10
10)将1ml孢子悬浮液等分至1.5ml管中-每个等分试样应分离出20个板用于筛选。
11)将孢子悬浮液储存在-20℃下储存。
用于筛选的孢子悬浮液制备：
1)从冰箱中取出1ml冷冻孢子悬浮液，并在冰上解冻。
2)将200ul孢子悬浮液与20ml冰箱冷却的PDBC在50ml管中混合，以制得2000个孢子/ml悬浮液。
3)使用此量筛选4个微孔板，其中每孔100个孢子。
用于筛选实验的微孔板制备：
1)从冰箱中取出在DMSO中的纯化的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并将其在工作台上解冻。
2)取1ul的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并用39ul水稀释至250ppm。
3)使用多移液管将10ul的已稀释的(250ppm)松属素二氢查耳酮溶液取入至微孔板的孔中。
4)使用多移液管向微孔板的孔中添加40ul充分混合的孢子悬浮液接种物。
5)用透明密封剂密封板。
6)以2000RPM震荡板10分钟，使材料与菌丝悬浮液混合。
7)将板在1000RCF下离心1秒，并停止收集板底部的液体。
8)将微孔板放在工作台上，直到其被读板器读取。
9)使用读板器读取板。
10)收集工作台上的板。
11)将已收集的板插入带布盖的塑料盒中，并将盒子置于25℃的培养箱中。
板的读出：
1)收集读板器3个以上日期的读出：测定开始后的第3天、第7天、第14天和第21天。
2)计算每次读出与零点读出之间的吸光度差异。
3)计算每个时间进程中每个孔的生长抑制百分比。使用对照板的DMSO处理结果作为100％生长。
4)结果：请参见实例7。
实例2基于微孔板的松属素二氢查耳酮对立枯丝核菌生物活性的测定
将稀释后的已纯化的松属素二氢查耳酮添加至微孔板孔中，并与50ul菌丝悬浮液混合，从共混的菌丝开始，通过读板器和目视观察监测真菌的生长。
使用了以下材料、方法和设备：
立枯丝核菌菌丝接种物的制备：
1)在PDAC 90mm培养皿中培养丝核菌，在1天至4天内得到生长的菌丝。
2)将50ml的PDBC培养基添加至250ml无菌锥形瓶中。
3)用手术刀将固体培养基切割成若干小块，并且将该若干小块插入至锥形瓶中。
4)用振荡器在27℃和150RPM的温度下培养2天至4天。
5)丢弃液体，并且将菌丝倒在空培养皿中。
6)使用手术刀从菌丝上切割许多小块，并且然后将它们插入装有50ml的PDBC培养基的250ml无菌锥形瓶中。
7)准备具有4个培养物的瓶，并在27℃在150RPM下振荡生长3天。
8)将培养物在冰箱中冷藏1小时。
9)将冷却的培养物倒入至250ml烧杯中。
10)添加20ml的冷却的PDBC。
11)用共混器在冰上以最大速度混合培养物2分钟，上下移动共混器若干次。
12)把混合物放在冰上。
13)在冰上，将约5ml共混混合物转移至15ml的管中。
14)将15ml管中的培养物在冰上匀质化2分钟。
15)如上所述，匀质化若干批5ml以制备所需的量(5ml的匀质化的培养物将制得约100ml接种物)。
16)将匀质化的一部分稀释10倍，以检查匀质化的浓度。悬浮液的浓度应为4X10
17)在PDBC以1:20稀释接种物储备，在20ml中稀释1ml，或计算所需的稀释度，以制备2000CFU/ml的最终浓度。每个孔中的量应为100CFU。
活性实验的微孔板制备：
1)从冰箱中取出在DMSO中的纯化的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并将其在工作台上解冻。
2)取1ul的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并用39ul水稀释至250ppm。
3)使用多移液管将10ul的已稀释的(250ppm)松属素二氢查耳酮溶液取入至微孔板的孔中。
4)使用多移液管向微孔板的孔中添加40ul充分混合的孢子悬浮液接种物。
5)用透明密封剂密封板。
6)以2000RPM震荡板10分钟，使材料与松属素二氢查耳酮与菌丝悬浮液混合。
7)将所有板在1000RCF下离心1秒，并停止收集板底部的液体。
8)将微孔板放在工作台上，直到其被读板器读取。
9)使用读板器读取板。
10)收集工作台上的板。
11)将已收集的板插入至带布盖的塑料盒中，并将盒子放入27℃的培养箱中。
板的筛选：
1)筛选3个以上日期的板：测定开始后的第3天、第7天、第14天和第21天。
2)计算每个筛选与零点读数之间的吸光度差异。
3)计算每个时间点每个孔的生长抑制百分比。使用对照板的DMSO处理结果作为100％生长。
4)结果：请参见实例7。
实例3基于微孔板的松属素二氢查耳酮对瓜果腐霉菌生物活性的测定
将稀释后的已纯化的松属素二氢查耳酮添加至微孔板孔中，并与PDBC悬浮液中的50ul的游动孢子混合，并且通过读板器和目视观察监测真菌从游动孢子开始的生长。
使用了以下材料、方法和设备：
SCH,PDBC(来自BD公司,新泽西州,美国)、PDBC(BD公司,新泽西州,美国)、DMSO(来自J.T.Baker,隶属于美国飞世尔科技公司)
读板器、离心机、振荡器、培养箱
腐霉属菌丝接种物的制备：
1)将瓜果腐霉菌在90mm培养皿中的SCH上生长，以得到产孢菌丝。每个板将产生50ml的游动孢子悬浮液，这将产生10个96孔板。
2)将60ml的无菌H
3)用手术刀将2个板的固体培养基切割成12块(每个板)，并将其插入至锥形瓶(固体块应被水覆盖)中。
4)让菌丝在17℃下形成孢子过夜。
5)用手振荡锥形瓶以悬浮游动孢子。
6)用16层纱布将悬浮液过滤至50ml的管中。
7)将悬浮液转移至500ml无菌瓶中。
8)丢弃固体并用次氯酸盐消毒锥形瓶。
9)在冰上冷却游动孢子悬浮液。
10)评估悬浮液中的游动孢子浓度(浓度应在1000孢子/ml至4000孢子/ml的范围内)。
11)如有需要，用无菌冰箱冷却的蒸馏H
12)添加相同体积(作为悬浮液)的无菌冰箱冷却的2倍浓缩PDBC，以得到500孢子/ml至2000孢子/ml接种物。此稀释将导致每个孔中有25-100个游动孢子。
13)将游动孢子悬浮液接种物放在冰上。
活性实验的微孔板制备：
1)从冰箱中取出在DMSO中的纯化的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并将其在工作台上解冻。
2)取1ul的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并用39ul水稀释至250ppm。
3)使用多移液管将10ul的已稀释的(250ppm)松属素二氢查耳酮溶液取入至微孔板的孔中。
4)使用多移液管向微孔板的孔中添加40ul充分混合的孢子悬浮液接种物。
5)用透明密封剂密封板。
6)以2000RPM震荡板10分钟，使材料与松属素二氢查耳酮与菌丝悬浮液混合。
7)将所有板在1000RCF下离心1秒，并停止收集板底部的液体。
8)将微孔板保持在工作台上，直到其被读板器读取。
9)使用读板器读取板。
10)收集工作台上的板。
11)将已收集的板插入带布盖的塑料盒中，并将盒子置于27℃的培养箱中。
板的筛选：
1)读出3个以上日期的板：测定开始后的第3天、第7天、第14天和第21天。
2)计算每次读出与零点读出之间的吸光度差异。
3)计算每个时间点每个孔的生长抑制百分比。使用对照板的DMSO处理结果作为100％生长。
实例4基于微孔板的松属素二氢查耳酮对核盘菌生物活性的测定
将稀释后的已纯化的松属素二氢查耳酮添加至微孔板孔中，并与50ul菌丝悬浮液混合，从共混的菌丝开始，通过目视观察监测真菌的生长。
核盘菌是属于子囊菌的真菌，并且是一种通过土壤传播的病原体。核盘菌很难产生大量的孢子，这导致在此筛选中决定使用菌丝而不是孢子进行接种。
使用了以下材料、方法和设备：
PDBC(PDB来自BD公司,新泽西州,美国；氯霉素来自阿法埃莎公司(AlfaAesar),隶属于赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))、PDA(来自BD公司,新泽西州,美国)、PDAT(PDA来自BD公司,新泽西州,美国；四环素来自阿法埃莎公司,隶属于赛默飞世尔科技公司)、PDBT(PDB来自BD公司,新泽西州,美国；四环素来自阿法埃莎公司,隶属于赛默飞世尔科技公司)，DMSO(来自J.T.Baker,隶属于美国飞世尔科技公司)
方法：
核盘菌菌丝接种物的制备：
1)培养温度为21℃的管中，在PDA上生长核盘菌4天。
2)转移琼脂块，并在21℃的90mm培养皿中，在PDAT种植菌核病菌，3天内长出菌丝。
3)将50ml的PDBT培养基添加至250ml无菌方形烧瓶中。
4)用手术刀将固体培养基切割成15个非常小的块(1X 5mm)，并将其插入方形烧瓶中。
5)使用振荡器在21℃和130RPM的温度下生长2天。
6)丢弃液体，并且将菌丝倒在空培养皿上。
7)使用手术刀从菌丝上切割许多小块(避免使用琼脂块)，并将它们插入至含有50ml的PDBT培养基的250ml的无菌方形烧瓶中。
8)在21℃条件下培养2天，以130RPM振荡，以得到快速生长的分散菌丝。
9)将培养物在冰箱中冷藏1小时。
10)将冷却的培养物倒入50ml管中。
11)把混合物放在冰上。
12)在冰上，将约5ml共混混合物转移至15ml的管中。
13)将15ml管中的培养物在冰上匀质化2分钟。
14)如上所述，匀质化若干批5ml以制备所需的量(5ml的匀质化的培养物将制得约50ml接种物)。
15)将匀质化的一部分稀释10倍，以检查匀质化的浓度，悬浮液的浓度应为2X10
16)在20ml的2mlPDBC以1:10稀释接种物储备，或计算所需的稀释度，以制备2000CFU/ml的最终浓度。每个孔中菌丝的最终数量应为100CFU。
活性实验的微孔板制备：
1)从冰箱中取出在DMSO中的纯化的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并将其在工作台上解冻。
2)取1ul的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并用39ul水稀释至250ppm。
3)使用多移液管将10ul的已稀释的(250ppm)松属素二氢查耳酮溶液取入至微孔板的孔中。
4)使用多移液管向微孔板的孔中添加40ul充分混合的孢子悬浮液接种物。
5)用透明密封剂密封板。
6)以2000RPM震荡板10分钟，使材料与松属素二氢查耳酮与菌丝悬浮液混合。
7)将板在1000RCF下离心1秒，并停止收集板底部的液体。
8)收集工作台上的板，直至所有微孔板准备好培养。
9)将微孔板插入至塑料盒中，并将该盒放入21℃的培养箱中。
板的筛选：
1)筛选5个日期的筛选板：接种后第4天、第7天、第14天和第21天。
2)使用灯进行目测评估化合物对真菌生长随时间推移的影响。
3)移除筛选板的盖后，如果盖上有液体(从内部)，用60℃的加热块将液体蒸发。
4)将每个孔的菌丝生长与对照板孔(含有活性杀真菌剂或0.5％DMSO溶液的孔)的菌丝生长进行比较。
5)将结果写在特殊的表格上：透明孔＝3(无菌丝生长)，正常菌丝结构＝1(正常生长)，不确定＝2(非预期类型的固体结构，或部分覆盖该区域)。
6)结果：请参见实例7。
实例5基于微孔板的松属素二氢查耳酮对丁香假单胞菌生物活性的测定
将稀释后的已纯化的松属素二氢查耳酮添加至微孔板孔中，并与100ul的冷冻细菌悬浮液混合，并通过目视观察监测细菌的生长。
假单胞菌是一种杆状革兰氏阴性细菌。60％甘油的冷冻细菌储备被用作筛选实验的接种物。
使用了以下材料、方法和设备：
假单胞菌悬浮液制备：
1)在28℃的LBA板上培养假单胞菌2天以得到单个菌落。
2)用无菌牙签将单个菌落转移至含有5ml LB的50ml无菌管中，并在28℃和150RPM下生长24小时。
3)将管在冰箱中冷藏1小时。
4)向管中添加7.5ml冰箱冷却的无菌甘油溶液，以得到60％甘油溶液。
5)缓慢并充分地混合均匀。
6)将60％甘油中的100ul细菌悬浮液等分至1.5ml管中。
7)将细菌悬浮液储存在-20℃的60％甘油中。
用于筛选的假单胞菌悬浮液制剂：
1)从冰箱中取出1.5ml的含有100ul冷冻假单胞菌悬浮液的管，并在冰上将其解冻。
2)在防护罩中准备装有40ml冰箱冷却的LB的50ml管。
3)将40ul细菌悬浮液与40ml冰箱冷却的LB混合在50ml管中。此量足以进行10个微孔板的活性筛选。
4)使用此悬浮液进行筛选实验。
活性实验的微孔板制备：
1)从冰箱中取出在DMSO中的纯化的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并将其在工作台上解冻。
2)取1ul的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并用39ul水稀释至250ppm。
3)使用多移液管将10ul的已稀释的(250ppm)松属素二氢查耳酮溶液取入至微孔板的孔中。
4)使用多移液管向微孔板的孔中添加40ul充分混合的细菌悬浮液接种物。
5)用透明密封剂密封板。
6)以2000RPM振荡板10分钟，以使松属素二氢查耳酮与细菌悬浮液混合。
7)将所有板在1000RCF下离心1秒，并停止收集板底部的液体。
8)将板插入至带盖的塑料盒中，并将盒子放入28℃的培养箱中。
微孔板的筛选：
1)筛选5个日期的微孔板：接种后第3天、第5天、第7天、第14天和第21天。
2)使用灯来视觉观察评估细菌生长情况。
3)准备用于筛选的板：以2000RPM振荡板2分钟使细菌悬浮，然后以1000RCF离心板几秒钟。
4)移除微孔板的盖后，对微孔板进行筛选。
5)将每个孔的透明度与对照孔(含有对照杀菌剂或0.5％DMSO溶液的孔)的透明度进行比较。
将结果写在特殊的表格上：清澈＝3(没有细菌生长)，混浊＝1(正常细菌生长)，不确定＝2(与在0.5％DMSO溶液中生长相比，浊度非常低)。
6)结果：请参见实例7。
实例6基于微孔板的松属素二氢查耳酮对胡萝卜果胶杆菌生物活性的测定
将稀释后的已纯化的松属素二氢查耳酮添加至微孔板孔中，并与50ul的冷冻细菌悬浮液混合，并通过目视观察监测细菌的生长。
胡萝卜果胶杆菌，杆状革兰氏阴性细菌，是一种主要的植物病原体，并对许多农作物造成巨大损害。60％甘油中的冷冻细菌储备被用作筛选实验的接种物。
为了确定不同化合物对胡萝卜果胶杆菌存活和生长的影响。
果胶杆菌(Pectobacterium)悬浮液制备：
1)在28℃的LBA板上生长果胶杆菌2天以得到单个菌落。
2)用无菌牙签将单个菌落转移至含有5ml LB的50ml无菌管中，并在28℃，150RPM下生长24小时。
3)将管在冰箱中冷藏超过1小时。
4)向管中添加7.5ml冰箱冷却的无菌甘油溶液，以得到60％甘油溶液。
5)缓慢并充分地混合均匀。
6)将60％甘油中的100ul的细菌悬浮液等分至1.5ml管中-每个等分试样应产生足以筛选10个微孔板的量。
7)将细菌悬浮液储存在-20℃的60％甘油中。
用于筛选的果胶杆菌悬浮液制备：
1)从冰箱中取出1.5ml的含有100ul冷冻果胶杆菌悬浮液的管，并在冰上将其解冻。
2)在防护罩中准备装有用无菌水稀释8倍的40ml冰箱冷却的LB培养液的50ml管。
3)将8ul细菌悬浮液与40ml冰箱冷却的稀释LB培养液在50ml管中混合，以制得具有生长培养基的即用型果胶杆菌悬浮液。
4)在冰上保存。
5)使用此悬浮液进行筛选实验。
用于筛选实验的微孔板制备：
1)从冰箱中取出在DMSO中的纯化的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并将其在工作台上解冻。
2)取1ul的1％松属素二氢查耳酮储备溶液，并用39ul水稀释至250ppm。
3)使用多移液管将10ul的已稀释的(250ppm)松属素二氢查耳酮溶液取入至微孔板的孔中。
4)使用多移液管向微孔板的孔中添加40ul充分混合的细菌悬浮液接种物。
5)用透明密封剂冷冻密封板。
6)以2000RPM震荡板10分钟，使材料与细菌悬浮液混合。
7)将板在1000RCF下离心1秒，并停止收集板底部的液体。
8)将板插入至带盖的塑料盒中，并将盒子置于28℃的培养箱中。
微孔板的筛选：
1)筛选5个日期的微孔板：接种后第3天、第5天、第7天、第14天和第21天。
2)使用灯来视觉观察评估细菌生长情况。
3)准备用于筛选的板：以2000RPM振荡板2分钟使细菌悬浮，并且然后以1000RCF离心板1秒。
4)移除其盖后，对微孔板中的细菌生长进行目视评估。
5)将每个孔的透明度与对照孔(含有活性杀菌剂或0.5％DMSO溶液的孔)的透明度进行比较。
6)将结果写在特殊的表格上：透明＝3(没有细菌生长)，混浊＝1(正常细菌生长)，不确定＝2(与在0.5％DMSO溶液中生长相比，浊度非常低)。
7)结果：请参见实例7。
实例7基于实例1至实例6的方案的体外实验结果。
体外筛选基质
针对11种农业害虫(如下表中所指示的)对松属素二氢查耳酮进行筛选。生物活性值以％为单位，并且反映了根除目标害虫的潜力。
生物活性相对值计算规则(以最大值的百分比表示)
a.玉米锈病菌(Puccinia sorghi),马铃薯晚疫病菌-活性等级(1/2/3)X重复#/12(最大值3X4＝12)*100
b.丁香假单胞菌、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、瓜果腐霉菌-活性等级(1/2/3)X重复#X活性天数/252(最大值3X4X21＝252)*100
c.灰葡萄孢菌-活性等级(1/2/3)X重复#X活性天数/168(最大值3X4X14＝168)*100
d.胡萝卜果胶杆菌-活性等级(1/2/3)X重复#X活性天数/84(最大值3X4X7＝168)
总之，松属素二氢查耳酮是针对以下害虫的有效的农药：尖孢镰刀菌(第一阳性结果在下文原位结果章节中提供)、立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、核盘菌、胡萝卜果胶杆菌和丁香假单胞菌。
实例8用于原位验证的调配物制备
用于调配物3(碱基)的方法
将松属素二氢查耳酮溶解在水中至浓度为0.1％，并用25％Na
实例9原位验证松属素二氢查耳酮处理感染尖孢镰刀菌的黄瓜幼苗。
使用了以下材料、方法和设备：
1)使用可高压灭菌的塑料板。将塑料板切割成烧杯内部的精确尺寸。在塑料板中切割6个孔。
2)使用三个1000ul的吸头将塑料板固定在烧杯中液体介质表面上方5mm的高度处。
3)添加50ml蒸馏水。
4)添加0.5％的标准肥料。
5)用布和橡胶圈覆盖烧杯。
6)在121℃下高压灭菌30分钟。
7)让感染系统在防护罩中冷却，打开布盖子，并将3天大的3-4个黄瓜发芽幼苗放于支撑塑料板的3个孔中。
8)用布盖子覆盖烧杯。
9)将感染系统置于22℃的生长室中长达2天。
10)当幼苗5天大时，用病原体接种-将1ml的病原体接种物添加至生长培养基中。
11)将接种系统置于光照12小时、24℃状态的培养箱中长达21天。
12)约21天后，检查幼苗的死亡率(约100％的未处理的幼苗应该死亡)。记录死亡幼苗的数量。
黄瓜芽制备：
1)使用方形透明覆盖的塑料板[12X 12cm]。
2)制备2％水琼脂；将8g琼脂插入至500ml瓶中，并且添加400ml蒸馏水。
3)在121℃下高压灭菌30分钟。
4)在方形板中添加50ml的2％的水琼脂，并且将其覆盖。
5)让琼脂冷却下来。
6)在每个板中种植20颗黄瓜种子。
7)将板放置在27℃的培养箱中长达3天。
8)当幼苗3天大时，用发育良好的芽进行实验。在此阶段，约80％的芽应该具有长且分支的根。
9)将芽从琼脂中取出。根部上不能残留琼脂。
镰刀菌游动孢子悬浮液制备：
1)将镰刀菌的PDAT块置于PDAT板的中间，并且在25℃下生长8天。
2)将板在冰箱中冷藏～1小时。
3)用手术刀将带有菌丝和孢子的琼脂从一个板切割成8块，并将其插入50ml无菌管中。
4)向管中添加25ml冰箱冷却的无菌水。
5)在3000RPM下震荡1分钟。
6)在过程期间将孢子放在冰上。
7)将液体转移到新的50ml无菌管中-应该回收约25ml。
8)将孢子悬浮液通过16层纱布直接过滤到干净无菌的50ml管中，以除去菌丝。应该回收约20ml。
9)计算孢子浓度，并通过冷却的无菌水稀释，以得到2X10
10)用水稀释孢子悬浮液原液以得到接种孢子悬浮液-500孢子/ml或1000孢子/ml。
11)立即用于感染幼苗的根部——在50ml培养基中使用一毫升孢子悬浮液。
12)向培养基中添加已调配的松属素查耳酮，以得到所期望的浓度。
镰刀菌接种物制备：
1)制备镰刀菌游动孢子。
2)显微镜下计数，并计算游动孢子浓度。
3)通过冷却的无菌水稀释游动孢子悬浮液，使其达到所期望的浓度-500个游动孢子/ml。
4)立即用于感染植物。
感染21天后评估结果。每个处理含有3杯至4杯，每杯具有3株幼苗。通过目视观察分别评估每个盆，并计算处理的平均值(平均3杯至4杯)。
治疗：
在不同浓度(100ppm、200ppm和300ppm)下评估松属素二氢查耳酮，并如实例7所述进行调配。
原位验证实验的统计分析。
为了评估化合物在受感染植物中与对照植物(受感染但未处理)相比的效果，通过学生的t测试分析数据并计算p值。每个实验的最小重复次数是3次。如果p＜0.05，则认为结果有意义。
结果：我们在生长室的受控环境下进行了3个独立的实验，其中我们评估了松属素二氢查耳酮(PDC)在黄瓜幼苗中预防和控制尖孢镰刀菌的潜力(图1至图3)。PDC表现非常好，并且在所有进行的实验中显示出非常好的功效。在感染后3周，松属素二氢查耳酮在预防和控制镰刀菌疾病中的效力范围在100ppm和200ppm时为66％至100％，并且在300ppm时为88％至100％。
实例11至15另外的原位实验。
进行这些实验是为了对松属素二氢查耳酮对立枯丝核菌、丁香假单胞菌、胡萝卜果胶杆菌、瓜果腐霉菌和尖孢镰刀菌的农药活性进行评估。
实例11原位验证松属素二氢查耳酮处理感染立枯丝核菌的黄瓜幼苗
程序：
接种系统制备：
1)使用可高压灭菌的塑料板。将塑料板切割成烧杯内部的精确尺寸。在塑料板中切割6个孔。
2)使用三个1000ul的吸头将塑料板固定在烧杯中50ml表面以上5mm的高度处。
3)添加50ml蒸馏水。
4)添加0.5％的标准肥料(250ul)。
5)用布和橡胶圈覆盖烧杯。
6)在(121℃)下高压灭菌30分钟。
7)让感染系统在防护罩中冷却，打开布盖子，并将3个2天大的发芽黄瓜幼苗放置于支撑塑料板的3个孔中。
8)用布盖子覆盖烧杯。
9)将感染系统置于27℃的生长室中长达1天。
10)当幼苗生长到第4天时，接种有立枯丝核菌。
11)接种：接种2ml，将培养基充分混合，直至菌丝附着在根部。
12)始终以100RPM振荡杯。
13)对于接种-使用在用水稀释至最终浓度按重量1％的液体培养基上生长10天的丝核菌。向培养基中添加松属素二氢查耳酮至所需的浓度。
14)对于对照组，使用2ml水。
15)将接种系统置于生长室中的振荡器(100RPM)上，光照12小时，在27℃下培养长达7天。
16)7天后，记录死亡幼苗的数量，并计算存活率，并与对照组进行比较。
黄瓜芽制备：
1)使用方形透明覆盖的塑料板[12X12cm]。
2)制备1％水琼脂；将4g琼脂插入至500ml瓶中，并且添加400ml蒸馏水。
3)在(121℃)下高压灭菌30分钟。
4)在方形板中添加50ml的1％的水琼脂，并且将其覆盖。
5)让琼脂冷却。
6)将板的一侧标记为底部。
7)在每平板中插入20个黄瓜种子；将种子排成3行，将其按压进入固体中，其中其锋利的一侧指向底部标记。
8)将板放置在27℃的培养箱中长达2天。
9)幼苗2天大时，用发育良好的芽进行实验。在此阶段，约90％的芽应该具有长且分支的根。
10)将芽从琼脂上取出将其进行切割。根部上不能残留琼脂。
立枯丝核菌接种物制备：
1)将丝核菌在液体培养基上生长10天。
2)收集菌丝，将其插入水中，并使用共混器减小菌丝尺寸。
3)用水稀释至最终浓度按重量1％来计。
4)立即使用以感染植物。
实例12松属素二氢查耳酮处理感染丁香假单胞菌的番茄幼苗原位验证
程序：
假单胞菌悬浮液制备：
1)准备含有5ml LB的50ml无菌试管。
2)从冰箱中插入50ul假单胞菌原液。
3)用盖子将管紧密盖住。
4)将试管置于150RPM的振荡器中，并在27℃生长16小时。
5)立即使用感染马铃薯切片。
6)在水中配制1:10稀释培养物的悬浮液。
1)使用30天的番茄幼苗。
2)将幼苗种植在小盆中。
3)一周后感染番茄幼苗叶片。
1)在接种前，将溶解在水中待测试的化学品按所需浓度，让其在化学护罩中等待干燥约3小时。用水作为对照处理。
1)以1ml假单胞菌悬浮液喷洒作用于每个番茄幼苗上(使用注射器喷洒工具)。
2)在25℃下的培养箱中，让细菌感染番茄幼苗。
3)番茄幼苗叶片应在接种后5天左右开始被感染。
4)用水喷洒对照组。
5)计算斑点数量以评估复合处理效果并与对照组进行比较。
实例13胡萝卜果胶杆菌感染马铃薯幼苗的原位验证
程序：
1)准备含有5ml LB的50ml无菌试管。
2)从冰箱中插入50ul的果胶杆菌原液。
3)用盖子将管紧密盖住。
4)将试管置于150RPM的振荡器中，并在27℃生长16小时。
5)立即使用感染马铃薯切片。
6)在水中配制1:10稀释培养物的悬浮液。
1)将两张无菌纸置于干净的吸头盒中。
2)在无菌条件下工作。
3)添加无菌蒸馏水湿润纸—20ml(纸应最大限度湿润，但不能具有另外的滴水)。
4)使用来自超市的小马铃薯块茎，在4℃至8℃下放在塑料袋中。
5)用无菌手术刀在马铃薯表面切割非常小一块。
6)把盒子里的4个小马铃薯放在湿纸上的盒子里。
7)用其盖子覆盖板。
1)在接种前，将溶解在水中待测试的化学品按所需浓度的，让其在化学护罩中等待干燥约3小时。用水作为对照处理。
1)在一个盒子中的4个马铃薯上喷洒1ml的果胶杆菌悬浮液(使用注射器喷洒工具)。
2)覆盖碟。
3)在25℃下的培养箱中，让细菌感染马铃薯。
4)马铃薯应该在约5天后被感染。它们应该会变软且发黑。
实例14松属素二氢查耳酮处理感染瓜果腐霉菌的黄瓜幼苗的原位验证
程序：
接种系统制备：
1)使用可高压灭菌的塑料板。将塑料板切割成烧杯内部的精确尺寸。在塑料板中切割6个孔。
2)使用三个1000ul的吸头将塑料板固定在烧杯中50ml表面以上5mm的高度处。
3)添加50ml蒸馏水。
4)向50ml的培养基中添加250ul标准肥料。
5)用布和橡胶圈覆盖烧杯。
6)在121℃下高压灭菌30分钟。
7)让感染系统在防护罩中冷却，打开布盖子，并将3个黄瓜发芽(3天大)幼苗放置于支撑塑料板的3个孔中。
8)用布覆盖烧杯。
9)将感染系统置于22℃的生长室中长达2天。
10)当幼苗5天大时，用病原体接种-将1ml腐霉属接种物添加至生长培养基中。向培养基中添加松属素二氢查耳酮至所需的浓度。
11)对于对照组，使用2ml水。
12)将接种系统置于27℃下的具有12小时光照/黑暗状态的培养箱中培养长达7天。
13)7天后记录死亡幼苗的数量，并与对照组比较存活率。
黄瓜芽制备：
1)使用方形透明覆盖的塑料板[12X12cm]
2)制备2％水琼脂；将8g琼脂插入至500ml瓶中，并且添加400ml蒸馏水
3)在121℃下高压灭菌30分钟
4)在方形板中添加50ml的2％的水琼脂，并且将其覆盖
5)让琼脂冷却
6)在每个板中种植20颗黄瓜种子
7)将板放置在27℃下的培养箱中长达3天
8)当幼苗3天大时，用发育良好的芽进行实验。在此阶段，约80％的芽应该具有长且分支的根
9)将芽从琼脂中取出。根部上不能残留琼脂
腐霉菌游动孢子悬浮液制备：
1)在90mm培养皿中的Schmittner固体培养基上培养腐霉以得到产孢菌丝。每个板在8天左右内将产生25ml游动孢子悬浮液
2)将60ml的无菌H
3)用手术刀将2个板的固体培养基切割成12块(每个板)，并将其插入至锥形瓶(固体块应被水覆盖)中
4)让菌丝在17℃下形成孢子过夜
5)第二天用手振荡锥形瓶使游动孢子悬浮
6)用16层纱布将悬浮液过滤至50ml的管中
7)在冰上冷藏游动孢子悬浮液。游动孢子浓度应为1000孢子/ml至4000孢子/ml
腐霉接种物制备：
1)制备腐霉游动孢子
2)显微镜下计数，并计算游动孢子浓度
3)通过冷却的无菌水稀释游动孢子悬浮液，使其达到所期望的浓度-500个游动孢子/ml。立即用于感染植物
实例15在GH(温室)条件下用松属素二氢查耳酮处理镰刀菌感染的黄瓜幼苗的原位验证
整体描述：镰刀菌单独繁殖，然后在正确的年龄，土壤中的黄瓜幼苗，放在托盘中，被病原体菌丝感染。在接种后约第7天、第14天和第21天进行疾病严重程度观察。在接种镰刀菌前约24小时，用松香草二氢查耳酮处理植物。在接种后约21天进行疾病严重程度的分析。
镰刀菌接种物制备：
1)将10ml藜麦种子放入至100ml瓶中。用50ml管测量体积
2)添加10ml无菌蒸馏水。
3)让种子在冰箱中吸收水分长达24小时。
4)24小时后，将一块分娩布置于瓶的顶部，并轻轻盖上顶部的蓝色盖子。
5)高压灭菌40分钟(在121℃下)[液体循环]
6)在防护罩中冷却，并且移除盖子。
7)接种一小块生长在PDAC板上的镰刀菌。
8)放回分娩布和盖子。
9)写下真菌名称和日期。
10)将固相生长瓶放入27℃下的培养箱中。
11)8天至10天后，镰刀菌即可好接种植物。
12)将镰刀菌菌丝均质化：
A.用250ml的烧杯和棒状共混器来制备共混物。
B.添加100ml水
C.添加1g的镰刀菌固相培养物，以得到1％的菌丝悬浮液。
D.在冰上高速匀浆2分钟。
E.用无菌水稀释匀浆后的菌丝悬液，以得到0.5％的菌丝悬浮液。
F.立即用稀释的均质菌丝悬浮液(0.5％)接种土壤系统中的幼苗。
1)使用来自苗圃的在幼苗托盘中的黄瓜幼苗。幼苗应该是6天大(播种日期后)，在第一片真叶生成之前或刚刚生成时。
2)将带有黄瓜幼苗的托盘在灌溉系统下放在温室台(温度20℃±27℃,没有光补充)中，来允许幼苗发芽，过量的水应该自由流出芋螺托盘
3)在播种后的第6天，应进行处理(已调配的松香草二氢查耳酮)。接种应在处理后24小时进行。用6ml制剂处理每株植物，并且类似地，接种后，幼苗体积应为6ml。预期处理和接种物均匀分布在根际。
4)在托盘上标记实验编号，并在实验页面上更新处理日期和接种日期
2)种植黄瓜第7天、第14天和第21天，在托盘下方灌溉，补充肥料(40ppm)。在第7天，将所有植物移入至100ml托盘中，以便进一步允许植物发育。
3)在第7天、第14天和第21天跟踪疾病发展。
4)幼苗的子叶应该变黄(疾病症状)，直到幼苗/植物干燥
5)统计病、以及死亡幼苗应在接种后第7天、第14天、第21天进行计数。
6)计算每次处理的干燥/死亡植物的百分比。
7)实验中将包括以下处理：已调配的松香草二氢查耳酮、工业参考产品、空白(水)
参考文献
ErlacherA.,Cardinale M.,Grosch R.,Grube M.,Berg G.“病原菌立枯丝核菌及其有益的对应解淀粉芽孢杆菌对本地生菜微生物群的影响(The impact of the pathogenRhizoctonia solani and its beneficial counterpart Bacillus amyloliquefacienson the indigenous lettuce microbiome)”,《前沿微生物群(Front Microbiol)》,2014；5:175。
Hofte M.and De Vos P.“植物病原假单胞菌物种(Plant pathogenicpseudomonas species)”,Gnanamanickam S.S.(编),《植物相关细菌(Plant-AssociatedBacteria)》,2006；507–533。
Jenkins J.E.E.,Clark Y.S.以及Buckle A.E.“谷物的镰刀菌病(Fusariumdiseases of cereals)”,研究综述4,1988年十月。
FrankN.Martin&Joyce E.Loper,“腐霉菌引起的土传植物病害：生态学、流行病学和生物控制的前景(Soilborne Plant Diseases Caused by Pythium spp.:Ecology,Epidemiology,and Prospects for Biological Control)”,《植物科学评论(CriticalReviews in Plant Sciences)》,1999；18:111-181。
Dong Hwan Lee,Jeong-A Lim,Juneok Lee,Eunjung Roh,Kyusuk Jung,MinseonChoi,Changsik Oh,Sangryeol Ryu,Jongchul Yun,Sunggi Heu,“胡萝卜果胶杆菌亚种致病性所需基因的特征,大白菜中的胡萝卜Pcc21(Characterization of genes requiredfor the pathogenicity of Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum Pcc21in Chinese cabbage)”，《微生物学(Microbiology.)》,2013年7月；159(第七部分)：1487–1496。
Moore.L.W.丁香假单胞菌：疾病和冰核活动。《观赏植物西北通讯(OrnamentalsNorthwest Newsletter)》,(1988)12:4-16。